免疫組化技術(shù)

免疫組化技術(shù)第1頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

一、生物素-抗生物素免疫組織化學(xué)技術(shù)（一）基本原理雞蛋中含有一種堿性蛋白，屬于糖蛋白，也稱卵白素（avidin），分子量68000。卵白素具有4個(gè)與維生素H或稱生物素（biotin）親和力極高的結(jié)合位點(diǎn)。生物素是一種小分子維生素，分子量244，它與卵白素之間的親和力比抗原抗體之間的親和力高100萬倍，因而能彼此牢固締結(jié)和而不影響各自的生物活性。同時(shí)，生物素與卵白素都具有與其他標(biāo)記物如熒光素、鐵蛋白和過氧化酶等結(jié)合的能力。目前，已利用上述特性建立了卵白素-生物素免疫染色系統(tǒng)，為了便于理解，現(xiàn)在統(tǒng)稱卵白素為抗生物素或親和素，因此，卵白素-生物素免疫染色系統(tǒng)又稱為生物素-抗生物素免疫組織化學(xué)技術(shù)第2頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（1）石蠟切片脫蠟至水，用0.01mol/LPBS（pH=7.4）漂洗5min×3次；（2）滴加0.3%H2O2，37℃孵育10min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；（3）用0.01mol/LPBS漂洗5min×3次；（4）滴加10%正常血清/0.3%TritonX-100/0.01mol/LPBS，37℃孵育10min；（5）滴加抗小鼠單克隆抗體（一抗）37℃1h或4℃過夜，PBS漂洗5min×3次；（6）加生物素標(biāo)記二抗（效價(jià)1:200），室溫孵育10min，PBS漂洗5min×3次；（7）滴加鏈霉素抗生物素蛋白-HRP液，室溫孵育10min；PBS洗5min×3次；（8）滴加DAB，顯微鏡下顯色5~10min第3頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（二）ABC免疫組織化學(xué)技術(shù)

1981年，許世明等建立了抗生物素-生物素-過氧化物酶法（avidin-biotin-peroxidasecomplexmethod，簡(jiǎn)稱ABC法）。ABC是卵白素-生物素結(jié)合的HRP復(fù)合物的簡(jiǎn)稱。ABC復(fù)合物是先將HRP與生物素結(jié)合，然后按一定比例將此復(fù)合物與卵白素反應(yīng)，使每一個(gè)卵白素分子上結(jié)合3個(gè)帶HRP的生物素，留出一個(gè)能與其它生物素結(jié)合的空位。復(fù)合物上攜帶的HRP越多，則酶催化的組織化學(xué)反應(yīng)也越強(qiáng)烈，陽性結(jié)果也越明顯第4頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三第5頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三第6頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（三）SABC免疫組織化學(xué)技術(shù)鏈霉親和素是一種從鏈霉菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì)，分子量60000，含糖鏈。鏈霉親和素也有四個(gè)生物素親合位點(diǎn)，是一種更理想的抗生物素結(jié)合蛋白。SABC是鏈霉親和素-生物素-HRP復(fù)合物（strept-avidin-biotin-peroxidasecomplex）的簡(jiǎn)稱。SABC復(fù)合物先將HRP與生物素結(jié)合，然后按一定比例將此復(fù)合物與鏈霉親和素反應(yīng)，使每一個(gè)鏈霉親和素分子上結(jié)合3個(gè)帶HRP的生物素，留出一個(gè)尚未被生物素結(jié)合的空位，可以與各種生物素標(biāo)記的抗體結(jié)合。復(fù)合物上攜帶的HRP越多，則酶催化的組織化學(xué)反應(yīng)也越強(qiáng)烈，陽性結(jié)果也越明顯第7頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三第8頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三第9頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三SABC法是在一抗體反應(yīng)后，用已結(jié)合生物素的抗IgG抗體二抗橋接。然后用SABC孵育，使橋抗上的生物素與SABC中鏈霉親和素上的空位結(jié)合。最后仍用HRP的底物成色。在SABC法中，一抗是特異性的，二抗是生物素標(biāo)記的二抗，三抗是SABC復(fù)合物。SABC復(fù)合物與橋抗體之間是通過生物素結(jié)合的，因此SABC復(fù)合物沒有種屬特異性，可適用于任何種屬的一抗。當(dāng)然，生物素結(jié)合的二抗必須是針對(duì)一抗種屬的。因此，SABC法較PAP法操作更簡(jiǎn)單、更靈敏。目前，SABC試劑盒已經(jīng)商品化，可以根據(jù)需要購買。第10頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（四）PAP法與ABC法聯(lián)合（ABPAP）技術(shù)第11頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三ABPAP使特異性一抗結(jié)合更多的酶分子，原始信號(hào)得

到更大的放大效應(yīng)。（1）石蠟切片脫蠟至水（2）滴加0.3%H2O2，80%甲醇抑制內(nèi)源性過氧化物酶（3）用0.1胰蛋白酶室溫消化10min

（4）滴加二抗的正常血清1:10；；（5）滴加適當(dāng)稀釋的一抗；（6）加適當(dāng)稀釋的標(biāo)記二抗；第12頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三（7）滴加鼠PAP或兔PAP；（8）生物素化馬抗鼠或羊抗兔；（9）滴加ABC復(fù)合物；（10）滴加0.04%DAB+0.03%H2O2，（11）蒸餾水漂洗，蘇木精復(fù)染（必要時(shí)），脫水、透明、封片、觀察。評(píng)價(jià)

ABPAP法較單一PAP法和ABC法更為敏感，抗體稀釋度大大提高，尤其是對(duì)抗原性較弱、容易破壞或丟失的抗原，能得到較好的效果。但ABPAP法較單一PAP法和ABC法步驟增多、操作復(fù)雜，背景著色會(huì)相應(yīng)加深，而且容易脫片。第13頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

二、葡萄球菌蛋白A（SPA）免疫組織化學(xué)技術(shù)（一）SPA的生物學(xué)特性

1．生化特性

葡萄球菌蛋白A是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)，簡(jiǎn)稱蛋白A（SPA）。SPA存在于大部分（90%）金葡菌，并且主要存在于血漿凝固酶陽性的菌株。內(nèi)含3個(gè)高度相似的Fc段結(jié)合區(qū)，每區(qū)有50個(gè)以上的氨基酸組成，不含色氨酸和半胱氨酸。SPA的羧基末端是賴氨酸，氨基末端結(jié)構(gòu)尚未肯定，其黏度高于球蛋白，等電點(diǎn)PI=5.1，天然結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，在應(yīng)用6mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽變性劑條件下，尚能保存某些三級(jí)結(jié)構(gòu)，除去變性劑后，能自然矯正恢復(fù)原有結(jié)構(gòu)。第14頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

2．免疫學(xué)特性

SPA具有與人和許多動(dòng)物如豚鼠、豬、小鼠、猴等IgG結(jié)合的能力。SPA結(jié)合部位是Fc段而不是Fab段，結(jié)合后不影響抗體的活性。SPA具有雙價(jià)結(jié)合力，每分子SPA可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)IgG分子，也可一方面與IgG結(jié)合，同時(shí)與標(biāo)記物（如熒光素）結(jié)合。另外，與SPA結(jié)合后的IgG可用4mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽使其解離。

3．其他特性

SPA能引起豚鼠離體回腸的收縮，在吞噬反應(yīng)中抑制IgG調(diào)理素的吞噬和殺菌作用，SPA-IgG能固定人的補(bǔ)體和人、狗、豬的新鮮補(bǔ)體等第15頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（二）SPA在免疫組織化學(xué)中的應(yīng)用目前，SPA已廣泛應(yīng)用于免疫球蛋白的制備和分析、免疫組織化學(xué)標(biāo)記、多種病原體（細(xì)菌、病毒和支原體等）快速診斷，作為研究免疫復(fù)合物、膜抗原、膜受體和膜IgG的固相吸附劑。本節(jié)主要介紹SPA在免疫組織化學(xué)標(biāo)記中的應(yīng)用。SPA可被多種標(biāo)記物如熒光素、過氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等所標(biāo)記，應(yīng)用較廣的為酶標(biāo)SPA和金標(biāo)記SPA技術(shù)。標(biāo)記SPA常用的酶為HRP，SPA在PAP法中可以代替橋抗。第16頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

1．SPA-HRP間接法染色（1）石蠟切片脫蠟后用0.5%H2O2-純甲醇液處理20min，抑制內(nèi)源性過氧化物酶；（2）用Tris-HCl緩沖液洗滌3min×2次；（3）加一抗血清覆蓋切片，37℃孵育30min；（4）用Tris-HCl緩沖液洗滌5min×3次；（5）滴加適當(dāng)稀釋的SPA-HRP，室溫處理30min；（6）用Tris-HCl緩沖液洗滌5min×3次，DAB-H2O2室溫顯色，蒸餾水漂洗；（7）蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片，鏡下觀察反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色。第17頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

2．SPA用于PAP法染色（1）石蠟切片脫蠟后用0.3%H2O2-80%純甲醇液抑制內(nèi)源性過氧化物酶20min；（2）加10%卵白蛋白Tris緩沖液，室溫作用20min；（3）加一抗血清覆蓋切片，37℃孵育45min

（4）用Tris-HCl緩沖液洗滌5min；（5）滴加SPA室溫處理30min，緩沖液洗滌5min；（6）加PAP復(fù)合物孵育30min，緩沖液洗滌5min；（7）加DAB（0.6mg/ml）和0.01%H2O2室溫顯色5min，蒸餾水漂洗；（8）蘇木精復(fù)染1min，脫水、透明、封片，鏡下觀察反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色第18頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

三、凝集素免疫組織化學(xué)技術(shù)凝集素（lectin）是一種從植物、無脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，因能凝集紅細(xì)胞（含血型物質(zhì)）而得名。常用的有植物凝集素（phytoagglutin，PNA），通常以其來源植物命名，如刀豆素（conconvalina，ConA）、麥胚素（wheatgermagglutinin，WGA）、花生凝集素（peanutagglutinin，PNA）和大豆凝集素（soybeanagglutinin，SBA）等。凝集素不是來源或參與免疫反應(yīng)的產(chǎn)物，但具有某些“親合”特性，可被免疫組織化學(xué)所應(yīng)用，因此，凝集素免疫組織化學(xué)應(yīng)稱為凝集素組織化學(xué)第19頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（一）凝集素的生物學(xué)特性生物膜中含有一定的糖類，主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。凝集素能識(shí)別糖蛋白和糖肽，特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜的碳水化物結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞膜表面的碳水化物決定簇。一種凝集素具有對(duì)某種特異性糖基專一性結(jié)合的能力，如刀豆素與α-吡喃糖基甘露糖（α-D-mannopyranosyl）結(jié)合，麥胚素與N-乙酰糖胺（N-acetylglucosamine）結(jié)合。因此，凝集素可以作為探針，研究細(xì)胞膜上特定的糖基。另外，凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結(jié)合，從而在光鏡或電鏡水平顯示其結(jié)合部位第20頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（二）凝集素在免疫組織化學(xué)中的應(yīng)用由于凝集素的以上生物學(xué)特性，目前已廣泛應(yīng)用作為細(xì)胞分化和成熟的標(biāo)記、細(xì)胞特殊類型標(biāo)記和腫瘤細(xì)胞凝結(jié)素結(jié)合特性的研究。凝集素可以被多種標(biāo)記物如熒光素、過氧化物酶、生物素等所標(biāo)記，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1．直接法將標(biāo)記物質(zhì)直接標(biāo)記在凝集素上，使其直接與切片中的相應(yīng)糖蛋白或糖脂結(jié)合。本法簡(jiǎn)便、快速，但靈敏度不高。第21頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三將熒光、HRP或膠體金標(biāo)記的凝集素直接用于未處理組織，簡(jiǎn)單迅速但敏感性差。第22頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

2．間接法將生物素化的凝集素直接與切片中的相應(yīng)糖基結(jié)合，生物素同ABC復(fù)合物結(jié)合。本法簡(jiǎn)便、快速，而且靈敏度高。試劑盒已商品化，可以方便購買。（1）石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，加0.01%胰蛋白酶消化20min；（2）TBS洗滌5min×2次后，在10%BSA中浸育5min，以減少非特異性染色；（3）加與生物素結(jié)合的凝集素（10μg/ml），孵育60min，TBS洗滌5min×2次；（4）加ABC浸育60min，TBS洗滌5min×2次；（5）DAB顯色，流水洗滌，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。第23頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三將組織切片孵育于凝集素溶液，使之結(jié)合于切片上的糖鏈，清洗后加凝集素的特異性抗體。該抗體可用FITC、HRP或膠體金標(biāo)記；也可不標(biāo)記凝集素抗體，而將二抗標(biāo)記，或使用未標(biāo)記二抗，再用PAP復(fù)合物完成染色。第24頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三將凝集素用生物素標(biāo)記，然后加用標(biāo)記的抗生物素蛋白，或ABC復(fù)合物使之與生物素結(jié)合第25頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三3．糖-凝集素-糖法利用過量的凝集素與切片中特定的糖基結(jié)合，經(jīng)過沖洗后，凝集素上還存在未被占用的結(jié)合位點(diǎn)，將這些未結(jié)合的部位與經(jīng)過氧化物酶標(biāo)記的特異性糖基結(jié)合，形成一個(gè)三明治樣的糖-凝集素-糖復(fù)合物。本法特異性強(qiáng)、靈敏度高，既不像ABC法那樣要結(jié)合生物素，也不需要像PAP法那樣制備抗體。（1）石蠟切片脫蠟后用0.3%H2O2-純甲醇液處理20min，抑制內(nèi)源性過氧化物酶；（2）用凝集素室溫孵育30min，TBS洗滌3min×2次；（3）加10μg/mlHRP標(biāo)記的糖液，室溫孵育30min，TBS洗滌5min×2次；（4）DAB-H2O2顯色，蒸餾水漂洗，脫水、透明、封片。第26頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三將過量凝集素加于組織切片上（以保證凝集素的結(jié)合位點(diǎn)被組織上的糖基不完全占據(jù)）再加糖基化的標(biāo)記物（如巖藻糖基Fuc-HRP)，其中的糖基將結(jié)合于未被占據(jù)的凝集素結(jié)合位點(diǎn)，然后顯示標(biāo)記物。由于目前發(fā)現(xiàn)的糖基化的標(biāo)記物種類不多，故夾層發(fā)的使用有限。第27頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

第五節(jié)免疫金銀及鐵標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用膠體金作為標(biāo)記物的免疫金染色和免疫金銀染色方法，在光鏡和電鏡下可以進(jìn)行單標(biāo)記、雙重標(biāo)記或多重標(biāo)記，觀察組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，定性、定位和定量研究。第28頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

一、膠體金的基本概念

1．分散體系體系是一定空間范圍內(nèi)作為研究對(duì)象的物質(zhì)，某一種或幾種物質(zhì)分散到另一種物質(zhì)中所組成的體系稱為分散體系。被分散的物質(zhì)稱為分散相或分散質(zhì)，而另一種物質(zhì)稱為分散介質(zhì)。分散體系的某些性質(zhì)因分散相質(zhì)點(diǎn)的大小而改變，可分為三類：（1）離子分散體系：分散相以小分子或離子狀態(tài)分散，這種溶液具有高度穩(wěn)定性，無論放置多久，分散相顆粒都不會(huì)因重力而下沉，不會(huì)從容液中分散出來第29頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（2）膠體分散體系：分散相顆粒大小在1～10nm之間，膠體溶液外觀透明不渾濁，普通顯微鏡下看不見其分散相粒子，不易受重力影響與分散介質(zhì)分離而沉淀，但其中的溶膠粒子有聚結(jié)變大的傾向，即具有聚結(jié)不穩(wěn)定性。（3）粗分散體系：分散相顆粒由許多分子組成，因粒子較大，肉眼或顯微鏡即可看到，不穩(wěn)定，極易因重力作用而自動(dòng)沉降，外觀渾濁不透明。第30頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三2．膠體金的一般形狀膠體金也稱金溶膠，是指分散相粒子直徑在l～150nm之間的金溶膠，是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液，具有一般溶膠的特性。屬于多相不均勻體系，顏色呈桔紅色到紫紅色（顆粒越大，顏色越深）。膠體金可以作為標(biāo)記物用于免疫組織化學(xué)，近10多年來膠體金標(biāo)記已經(jīng)發(fā)展為一項(xiàng)重要的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金免疫分析在藥物檢測(cè)、生物醫(yī)學(xué)等許多領(lǐng)域的研究已經(jīng)得到發(fā)展，并越來越受到相關(guān)研究領(lǐng)域的重視第31頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三3.膠體金標(biāo)記蛋白溶液的pH等于或稍高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)呈中性，此時(shí)蛋白質(zhì)分子與膠體金顆粒之間的靜電作用較小，但蛋白質(zhì)分子的表面張力最大，處于一種微弱的水化狀態(tài)，易于吸附于金顆粒的表面。由于蛋白質(zhì)分子牢固地結(jié)合在金顆粒的表面，形成一個(gè)蛋白層，阻止了膠體金顆粒間的相互接觸，使膠體金溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)。為防止蛋白質(zhì)與膠體金的聚合與沉淀，常用牛血清白蛋白、卵蛋白、聚乙二醇或明膠做穩(wěn)定劑。第32頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

二、免疫金銀組織化學(xué)技術(shù)（一）免疫金染色

1．免疫金法免疫金法（IGS）染色程序簡(jiǎn)單，無需顯色就能檢測(cè)細(xì)胞表面的抗原，又能檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原。陽性部位顯紅色，一般要求膠體金顆粒直徑大于20nm，濃度較高。分為直接法（標(biāo)記一抗）和間接法。用IGS定位細(xì)胞抗原一般采用間接法。第33頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三第34頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（二）免疫金銀法免疫金銀法（IGSS）的基本原理是通過免疫反應(yīng)沉積在抗原位置的膠體金顆粒起著一種催化劑作用，用對(duì)苯二酚還原劑將銀離子（Ag+）還原成銀原子（Ago）。被還原的銀原子圍繞金顆粒形成一個(gè)“銀殼”，“銀殼”一旦形成本身也具有催化作用，從而使更多銀離子還原，促使“銀殼”越來越大，最終抗原位置清楚放大。

IGSS優(yōu)點(diǎn)：①用于光鏡和電鏡觀察；②敏感性高；③定位準(zhǔn)確；④方法簡(jiǎn)便、安全；⑤成本較低，標(biāo)本可長(zhǎng)期保存第35頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（三）彩色免疫金銀法（CIGSS）是在IGSS基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，基本原理與彩色顯影相似。IGSS方法在抗原位點(diǎn)處生成銀顆粒，經(jīng)鐵氰化鉀與溴化鉀的作用即被氧化成溴化銀，后者與彩色顯影劑接觸后即被還原成金屬銀，而彩色顯影劑本身則被氧化，其氧化產(chǎn)物使彩色呈色劑由無色變成有色染料，沉積在銀顆粒的部位，金屬銀變成了銀離子。由于染料只能通過彩色顯影劑沉積在有銀的部位，所以，不與組織發(fā)生非特異性吸附。第36頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三（四）免疫金銀組織化學(xué)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)1.膠體金制備簡(jiǎn)單2.標(biāo)記簡(jiǎn)單，抗體生物活性不受影響3.特異性強(qiáng)4.敏感性高5.定位準(zhǔn)確6.適應(yīng)性廣7.易于多重雙重標(biāo)記第37頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

三、免疫膠體鐵組織化學(xué)技術(shù)膠體鐵（ferriccolloid）是一種陽離子膠體，可以通過普魯士藍(lán)反應(yīng)呈色，其顆粒有一定的大小和電子密度，最初用于光鏡和電鏡下定位組織中的陰離子部位，后來用于標(biāo)記抗體分子，應(yīng)用于免疫組織化學(xué)技術(shù)。本法特異性強(qiáng)、敏感性高、背景清晰。目前常用水合聯(lián)胺-二甲砷酸-FeCl3煮沸法制備微細(xì)顆粒的膠體鐵，該方法制備的膠體鐵呈棕紅色，顆粒大小1nm左右。光鏡下，陽性部位呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈紅色第38頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

第六節(jié)免疫組化雙標(biāo)技術(shù)

應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法在同一張組織、細(xì)胞片上，同時(shí)或先后顯示兩種或兩種以上的抗原成分，稱為免疫雙重或多重標(biāo)記技術(shù)。光鏡下可通過標(biāo)記物或其反應(yīng)生成物的顏色來標(biāo)記不同的抗原成分，電鏡下則可通過標(biāo)記物顆粒的大小來表示不同的抗原成分。本章主要介紹光鏡免疫雙重或多重標(biāo)記技術(shù)。

一、基本原理和方法目前已建立了許多方法，根據(jù)其作用方式和原理的不同，可以分為洗脫法和非洗脫法兩大類。第39頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（一）洗脫法

一般用于光鏡下間接法所做的雙標(biāo)?；驹硎窃诘谝环N染色完成后，用酸性溶液洗脫這種染色在切片上形成的抗原抗體復(fù)合物，從而避免與下一種抗體系統(tǒng)發(fā)生交叉反應(yīng)。按洗脫效果，可以分為以下兩種情況。

1．洗脫第一種染色中的抗原抗體復(fù)合物，但保留顯色反應(yīng)的生成物，然后做下一種染色，并采用不同顏色的反應(yīng)生成物來標(biāo)示第二種抗原。這樣，兩種顏色可同時(shí)并存于同一組織片上顯示兩種抗原。

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2．洗脫第一種染色中的抗原抗體復(fù)合物及顯色反應(yīng)生成物，再做下一種染色。這時(shí)第二種染色實(shí)際上是在回復(fù)為空白的組織片上重新進(jìn)行，并用不同顏色的反應(yīng)生成物與前一種結(jié)果相區(qū)別。這種方法得到的兩種染色陽性結(jié)果是先后而不是同時(shí)并存在同一組織片上。要比較和了解它們之間的關(guān)系，必須在完成第一種染色后先拍照，然后在第二種染色后找到同一區(qū)域再次拍照，比較兩次照片的結(jié)果。

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（二）非洗脫法在染色過程中，不用洗脫第一種染色的抗原抗體復(fù)合物及顯色反應(yīng)產(chǎn)物，而用多種不同的技術(shù)方法來避免與第二種染色抗體系統(tǒng)的交叉反應(yīng)，即非洗脫法。較常用的非洗脫法有以下幾種。

1．直接法

把不同顏色的標(biāo)記物分別標(biāo)記到各個(gè)特異性抗體（一抗）上，采用直接法染色，特異性抗體分別與相應(yīng)的抗原結(jié)合，使抗原由不同的標(biāo)記物顯示出來，實(shí)現(xiàn)雙標(biāo)或多標(biāo)（圖6-1）。

第42頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三圖6-1直接法免疫雙重染色原理X、Y為兩種抗原HRP為辣根過氧化物酶AP為堿性磷酸酶

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2．間接法--異種動(dòng)物抗體法

不同種動(dòng)物IgG的Fc段抗原有種屬特異性，因此相應(yīng)的抗體不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)。用間接法染色時(shí)，不同的一抗（如兔抗X抗原的抗體和豚鼠抗Y抗原的抗體）可混合在一起使用，不同的二抗（如羊抗兔IgG和豬抗豚鼠IgG）也可混合在一起應(yīng)用，不同種屬的一抗和二抗各自與相應(yīng)的抗原（X和Y）反應(yīng)，從而將兩種抗原同時(shí)顯示出來（圖6-2A））。第44頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三如果二抗不是標(biāo)記抗體而只是作為橋抗體，則可再與三抗反應(yīng)，后者分別由產(chǎn)生一抗的同種動(dòng)物產(chǎn)生，又與不同的標(biāo)記物結(jié)合，最終顯示出不同的抗原所在部位（圖6-2B）。

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圖6-2間接異種動(dòng)物抗體法和雙重免疫染色原理

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3．間接法----同種動(dòng)物抗體法也稱分步固定法。做第一種染色時(shí)，在一抗（兔抗X）與組織抗原X結(jié)合后，用第一種標(biāo)記二抗（如FITC--羊抗兔IgG）飽和一抗（兔抗X）上的抗原決定簇，這就排除了第二種染色時(shí)所用的二抗（如TRITC-羊抗兔IgG）再與之結(jié)合的可能。此時(shí)由于二抗過量，每個(gè)FITC-羊抗兔IgG分子上的兩個(gè)抗原結(jié)合部位（Fab段）只有其中一個(gè)與一抗上的抗原決定簇結(jié)合，另一個(gè)處于游離狀第47頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三態(tài)，有可能與下一種染色中的一抗（兔抗Y）交叉反應(yīng)。因此，在完成第一種染色后，用多聚甲醛蒸氣處理組織片，使二抗的游離抗原結(jié)合部位失活，即可消除第二種染色中所用的一抗（兔抗Y）與之發(fā)生交叉反應(yīng)的可能，使各種免疫染色所用抗體都不再會(huì)有交叉反應(yīng)，從而可以一種接一種地進(jìn)行多種免疫顯色（圖6-3）。第48頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

圖6-3間接法同種動(dòng)物抗體法（分步固定法）多重免疫染色原理

第49頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三4．標(biāo)記抗原法:

應(yīng)用這一方法前，首先用不同的標(biāo)記物分別標(biāo)記與待檢抗原相同的純抗原。染色時(shí)先用未標(biāo)記的特異性抗體與組織抗原反應(yīng)，由于抗體過量及空間結(jié)構(gòu)的原因，每個(gè)特異性抗體IgG分子中只有一個(gè)抗原結(jié)合部位（Fab段）與組織抗原結(jié)合，另一個(gè)則與后來所用的標(biāo)記純抗原結(jié)合，從而顯示出相應(yīng)的組織抗原的部位。采用本法時(shí)，即使抗體不純也不會(huì)影響結(jié)果的特異性，因?yàn)闃?biāo)記好的純抗原只與相應(yīng)抗體結(jié)合，從而使組織中相應(yīng)的抗原分別得到特異性顯示（圖6-4）。第50頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三圖6-4標(biāo)記抗原法免疫雙重染色原理

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5．其他方法

免疫熒光法和免疫酶法的敏感性不同，可以組合應(yīng)用實(shí)現(xiàn)雙標(biāo)。先用免疫酶法作第一重染色，由于敏感性高，一抗可以高度稀釋，顯色反應(yīng)后，二抗又被顯色反應(yīng)生成物包繞，不易與下一重的一抗相結(jié)合。此后以免疫熒光法作第二重染色，由于敏感性低，所用的抗體系統(tǒng)不會(huì)與前一重染色中高度稀釋的抗體交叉反應(yīng)，就能分別標(biāo)示出不同抗原。同樣，還可將免疫金銀法與上兩種方法做不同組合，或?qū)⒚庖呓疸y法與免疫金法組合來實(shí)現(xiàn)雙標(biāo)。第52頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

二、免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)

最適合觀察存在于同一細(xì)胞內(nèi)的不同抗原。不同的熒光素在相應(yīng)的光波激發(fā)下會(huì)呈現(xiàn)不同的顏色，例如異硫氰熒光素（FITC）呈綠色，異硫氰酸四甲基羅丹明（TRITC）呈紅色熒光。把它們分別標(biāo)記在不同的抗體上，各自與相應(yīng)的抗原相結(jié)合，就能實(shí)現(xiàn)用不同顏色顯示不同的抗原。由于每種熒光素在特定波長(zhǎng)的光波激發(fā)下才呈現(xiàn)相應(yīng)的熒光（如FITC在490nm光波激發(fā)下呈綠色，TRITC在546nm光波激發(fā)下呈紅色），用熒光顯微鏡觀察雙標(biāo)陽性結(jié)果時(shí)，可以依次選用特定波長(zhǎng)的激發(fā)濾光片分別觀察。第53頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

要精確地比較陽性結(jié)果，則需用兩次曝光的技術(shù)，選用彩色底片，先對(duì)一種顏色熒光顯示的陽性結(jié)果拍照，然后轉(zhuǎn)換激發(fā)濾光片，對(duì)另一種顏色熒光顯示的陽性結(jié)果作第二次曝光，此時(shí)不可移動(dòng)載玻片，以保證切片上不同顏色代表的相應(yīng)抗原，可以分析比較它們相互間的關(guān)系。也可以不移動(dòng)切片，同時(shí)拍兩張不同顏色熒光照片，比較抗原存在部分，對(duì)處于同一細(xì)胞內(nèi)的抗原，用這種方法觀察結(jié)果較好。有時(shí)在同一波長(zhǎng)觀察兩種熒光，并進(jìn)行照相也能得到較滿意的結(jié)果。

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（一）洗脫法用同種動(dòng)物產(chǎn)生的特異性抗血清為一抗（如兔抗X抗原及兔抗Y抗原血清），二抗也由一種動(dòng)物產(chǎn)生（如羊抗兔IgG），但用不同顏色的熒光素分別標(biāo)記（如FITC-羊抗兔IgG及TRITC-羊抗兔IgG）。

1．設(shè)備與試劑（1）濕盒，冰箱和烤箱。（2）伊文藍(lán)溶液：取伊文藍(lán)lg溶解于l00mlPBS中，加入1%NaN31m1。過濾后貯存于4℃冰箱中。用前取0.1ml，加PBS9.9ml稀釋成0.01%濃度使用。第55頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（3）洗脫液：12.5%高錳酸鉀（KMn2O4）1ml，5%硫酸（H2SO4）1ml，加蒸餾水140ml混勻而成。

（4）0.5%焦亞硫酸納還原液：500mg焦亞硫酸鈉（Na2S2O5）加蒸餾水至l00ml。

（5）甲基綠溶液：0.1%甲基綠4m1加入PBS36ml混勻。

（6）緩沖甘油：純甘油（分析純）20ml，加入0.5mol/L碳酸緩沖液（pH9.5）20m1，充分混勻，待其中氣泡完全消失，即可使用。

（7）0.5mol/L碳酸緩沖液（pH9.5）：將NaHCO33.7g，Na2CO20.6g溶解于l00m1蒸餾水中，混合，調(diào)pH至9.5。第56頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

2．操作步驟

（1）石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，降乙醇至水；固定組織的恒冷切片，直接入0.01mol/LPBS；新鮮組織的恒冷切片，室溫干燥30~60min，在100%冷丙酮內(nèi)固定5~l0min后入PBS，組織周邊擦干。

（2）滴加適當(dāng)稀釋度的免疫血清，在濕盒、37℃溫箱中放置30~60min，或在4℃冰箱中過夜。

（3）PBS洗3次，每次5min，吸水紙吸去殘留液。

（4）滴加適當(dāng)稀釋度的間接熒光抗體（用0.01%伊文藍(lán)溶液稀釋，以消除非特異性自發(fā)熒光），在濕盒中37℃放置30~60min。

第57頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三（5）PBS洗2次，每次5min，再用蒸餾水洗1min。（6）甘油緩沖液封固，熒光顯微鏡觀察，拍照。（7）PBS泡數(shù)分鐘，去除封固，蒸溜水洗50min。（8）入洗脫液，洗脫時(shí)間隨切片厚度而定，一般為1~5min，較厚的振動(dòng)切片，需10min以上。（9）切片置入0.5%焦亞硫酸鈉液30s。（10）流水沖洗10~20min，蒸餾水浸5min。（11）重復(fù)步驟2~6進(jìn)行第二重免疫熒光染色。第58頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

若需要，可用甲基綠套染核，染色5min，再用PBS洗5min，然后封固。在熒光顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞核呈紅色。如果前一重染色中二抗是FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，則第二重可用TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗。完成第二重染色后，在鏡下找到第一次拍照的部位再次攝影，比較兩重染色的結(jié)果。由于洗脫法不能使兩種熒光素同時(shí)存在于一張切片上，因而不能用二次曝光的方法在同一張照片上顯示出兩種抗原。

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3．注意事項(xiàng)

（1）每次洗脫后，在進(jìn)行下一重染色之前鑒定洗脫效果。例如，在洗脫第一重染色中顯示X抗原抗體復(fù)合物后，先用非免疫血清（正常兔血清）或Y抗原吸附滅活的抗血清代替抗Y血清，以同樣步驟做第二重染色，結(jié)果應(yīng)為陰性，如果出現(xiàn)陽性，即表明洗脫不完全，第一重染色中殘留的抗體系統(tǒng)與后一重抗體系統(tǒng)發(fā)生了交叉反應(yīng)，陽性部位是X抗原而不是Y抗原。不經(jīng)鑒定直接做第二重染色，就可能把第一重染色殘留的抗體系統(tǒng)表現(xiàn)出來的假陽性結(jié)果誤為Y抗原，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。第60頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（2）本法中應(yīng)用的洗脫液具有很強(qiáng)的氧化作用，可能損害下一重染色所需要顯示的組織抗原的抗原性，造成洗脫后的假陰性結(jié)果。為此，在對(duì)組織切片做雙重染色之前，最好先用免疫組織化學(xué)濾紙模型，檢測(cè)洗脫液對(duì)所要染的各種抗原是否有破壞作用，也可將數(shù)張組織切片先用洗脫液處理后，分別對(duì)各個(gè)抗原做一重染色，了解最易受洗脫液損害的抗原。在雙重染色中，第一重染色總是先行顯示最嬌弱的抗原，而把能經(jīng)受洗脫液作用的抗原留待第二重染色中顯示。第61頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（二）非洗脫直接法

直接法雙標(biāo)的前提要備有不同熒光素分別標(biāo)記的特異性抗體，如FITC標(biāo)記的兔抗X抗體，TRITC標(biāo)記的兔抗Y抗體。

1．設(shè)備與試劑

同洗脫法。

2．實(shí)驗(yàn)步驟

（1）切片準(zhǔn)備：同洗脫法。

（2）把標(biāo)記好的抗X、抗Y熒光抗體，按適當(dāng)稀釋度混合在一起（用0.01%伊文藍(lán)溶液稀釋）滴加在切片上，37℃中放置30~60min?；?℃過夜。

（3）傾去熒光抗體，PBS洗2次，每次5min，蒸餾水洗1min。

（4）50%甘油緩沖液封固。

第62頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（三）間接法-異種動(dòng)物抗體法

所用的特異性抗體來自不同種動(dòng)物，如兔抗X血清，由鼠抗Y血清，然后用FITC標(biāo)記羊抗兔IgG，TRITC標(biāo)記豬抗鼠IgG作為相應(yīng)的二抗。染色時(shí)，不同的一抗可以混合在一起，不同的二抗也可混合在一起，按間接免疫熒光法步驟進(jìn)行。當(dāng)一抗分別與切片上的X、Y抗原結(jié)合后，再用混合二抗與之反應(yīng)。由于兔和鼠IgG的Fc段抗原有種屬特異性，因此羊抗兔IgG和豬抗鼠IgG各自與相應(yīng)的Fc段抗原結(jié)合，不會(huì)交叉反應(yīng)，X抗原即被FITC標(biāo)示，Y抗原則為TRITC標(biāo)示。這一方法的特異性與直接法一樣，但敏感性高于后者。

第63頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三第64頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（四）間接法-同種動(dòng)物抗體法

本法應(yīng)用兔抗X、兔抗Y抗原的血清為一抗，二抗也可由一種動(dòng)物產(chǎn)生，如羊抗兔IgG，但是用不同的熒光素如FITC及TRITC分別標(biāo)記，以顯示肽類抗原的方法為例，操作步驟如下：（1）石蠟切片厚3~5μm，脫蠟進(jìn)水。（2）以l%人血清白蛋白（HAS）或10%正常羊血清作用10min，阻斷切片對(duì)蛋白質(zhì)非特異性吸附。（3）用適當(dāng)稀釋的兔抗X血清與之反應(yīng)，一抗的稀釋度及反應(yīng)時(shí)間均按間接免疫熒光法摸出的最佳條件而定。

第65頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（4）以0.05mol/LTBS（pH7.4、內(nèi)含l%TritonXl00，下同）洗5min，共3次。（5）TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG在室溫下反應(yīng)1h。（6）PBS洗10min，共3次，這時(shí)第一重染色已完成，X抗原由TRITC顯示。（7）切片逐級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，空氣中干燥后，置多聚甲醛密閉容器中，80℃溫箱內(nèi)以甲醛蒸氣固定2~4h，使第一重染色中二抗的抗原結(jié)合部位失活。（8）將切片以TBS洗5min，共3次。（9）1%HAS（或10%正常羊血清）作用30min。（10）再以適當(dāng)稀釋的兔抗Y血清及FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，按上述步驟做第二重染色。第66頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（11）TBS洗后，以緩沖甘油封蓋，在熒光顯微鏡下分別以546nm及490nm波長(zhǎng)的激發(fā)光觀察TRITC及FITC所標(biāo)示的X、Y抗原所在部位。（12）如用彩色底片對(duì)切片同一部位用546nm及490nm波長(zhǎng)的激發(fā)光分別做兩次曝光，即可在同一張照片上顯示不同顏色標(biāo)示的兩種抗原。這種雙標(biāo)方法的關(guān)鍵在于完成第一重染色后，用多聚甲醛蒸氣使二抗的游離抗原結(jié)合部位被固定而失活，不會(huì)再與下一重染色中的抗體系統(tǒng)發(fā)生交叉反應(yīng)，因此也可稱為分步固定法。多聚甲醛蒸氣處理切片的時(shí)間，需根據(jù)切片的厚度掌握，一般5μm厚的切片，蒸氣固定的時(shí)間需長(zhǎng)達(dá)4h，效果較好。處理時(shí)間太短，可能使抗體滅活不徹底，仍然有可能與下一重染色中的一抗交叉反應(yīng)。第67頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

同洗脫法一樣，為檢查甲醛蒸氣固定對(duì)抗體的滅活效果，可以用正常兔血清以取代第二重染色中的一抗，按前述步驟做第二重染色，如果出現(xiàn)陽性，表明滅活不徹底，就需要再延長(zhǎng)甲醛蒸氣固定時(shí)間。凡是經(jīng)過甲醛溶液固定后仍然能保持抗原性的抗原，用這種分步固定法可以取得良好的雙重或多重免疫染色結(jié)果，有些抗原對(duì)甲醛固定作用比較敏感，其抗原性可能被破壞，對(duì)這樣的抗原可以在第一重染色中先行顯示。多聚甲醛蒸氣對(duì)FITC和TRITC的顏色和強(qiáng)度幾乎沒有影響，但因FITC的熒光比較容易衰退，因此在第一重染色中先用TRITC標(biāo)記的二抗，在第二重染色中再用FITC標(biāo)記的二抗效果較好。

第68頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三第69頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

三、免疫酶標(biāo)雙標(biāo)技術(shù)免疫酶標(biāo)雙標(biāo)技術(shù)與免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)的原理有很多相同之處，但作為標(biāo)記物的酶有好幾種，如辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶（GO）等，它們各自又有幾種不同的底物，顯色反應(yīng)所得顏色也各不相同，因此，免疫酶染色的方法種類比免疫熒光染色更多樣化。酶反應(yīng)物性質(zhì)較穩(wěn)定，不像標(biāo)記在抗體上的熒光素那樣容易被洗脫，在光鏡下同一張切片可同時(shí)見到兩種顏色的顯色物并存，不必像兩重?zé)晒馊旧菢臃謩e觀察。

第70頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（一）洗脫法原理步驟都與前述洗脫法雙重免疫熒光染色相似，可按不同的酶和底物系統(tǒng)呈色，在完成第一重免疫酶染色后，將抗原抗體復(fù)合物洗脫，再做第二重染色。用于雙重酶染色的洗脫液有多種，常用的是pH2.2的甘氨酸-鹽酸溶液，能夠消除第一重染色的抗體系統(tǒng)與下一重染色的交叉反應(yīng)，但保留顯色反應(yīng)所得的顏色。第71頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三第72頁，共79頁，2023年，2月20日，星期三

（二）非洗脫法