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枯草芽孢桿菌堿性磷酸酶的鹽析與分析

2008.12.05實(shí)驗(yàn)?zāi)康膹目莶菅挎邨U菌中分離提取堿性磷酸酶進(jìn)行酶活分析實(shí)驗(yàn)原理堿性磷酸單酯酶（EC:3.1.3.1）又稱堿性磷酸酯酶，堿性磷酸酶，官方英文名為Alkalinephosphatase

堿性磷酸單酯酶廣泛分布于原核及真核生物各組織中，一般存在于外周胞質(zhì)中。其用途一般有：1）在用32P標(biāo)記5’末端前，去除DNA或RNA的5’磷酸。2）去除DNA片段5’磷酸以防止質(zhì)粒DNA連接和自身環(huán)化。

最適溫度37℃，最適pH10，對(duì)底物只具有相對(duì)的專一性，在堿性條件下水解磷酸酯：

單磷酸酯＋水醇＋磷酸

鹽析根據(jù)不同的蛋白質(zhì)在同一濃度鹽溶液中的溶解度不同而利用不同濃度的鹽溶液使每個(gè)蛋白質(zhì)成分分別析出的方法稱為蛋白質(zhì)的鹽析。實(shí)驗(yàn)材料枯草桿菌發(fā)酵液Tris－HCl緩沖液（pH7.4、9.5）1mol/LMgCl2

溶液40mmol/L對(duì)硝基酚磷酸（NPP）溶液實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞培養(yǎng)與收集

每組取約50mL枯草桿菌發(fā)酵液8000rpm離心5min，收集菌體棄去上清。用pH7.4的Tris－HCl緩沖液洗滌菌體一次并棄去上清。堿性磷酸酶的提取

得到菌體沉淀后，每管加入5mLpH7.4的Tris－HCl緩沖液，使細(xì)胞重懸。然后再加入1mL1mol/LMgCl2

溶液，于室溫振蕩10min；8000rpm離心5min，取上清液即為粗酶液。取樣測(cè)酶活。酶活測(cè)定溶液加量pH9.5Tris－HCl緩沖液750μLNPP250μL樣品0.5ML37℃保溫10min0.5mL0.5MNaOH終止反應(yīng)稀釋至10mL酶活力單位：在42

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