分子熒光與磷光光譜分析法

分子熒光與磷光光譜分析法第1頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)基本原理第2頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一、熒光、磷光產(chǎn)生的機(jī)理1、熒光、磷光的產(chǎn)生當(dāng)物質(zhì)分子吸收入射光子的能量之后，發(fā)生了價(jià)電子從較低的能級(jí)到較高能級(jí)的躍遷，這時(shí)分子被激發(fā)而處于激發(fā)態(tài)，稱為電子激發(fā)態(tài)分子。這一電子躍遷過(guò)程經(jīng)歷的時(shí)間約為10-15s。躍遷所涉及的兩個(gè)能級(jí)間的能量差，等于所吸收光子的能量。紫外、可見(jiàn)光區(qū)的光子能量較高，足以引起價(jià)電子發(fā)生電子能級(jí)間的躍遷。第3頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，它可能通過(guò)輻射躍遷和非輻射躍遷的衰變過(guò)程而返回基態(tài)。輻射躍遷的衰變過(guò)程伴隨著光子的發(fā)射，即產(chǎn)生熒光或磷光。非輻射躍遷：振動(dòng)弛豫（VR）內(nèi)轉(zhuǎn)化（ic）系間竄越（isc）這些衰變過(guò)程導(dǎo)致激發(fā)能轉(zhuǎn)化為熱能傳遞給介質(zhì)。第4頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三振動(dòng)弛豫：分子將多余的振動(dòng)能量傳遞給介質(zhì)而衰變到同一電子能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)的過(guò)程。內(nèi)轉(zhuǎn)化：相同多重態(tài)的兩個(gè)電子態(tài)間的非輻射躍遷過(guò)程。系間竄越：不同多重態(tài)的兩個(gè)電子態(tài)間的非輻射

躍遷過(guò)程。例如：S1 S0T2 T1

例如：S1 T1T1 S0

第5頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫第6頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三假如分子被激發(fā)到S2以上的某個(gè)電子激發(fā)單重態(tài)的不同振動(dòng)能級(jí)上，處于這種激發(fā)態(tài)的分子，很快（約10-12~10-14s）發(fā)生振動(dòng)弛豫而衰減到該電子態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，然后又經(jīng)過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)化及振動(dòng)弛豫而衰變到S1態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。接著，有以下幾種衰變到基態(tài)的途徑：S1 S0

輻射躍遷熒光S1S0內(nèi)轉(zhuǎn)化S1

T1系間竄越

T1

S0輻射躍遷磷光

T1

S0系間竄越第7頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三內(nèi)轉(zhuǎn)化速率很快（k為1011~1013s-1

），S2以上的激發(fā)單重態(tài)的壽命很短（10-1~10-13s），因而除極少數(shù)例外，通常在發(fā)生輻射躍遷之前便發(fā)生了非輻射躍遷而衰變到S1態(tài)。所以所觀察到的熒光壽命通常是來(lái)自S1態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的輻射躍遷。系間竄越是自旋禁阻的，因而其速率常數(shù)小得多（102~106s-1

）。第8頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三熒光是來(lái)自最低激發(fā)單重態(tài)的輻射躍遷過(guò)程所伴隨的發(fā)光現(xiàn)象。發(fā)光過(guò)程的速率常數(shù)大，激發(fā)態(tài)的壽命短。磷光是來(lái)自最低激發(fā)三重態(tài)的輻射躍遷過(guò)程所伴隨的發(fā)光現(xiàn)象，發(fā)光過(guò)程的速率常數(shù)小，激發(fā)態(tài)的壽命相對(duì)較長(zhǎng)。第9頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2、熒光、磷光的壽命和量子產(chǎn)率熒光壽命τf：熒光分子處于S1激發(fā)態(tài)的平均壽命：熒光發(fā)射過(guò)程的速率常數(shù)：各種分子的非輻射衰變過(guò)程的速率常

數(shù)的總和。典型的在10-8~10-10s第10頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三磷光壽命τp：磷光分子處于T1激發(fā)態(tài)的平均壽命。T1S0自旋禁阻的躍遷>>達(dá)到毫秒級(jí)：t=0熒光強(qiáng)度：t=t光強(qiáng)度熒光（或磷光）強(qiáng)度的衰變<<第11頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三熒光量子產(chǎn)率（f）定義為熒光物質(zhì)吸光后所發(fā)射的熒光的光子數(shù)與所吸收的激發(fā)光的光子數(shù)之比值。熒光量子產(chǎn)率的大小取決于熒光發(fā)射與非輻射躍遷過(guò)程的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果。<<1第12頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三磷光量子產(chǎn)率（p）：磷光發(fā)射的速率常數(shù)：S1

T1系間竄越的量子產(chǎn)率：與磷光發(fā)射過(guò)程相競(jìng)爭(zhēng)的從T1態(tài)發(fā)生的所有非輻射躍遷過(guò)程的速率常數(shù)的

總和。第13頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三熒光（或磷光）量子產(chǎn)率的大小，主要決定于化合物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，同時(shí)也與化合物所處環(huán)境因素有關(guān)?？捎脜⒈确ㄟM(jìn)行測(cè)定。、、：待測(cè)物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率、積分

熒光強(qiáng)度、吸光度、、：參比物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率、積分

熒光強(qiáng)度、吸光度第14頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、熒光、磷光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子中的電子是依序排列在能量由低到高的分子軌道上。πnσπ*σ*電子反鍵軌道鍵合軌道圖8-2.有機(jī)分子吸光所涉及的能層第15頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三雖然很多物質(zhì)能夠吸收紫外和可見(jiàn)光，然而只有一部分物質(zhì)能發(fā)熒光或磷光，分子能否發(fā)熒光或磷光，在很大程度上決定于它們的分子結(jié)構(gòu)。具有大的共軛雙鍵（π鍵）體系；具有剛性的平面構(gòu)型；環(huán)上的取代基是給電子取代基團(tuán)；其最低的電子激發(fā)單重態(tài)為（π，π*）型。第16頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1、共軛π鍵體系具有共軛雙鍵體系的分子，含有易被激發(fā)的非定域的π電子；共軛體系越大，非定域的π電子越容易被激發(fā)，且有更強(qiáng)的熒光。例如：萘、蒽、丁省等分子要比苯發(fā)射更強(qiáng)的熒光，且熒光峰隨苯環(huán)數(shù)的增多而向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)。第17頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三具有剛性平面構(gòu)型的分子，其振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)的自由度減小，從而增大了發(fā)光的效率2、剛性平面構(gòu)型例如：熒光素、曙紅強(qiáng)熒光酚酞無(wú)熒光第18頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三給電子取代基使熒光增強(qiáng)3、取代基的影響-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-OH、-OCH3、-CN、-F例如：F苯胺>F苯其激發(fā)態(tài)常由環(huán)外的羥基或氨基上的n電子激發(fā)轉(zhuǎn)移到環(huán)上而產(chǎn)生的，它們的n電子的電子云幾乎與芳環(huán)上的π軌道平行，從而共享共軛π電子結(jié)構(gòu)。第19頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三吸電子取代基使熒光減弱醛基、羰基、羧基、硝基例如：苯熒光硝基苯無(wú)熒光

Cl、Br、I等重原子取代基，通常導(dǎo)致熒光減弱、磷光增強(qiáng)。雖也含有n電子，但n電子的電子云并不與芳環(huán)上的π電子云共平面，其n→π*的躍遷為禁阻躍遷，且S1

T1系間竄越的概率大，故而熒光減弱。第20頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

π→π*：自旋許可的躍遷

摩爾吸光系數(shù)大，

104

激發(fā)態(tài)壽命短S1

T1系間竄越概率較小

4、最低電子激發(fā)單重態(tài)的性質(zhì)

n→π*：自旋禁阻的躍遷

摩爾吸光系數(shù)小，102

激發(fā)態(tài)壽命長(zhǎng)S1

T1系間竄越的幾率大第21頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三熒光：

π→π*

>n→π*磷光：n→π*

有利不含N、O、S等雜原子的芳香化合物：最低激發(fā)單重態(tài)S1（π、π*）

含N、O、S等雜原子的芳香化合物：最低激發(fā)單重態(tài)S1（n、π*）

第22頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、影響分子發(fā)光的環(huán)境因素1、溶劑的影響（1）溶劑極性的影響熒光體的偶極與溶劑分子的偶極之間存在著靜電作用，溶劑分子圍繞在熒光分子的周圍組成

了溶劑籠。許多共軛芳族化合物，激發(fā)時(shí)發(fā)生了ππ*躍遷，其激發(fā)態(tài)比基態(tài)具有更大的極性，隨著溶劑

極性的增大，激發(fā)態(tài)比基態(tài)能量下降得更多，結(jié)

果熒光光譜向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)。第23頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

熒光體的基態(tài)分子與溶劑分子形成氫鍵絡(luò)合物，熒光物質(zhì)的吸收光譜、熒光光譜都受影響，熒光體的激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子形成氫鍵絡(luò)合物，熒光光譜受影響。（2）熒光體與溶劑間的特殊化學(xué)作用（氫鍵）

n→π*躍遷、某些分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移躍遷

涉及非鍵的孤對(duì)電子

隨溶劑形成氫鍵能力增大

熒光光譜向短波方向移動(dòng)第24頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

某些芳族羰基化合物和氮雜環(huán)化合物非極性、疏質(zhì)子溶劑中

激發(fā)單重態(tài)（n、π*）熒光弱或無(wú)

高極性的氫鍵溶劑中

激發(fā)單重態(tài)（π

、π*）熒光強(qiáng)例如:

異喹啉

在環(huán)己烷中

無(wú)熒光發(fā)磷光

在水中

發(fā)熒光第25頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三如果熒光物質(zhì)是一種有機(jī)弱酸或弱堿，它們的分子及其相應(yīng)的離子，可視為兩種具有不同熒光特性的型體，介質(zhì)的酸堿性變化將使兩種不同型體的比例發(fā)生變化，從而對(duì)熒光光譜的形狀和強(qiáng)度產(chǎn)生很大的影響。2、介質(zhì)酸堿性的影響例如：水楊醛

不發(fā)熒光，強(qiáng)磷光

堿性溶液中

酚基解離

強(qiáng)熒光

濃無(wú)機(jī)酸溶液中

羰基質(zhì)子化

強(qiáng)熒光（π、π*）（n、π*）第26頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3、介質(zhì)的溫度和黏度的影響4、有序介質(zhì)的影響

表面活性劑或環(huán)糊精溶液屬于有序介質(zhì)，對(duì)發(fā)光分子的發(fā)光特性有著顯著的影響。T

VR

ic

F

p黏度VR

ic

F

p

第27頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三四．溶液熒光、磷光的熄滅

熒光的熄滅廣義的包括了任何可使熒光增強(qiáng)度降低的作用。狹義的僅僅指那些由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用所引起的熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象，這些會(huì)引起熒光的熄滅的物質(zhì)稱為熄滅劑。

狹義的熒光熄滅的原因是溶液中熄滅劑分子和熒光物質(zhì)分子之間發(fā)生相互作用而引起熒光物質(zhì)分子的熒光效率降低或熒光物質(zhì)激發(fā)態(tài)的壽命縮短，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的降低。

第28頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三淬滅劑動(dòng)態(tài)淬滅淬滅劑與發(fā)光物質(zhì)激發(fā)態(tài)分子發(fā)生相互作用靜態(tài)淬滅淬滅劑與發(fā)光物質(zhì)基態(tài)分子發(fā)生相互作用第29頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三著名的熄滅劑:鹵素離子重金屬離子氧分子硝基化合物

第30頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三鹵素離子對(duì)于奎寧的熒光有顯著的熄滅作用，但對(duì)某些物質(zhì)的熒光并不發(fā)生熄滅作用，這表明熄滅劑和熒光物質(zhì)分子之間的相互是有選擇性的。熒光熄滅作用在熒光分析中有著降低待測(cè)物質(zhì)的熒光強(qiáng)度的不良作用，但另一方面，我們可以利用某一物質(zhì)對(duì)某一熒光物質(zhì)的熄滅作用建立對(duì)該物質(zhì)的熒光熄滅法檢測(cè)。該法常具有更高的選擇性。第31頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

1.碰撞熄滅

溶液中熒光物質(zhì)分子M和熄滅劑Q相碰撞而引起熒光熄滅。比較速率M＋hυ→M*(吸光)1

M*

→

M＋hυ(發(fā)生熒光)k1[M*]M*+QM+Q+熱k2[M*][Q]

第32頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三Stern-Volmer方程式

k：熄滅常數(shù)[Q]：熄滅劑濃度(M)F0,F分別是熄滅劑Q不存在時(shí)及存在時(shí)的溶液的熒光強(qiáng)度第33頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2.組成化合物的熄滅

某些熒光物質(zhì)溶液在加入一些熄滅劑之后，溶液的熒光強(qiáng)度顯著降低;隨著溫度的升高，熒光強(qiáng)度而增強(qiáng)。

第34頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三上述情況可能是由于一部分熒光物質(zhì)分子M與熄滅劑分子Q作用而生成了絡(luò)合物MQ，如絡(luò)合物MQ的形成是由于微弱的范德華引力的作用，則所形成的絡(luò)合物并不發(fā)生熒光，且對(duì)solu的吸收并不發(fā)生任何影響。第35頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三發(fā)生熒光的物質(zhì)仍為M*分子，品種并沒(méi)有改變，所以熒光分子的平均壽命也沒(méi)有改變，至于solu溫度升高熒光強(qiáng)度之所以增強(qiáng)，可能是由于溫度升高時(shí)該絡(luò)合物較不穩(wěn)定，較多地分解為M和Q分子的緣故。這一點(diǎn)可以作為這一類型熄滅不同于碰撞熄滅的標(biāo)志。如果絡(luò)合物MQ的形成是由于強(qiáng)大的力，則絡(luò)合物MQ將具有它自己的吸光特性，溶液的吸收光譜也將發(fā)生改變。第36頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3.轉(zhuǎn)入三重線級(jí)的熄滅

E

C位E能π*

G

Dπ

A

BCBD處于單線態(tài)的基態(tài)EGF為第一激發(fā)單線態(tài)虛線為激發(fā)三線態(tài)第37頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

當(dāng)由單線態(tài)轉(zhuǎn)移至三線態(tài)時(shí)，多余的振動(dòng)能在碰撞中損失掉，solu中絕大多數(shù)轉(zhuǎn)入三重線級(jí)的分子在一般溫度下是不會(huì)發(fā)光的，它們把多余的能量消耗于它們與其它分子的碰撞之中，因而引起熒光的熄滅。轉(zhuǎn)入三重態(tài)的分子在低溫下可由三線態(tài)重新返回到基態(tài)，在這一過(guò)程中將放出波長(zhǎng)較長(zhǎng)的磷光。

第38頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

含溴、碘化合物、重氮、羰基、羧基及某些雜環(huán)化合物容易轉(zhuǎn)變至三線態(tài)，因而易使熒光熄滅。電子自旋方向的改變系有強(qiáng)烈磁場(chǎng)的誘導(dǎo)作用所引起的，在原子核附近，尤其是在Br或I這樣重的原子核附近，存在著強(qiáng)烈的磁場(chǎng)，所以含溴、碘的化合物容易使溶液熒光熄滅。

第39頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三幾乎所有會(huì)發(fā)生熒光的有機(jī)化合物都會(huì)被溶解在溶液中的氧分子熄滅劑熄滅到不同的程度。

三線態(tài)的氧分子和單線態(tài)的熒光物質(zhì)分子碰撞

單線態(tài)的氧分子和三線態(tài)的熒光物質(zhì)分子碰撞第40頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

4.

發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的熄滅

某些熄滅劑分子與熒光物質(zhì)分子相互作用時(shí)，發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即氧化－還原反應(yīng)，即引起熒光的熄滅。

例：甲基藍(lán)熒光溶液被Fe2+離子熄滅

D+hυ→D*

D*

→D+hυ＇

D*+Fe2+

→

D－

+Fe3+

D－

+H→DH（半醌）

2DH→D+DH2

（無(wú)色染料）第41頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的熄滅劑并不限于金屬離子，I－，Br－，CNS－，S2O32－等易于給出電子的陰離子對(duì)奎寧，羅丹明及熒光素鈉等有機(jī)熒光物質(zhì)也會(huì)發(fā)生熄滅作用。第42頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5.熒光物質(zhì)的自熄滅

當(dāng)C＞

1M時(shí)，常發(fā)生自熄滅現(xiàn)象。自熄滅的原因是多樣的：（1）M*→←M

例：F熄滅苯和蒽（2）多聚體的形成多聚體與單體具有不同的吸收光譜，但不會(huì)發(fā)生熒光或熒光強(qiáng)度很弱。

第43頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三消除：（1）熒光熄滅作用均隨著熄滅劑的濃度增大而加大，因此若對(duì)solu稀釋可消除或減低熒光的熄滅作用；（2）溶解氧的除去，通入氮?dú)?。?4頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三五

．熒光（磷光）強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系

A=-lgT=εbcT=F∝()F=Φf·

若用級(jí)數(shù)展開(kāi)，略去高次項(xiàng)，得F=2.303ΦfkCk=εbΦf稱為熒光的量子產(chǎn)率，Φf

第45頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三濃度效應(yīng)1.內(nèi)濾效應(yīng)2.發(fā)光分子形成基態(tài)或激發(fā)態(tài)的聚合物3.發(fā)光的再吸收第46頁(yè)，共54頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)儀器

與UV-Vis的區(qū)別：

1.檢測(cè)方向與入射方向垂