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文檔簡介

枯草芽孢桿菌堿性磷酸酶的鹽析與分析

2008.12.05實驗?zāi)康膹目莶菅挎邨U菌中分離提取堿性磷酸酶進(jìn)行酶活分析實驗原理堿性磷酸單酯酶（EC:3.1.3.1）又稱堿性磷酸酯酶，堿性磷酸酶，官方英文名為Alkalinephosphatase

堿性磷酸單酯酶廣泛分布于原核及真核生物各組織中，一般存在于外周胞質(zhì)中。其用途一般有：1）在用32P標(biāo)記5’末端前，去除DNA或RNA的5’磷酸。2）去除DNA片段5’磷酸以防止質(zhì)粒DNA連接和自身環(huán)化。

最適溫度37℃，最適pH10，對底物只具有相對的專一性，在堿性條件下水解磷酸酯：

單磷酸酯＋水醇＋磷酸

鹽析根據(jù)不同的蛋白質(zhì)在同一濃度鹽溶液中的溶解度不同而利用不同濃度的鹽溶液使每個蛋白質(zhì)成分分別析出的方法稱為蛋白質(zhì)的鹽析。實驗材料枯草桿菌發(fā)酵液Tris－HCl緩沖液（pH7.4、9.5）1mol/LMgCl2

溶液40mmol/L對硝基酚磷酸（NPP）溶液實驗步驟細(xì)胞培養(yǎng)與收集

每組取約50mL枯草桿菌發(fā)酵液8000rpm離心5min，收集菌體棄去上清。用pH7.4的Tris－HCl緩沖液洗滌菌體一次并棄去上清。堿性磷酸酶的提取

得到菌體沉淀后，每管加入5mLpH7.4的Tris－HCl緩沖液，使細(xì)胞重懸。然后再加入1mL1mol/LMgCl2

溶液，于室溫振蕩10min；8000rpm離心5min，取上清液即為粗酶液。取樣測酶活。酶活測定溶液加量pH9.5Tris－HCl緩沖液750μLNPP250μL樣品0.5ML37℃保溫10min0.5mL0.5MNaOH終止反應(yīng)稀釋至10mL酶活力單位：在42

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