分子生物學(xué)常用檢測技術(shù)

分子生物學(xué)常用檢測技術(shù)第1頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四第2頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四DNA—四種核苷酸（A-T-C-G)組成的多聚骨架所有組成DNA的核苷酸dATP,dTTP,dCTP,dGTP都由三種成分組成：1）一個(gè)2’-脫氧核糖（戊糖）2）一個(gè)含氮堿基嘌呤：A\G嘧啶：T/C3）三個(gè)磷酸基團(tuán)各單個(gè)核苷酸由5’和3’-碳形成的磷酸二酯鍵連接在一起第3頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四變性、復(fù)性、退火和淬火第4頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四基因第5頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四分子生物學(xué)常用技術(shù)

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）核酸分子雜交基因芯片技術(shù)(biochip)DNA測序（DNAsequencing）DNA重組技術(shù)(DNArecombination)第6頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四

一、聚合酶鏈反應(yīng)

（PolymeraseChainReaction，PCR）體外基因擴(kuò)增技術(shù)

特異性強(qiáng)靈敏度高操作簡單、省時(shí)對(duì)待檢原始材料質(zhì)量要求低高效率的基因擴(kuò)增技術(shù)第7頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四（一）PCR原理原理雙鏈DNA變性

退火鏈延伸

（膜板）

（雙鏈分成單鏈）

（膜板與引物雜交）

（DNA合成）不斷重復(fù)第8頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四PCR反應(yīng)體系Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaq

DNA聚合酶模板引物

和或和（二）PCR反應(yīng)的設(shè)計(jì)及影響因素第9頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四PCR的種類熒光定量PCR通用引物PCR多重PCR巢式PCRRT-PCR原位PCR免疫PCR……第10頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四TaqMan探針reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.PolymerisationprobeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.StranddisplacementQ3'3'5'5'3'5'5'3.CleavageR3'5'5'3'5'5'4.PolymerisationcompletedQRR=ReporterQ=Quencher3'熒光定量PCR第11頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四定量PCR的數(shù)學(xué)原理PCR理論方程N(yùn)=N0x(1+E)nN：擴(kuò)增數(shù)量N0：起始模板數(shù)量E：擴(kuò)增效率N：循環(huán)數(shù)

Log[DNA]循環(huán)數(shù)線性增長期Linear平臺(tái)期Plateauy=

N0(1+e)n指數(shù)增長期Geometric第12頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四定量PCR的數(shù)學(xué)原理Rn(熒光強(qiáng)度)循環(huán)數(shù)CycleNumber指數(shù)增長期平臺(tái)期CT=-klogN0+bCt

（Cyclethreshold）值：是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值（threshold）時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。第13頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四PCR的臨床應(yīng)用對(duì)病原微生物核酸進(jìn)行快速檢測彌補(bǔ)免疫檢測的缺陷縮短診斷的窗口期（如HBV,HIV）用于藥物療效監(jiān)測和評(píng)估用于腫瘤基因表達(dá)方面的研究用于遺傳病的診斷第14頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四項(xiàng)目標(biāo)本采集HBV無菌注射器抽取2毫升靜脈血或其它體液注入無菌試管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或體液標(biāo)本。2.也可取抗凝血標(biāo)本,但一般不推薦。CMV1.尿液：中段晨尿20ml于加蓋試管。其他體液標(biāo)本或咽拭子。也可取抗凝血標(biāo)本,但一般不推薦。TB1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于無菌加蓋試管。2.其他組織標(biāo)本：留于無菌試管。3.也可取抗凝血標(biāo)本,但一般不推薦。MP呼吸道病毒

咽拭子樣本采集要求第15頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四項(xiàng)目標(biāo)本采集所需容器CT男性：尿道分泌物：細(xì)小棉拭子伸入尿道約2～4厘米，旋轉(zhuǎn)數(shù)圈取出分泌物（應(yīng)略帶粘膜）。前列腺液、精液。女性：陰道分泌物：用無菌生理鹽水洗去宮頸外分泌物，再用無菌棉拭子插入宮頸內(nèi)，停5秒后旋動(dòng)棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上一次性無菌帶蓋的試管。NGUUTPHPVHSV第16頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四二、核酸分子雜交根據(jù)核酸變性和復(fù)性的原理，不同來源的變性單鏈核酸分子在合適的條件下，通過堿基互補(bǔ)形成雙鏈雜交體的過程稱為核酸分子雜交（molecularhybridization）。第17頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四1、遺傳病的診斷2、病原體的鑒定3、癌基因突變的檢測4、組織配型5、親子鑒定核酸分子雜交的臨床應(yīng)用第18頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四三、基因芯片技術(shù)基質(zhì)材料分，有尼龍膜、玻璃片、塑料、硅膠晶片、微型磁珠等。第19頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四

用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列原位合成法在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列第20頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四基因芯片技術(shù)的應(yīng)用1、藥物篩選和新藥開發(fā)2、疾病診斷3、環(huán)境保護(hù)4、司法5、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)第21頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四四、測序技術(shù)CTTGATCTTCAGGTAGGCCTGAATCCT（一）一代測序技術(shù)第22頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四（二）二代測序技術(shù)Illumina公司的Solexa和Hiseq應(yīng)該說是目前全球使用量最大的第二代測序機(jī)器，這兩個(gè)系列的技術(shù)核心原理是相同的。Illumina/SolexaGenomeAnalyzer測序的基本原理是邊合成邊測序。在Sanger等測序方法的基礎(chǔ)上，通過技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲得待測DNA的序列信息。第23頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四第24頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四技術(shù)特點(diǎn)比較第一代測序技術(shù)的主要特點(diǎn)是測序讀長可達(dá)1000bp，準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%，但其測序成本高，通量低等方面的缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用。第二代測序技術(shù)大大降低了測序成本的同時(shí)，還大幅提高了測序速度，并且保持了高準(zhǔn)確性，但在序列讀長方面比起第一代測序技術(shù)則要短很多。第25頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四五、基因重組技術(shù)基因重組是指一個(gè)基因的DN