實(shí)驗(yàn)9細(xì)菌的代謝產(chǎn)物

實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、掌握細(xì)菌糖發(fā)酵試驗(yàn)、IMViC試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、尿素分解試驗(yàn)的原理、結(jié)果判斷及醫(yī)學(xué)意義；2、熟悉上述試驗(yàn)的操作方法。第一頁，共31頁。[材料]1、菌種：大腸桿菌、傷寒沙門菌、痢疾桿菌、變形桿菌培養(yǎng)物；金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、檸檬色葡萄球菌培養(yǎng)物；銅綠假單胞菌培養(yǎng)物；2、培養(yǎng)基：SS平板、EMB、克氏雙糖培養(yǎng)基、生化反應(yīng)管、普通瓊脂平板、血平板；其他：接種環(huán)、接種針、酒精燈、培養(yǎng)箱等。第二頁，共31頁。標(biāo)本膿血便、肛拭子選擇/鑒別培基生化反應(yīng)血清學(xué)鑒定克氏雙糖鐵培養(yǎng)基,動力-靛基質(zhì)-尿素半固體瓊脂培養(yǎng)基玻片凝集試驗(yàn)SS平板,

EMB平板第三頁，共31頁。（一）SS瓊脂平板（1）營養(yǎng)物質(zhì)：牛肉膏、蛋白胨（2）抑制劑：膽鹽、枸椽酸鹽、煌綠等，抑制非致病菌的生長；但膽鹽能同時促進(jìn)病原菌的生長。（3）鑒別用糖：乳糖（4）指示劑：中性紅（5）原理：腸道桿菌均能分解葡萄糖產(chǎn)酸，但大多數(shù)非致病菌又能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，而致病菌不分解乳糖。據(jù)此，在培養(yǎng)基中加入乳糖和指示劑，制成鑒別培養(yǎng)基。中性紅為指示劑，酸性時呈現(xiàn)紅色，堿性時呈淡黃色。

一、分離培養(yǎng)第四頁，共31頁。大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸，通過中性紅顯色，菌落大而混濁，呈現(xiàn)紅色．志賀氏菌屬和沙門氏菌屬的細(xì)菌不分解乳糖，而分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生堿性物質(zhì)，菌落形態(tài)為光滑微黃透明，園形、中等大小，邊緣整齊的菌落。由于宋內(nèi)氏痢疾桿菌有分解膽鹽中的某些物質(zhì)和發(fā)酵乳糖(產(chǎn)酸)較慢等特點(diǎn)，而使菌落呈淡紅或紅色的較大或邊緣不整齊的扁平菌落。某些沙門氏菌屬及變形桿菌因產(chǎn)生硫化氫，使菌落呈現(xiàn)黑色中心。第五頁，共31頁。SS或EMB培養(yǎng)基生長現(xiàn)象觀察大腸桿菌傷寒桿菌痢疾桿菌變形桿菌SS菌落的形態(tài)特征EMB菌落的形態(tài)特征第六頁，共31頁。組成：無糖培養(yǎng)基＋乳糖＋伊紅＋美藍(lán)底物指示劑、抑菌劑原理：細(xì)菌乳糖產(chǎn)酸：伊紅＋美藍(lán)紫黑/紫紅結(jié)果：分解乳糖細(xì)菌菌落變黑，有金屬光澤不分解乳糖細(xì)菌菌落無色、半透明（粉色）分解（二）伊紅美蘭（ＥＭＢ）選擇培養(yǎng)基第七頁，共31頁。實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容：一、糖發(fā)酵試驗(yàn)二、

IMViC試驗(yàn)（

I:吲哚（indol）試驗(yàn)，M:甲基紅（methylred）試驗(yàn)，V:V.（Voges-Proskauer）試驗(yàn)；C:檸檬酸（citrateutilization）實(shí)驗(yàn)(枸櫞酸鹽)，i是為個好讀加上去的.）三、硫化氫試驗(yàn)四、尿素分解試驗(yàn)五、細(xì)菌的色素產(chǎn)生六、其他第八頁，共31頁。二、生化反應(yīng)對糖的分解對蛋白質(zhì)的分解枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C）尿素酶試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)（M）吲哚試驗(yàn)（I）硫化氫試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)VP試驗(yàn)（V）其他試驗(yàn)第九頁，共31頁。（一）單糖發(fā)酵試驗(yàn)原理：細(xì)菌具有多種酶系統(tǒng)能分解糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣。不同的細(xì)菌對各種糖類的分解不同，因而可以利用糖發(fā)酵進(jìn)行各種細(xì)菌(特別是腸道細(xì)菌)的鑒別。大腸桿菌能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸；分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；痢疾桿菌、沙門氏菌、變形桿菌則不能乳糖（乳糖除宋內(nèi)氏遲產(chǎn)酸外均不產(chǎn)酸產(chǎn)氣）；分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣(僅福氏6型可產(chǎn)少量氣)

二、生化反應(yīng)第十頁，共31頁。葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)

中性紅指標(biāo)劑顯色范圍：中性環(huán)境：紅色酸性環(huán)境：黃色葡萄糖

HCOOH脫氫酶

CO2+H2

如大腸桿菌、變形桿菌產(chǎn)酸產(chǎn)氣痢疾桿菌、傷寒沙門菌缺少此酶，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。溴甲酚紫指標(biāo)劑顯色范圍：中性環(huán)境：紫色酸性環(huán)境：黃色第十一頁，共31頁。乳糖發(fā)酵試驗(yàn)

中性紅指標(biāo)劑顯色范圍：中性環(huán)境：紅色酸性環(huán)境：黃色大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；痢疾桿菌、傷寒沙門菌、變形桿菌不分解乳糖，不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。溴甲酚紫指標(biāo)劑顯色范圍：中性環(huán)境：紫色酸性環(huán)境：黃色第十二頁，共31頁。（二）IMViC試驗(yàn)原理：IMViC試驗(yàn)是一組用于腸桿菌科細(xì)菌鑒別的實(shí)驗(yàn)，由靛基質(zhì)試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、VP試驗(yàn)和枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)組成。靛基質(zhì)試驗(yàn)：大腸桿菌陽性；變形桿菌陽性；痢疾桿菌陰性、沙門菌陰性；甲基紅試驗(yàn)：四種腸道桿菌均為陽性；VP試驗(yàn)：除變形桿菌部分菌株陽性外，其余均為陰性；枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)：大腸桿菌和痢疾桿菌陰性，變形桿菌以陽性為主，傷寒沙門菌陰性，副傷寒沙門菌和其它沙門菌部分陽性。第十三頁，共31頁。（一）基本原理1.吲哚實(shí)驗(yàn)是用來檢測吲哚的產(chǎn)生。有些細(xì)菌能產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。吲哚與對二甲氨基苯甲醛結(jié)合，形成紅色的玫瑰吲哚。但并非所有微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，因此吲哚實(shí)驗(yàn)可以作為一個生物化學(xué)檢測的指標(biāo)。第十四頁，共31頁。2.甲基紅實(shí)驗(yàn)是用來檢測葡萄糖產(chǎn)生的有機(jī)酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。當(dāng)細(xì)菌代謝糖產(chǎn)生酸時，培養(yǎng)基就會變酸，使加入培養(yǎng)基的甲基紅指示劑由橘黃色（pH6.3）變?yōu)榧t色（pH4.2），即甲基紅反應(yīng)。第十五頁，共31頁。3.伏-普實(shí)驗(yàn)是用來測定某些細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力，如丙酮酸進(jìn)行縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰。二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物，即伏-普反應(yīng)陽性；不產(chǎn)生紅色化合物者為陰性反應(yīng)。第十六頁，共31頁。4.檸檬酸鹽試驗(yàn)是用來檢測細(xì)菌利用檸檬酸的能力。有些細(xì)菌能分解檸檬酸形成CO2，由于培養(yǎng)基中鈉離子的存在而形成碳酸鈉，使pH升高，培養(yǎng)基顏色變化。第十七頁，共31頁。靛基質(zhì)試驗(yàn)陽性陰性對照甲基紅試驗(yàn)甲基紅指示劑PH低于4.5，呈紅色甲基紅指示劑PH高于5.4，呈黃色大腸桿菌、變形桿菌陽性；痢疾桿菌、沙門菌陰性；四種腸道桿菌VP均為陽性第十八頁，共31頁。VP試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)組溴麝香草酚藍(lán)指示劑酸性呈綠色堿性呈藍(lán)色；利用枸櫞酸鹽生成碳酸鹽培養(yǎng)基呈堿性反應(yīng)四種腸道桿菌VP均為陰性第十九頁，共31頁。（三）硫化氫試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中硫氨基酸（如胱胺酸）產(chǎn)生疏化氫、硫化氫與硅酸亞鐵中的亞鐵離子結(jié)合形成黑色的硫化鐵，變形桿菌，傷寒桿菌能產(chǎn)生硫化氫，生成黑色沉淀物；大腸桿菌、痢疾桿菌不產(chǎn)生硫化氫；硫化氫試驗(yàn)陰性。第二十頁，共31頁。（四）尿素試驗(yàn)原理：變形桿菌含有尿素酶，經(jīng)2—4小時培養(yǎng)能分解培養(yǎng)基中較多量尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基PH變?yōu)辂|性，而呈現(xiàn)紅色。即陽性反應(yīng)，陽性反應(yīng)可棄之。

痢疾桿菌屬及沙門氏菌屬之細(xì)菌不能分解尿素而不呈現(xiàn)堿性反應(yīng)即陰性反應(yīng)，陰性反應(yīng)需繼續(xù)作生化反應(yīng)及血清學(xué)試驗(yàn)。第二十一頁，共31頁。（五）克氏雙糖鐵斜面培養(yǎng)基反應(yīng)試驗(yàn)組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋1份葡萄糖＋10份乳糖＋鐵鹽＋酚紅營養(yǎng)底物底物底物指示劑(酚紅指示劑:酸性時黃色,堿性時紅色)原理：(1)只分解葡萄糖產(chǎn)酸（葡萄糖少，產(chǎn)酸量少）(2)分解葡萄糖＋乳糖產(chǎn)酸（乳糖多，產(chǎn)酸多）上下層均為黃色(3)產(chǎn)生H2S＋鐵鹽FeS培養(yǎng)基成黑色上層氧化呈紅色下層缺氧不氧化呈黃色第二十二頁，共31頁。克氏雙糖鐵斜面培養(yǎng)基分解葡萄糖和乳糖只分解葡萄糖分解葡萄糖產(chǎn)生硫化氫對照管第二十三頁，共31頁。（六）動力試驗(yàn)動力試驗(yàn)：分別取四種腸道桿菌的培養(yǎng)物，用穿刺接種方法接種于4支半固體培養(yǎng)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18-24h以后觀察結(jié)果。第二十四頁，共31頁。SS或EMB培養(yǎng)基生長現(xiàn)象觀察大腸桿菌傷寒桿菌痢疾桿菌變形桿菌SS菌落的形態(tài)特征EMB菌落的形態(tài)特征[結(jié)果]第二十五頁，共31頁。[結(jié)果]大腸桿菌傷寒桿菌痢疾桿菌變形桿菌克氏雙糖鐵培養(yǎng)基葡萄糖乳糖硫化氫動力尿素H2S生化反應(yīng)管葡萄糖乳糖第二十六頁，共31頁。結(jié)果觀察大腸桿菌傷寒桿菌痢疾桿菌變形桿菌克氏雙糖鐵葡萄糖乳糖硫化氫動力尿素H2S生化反應(yīng)管葡萄糖乳糖+---++++-++-+---+--++++-+-黑色--黑色++++第二十七頁