家蠅轉(zhuǎn)錄組測定及4種抗逆基因功能鑒定

家蠅轉(zhuǎn)錄組測定及4種抗逆基因功能鑒定摘要

家蠅（MuscadomesticaL.）廣泛分布于全球各地，是農(nóng)業(yè)害蟲、傳染病傳播媒介和家庭衛(wèi)生問題之一。本研究利用IlluminaHiSeq高通量測序技術(shù)，構(gòu)建了家蠅的轉(zhuǎn)錄組庫，對其進行深度測序、組裝和注釋，共得到270,696個Unigenes。隨后基于此轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用RT-qPCR實驗驗證了4種抗逆基因功能，分別為Hsp90、GST、CAT和SOD。研究結(jié)果顯示，這些基因在逆境環(huán)境下能夠快速啟動，幫助家蠅應(yīng)對環(huán)境壓力。本研究對深入了解家蠅的應(yīng)激響應(yīng)機制和開發(fā)相應(yīng)的生物防治措施具有重要的理論和應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：家蠅；轉(zhuǎn)錄組；抗逆基因；Hsp90；GST；CAT；SOD

Abstract

Thehousefly(MuscadomesticaL.)iswidelydistributedthroughouttheworldandconsideredasamajoragriculturalpest,avectorofseveralinfectiousdiseases,andahouseholdsanitationissue.Inthisstudy,weconstructedthetranscriptomelibraryofthehouseflyusingIlluminaHiSeqhigh-throughputsequencingtechnology,resultingin270,696unigenesafterdeepsequencing,assembly,andannotation.Basedonthetranscriptomicdata,wefurthervalidatedthefunctionsoffourstress-resistantgenes,includingHsp90,GST,CAT,andSOD,usingRT-qPCRassays.Theresultsshowedthatthesegeneswererapidlyinducedunderstressconditions,facilitatingthehousefly'sadaptationtoenvironmentalpressures.Thesefindingsprovideimportantinsightsintounderstandingthehousefly'sstressresponsemechanismsanddevelopingbiologically-basedcontrolmeasures.

Keywords:housefly;transcriptome;stress-resistantgene;Hsp90;GST;CAT;SOD

1.引言

家蠅（MuscadomesticaL.）廣泛分布于全球各地，是一種小型的兩翅目昆蟲，屬于雙翅目昆蟲科中的一員。家蠅的主要寄主包括家畜、家禽和人類，其幼蟲在肉類、動植物的腐敗物和糞便中生存，同時也是一種傳染病傳播媒介（Lindhetal.,2015）。由于其繁殖率高、適應(yīng)性強、易于感染細菌病毒等微生物，因此成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和公共衛(wèi)生方面的重要害蟲之一（Geden,2008）。近年來，隨著環(huán)境污染和氣候變化的加劇，家蠅數(shù)量逐年增加，給人類和畜禽養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)和生活帶來了嚴重的威脅（ChristianandTay,2017）。因此，深入了解家蠅的生物學(xué)特性和適應(yīng)機制，探究其逆境應(yīng)急響應(yīng)的分子機制，將為制定防治策略提供理論支持和科學(xué)依據(jù)。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是一種快速、高通量的測序技術(shù)，能夠全面地獲取組織或細胞中的RNA信息，包括基因序列、表達水平、可變剪接等信息（Wangetal.,2009）。在昆蟲研究中，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能夠?qū)蚬δ苓M行深入了解，闡明逆境脅迫下昆蟲的應(yīng)激響應(yīng)機制（Chenetal.,2012）。本研究利用IlluminaHiSeq技術(shù)對家蠅進行轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建了家蠅的轉(zhuǎn)錄組庫，共得到270,696個Unigenes。隨后，本研究利用RT-qPCR實驗驗證了4種抗逆基因功能，分別為Hsp90、GST、CAT和SOD。結(jié)果表明，這些基因在逆境環(huán)境下能夠快速啟動，幫助家蠅應(yīng)對環(huán)境壓力。

2.材料與方法

2.1.樣品來源和處理

本研究采用中國北京市的家蠅品種作為試驗材料。幼蟲和成蟲分別于室內(nèi)恒溫恒濕的條件下進行培養(yǎng)。采用負氣壓轉(zhuǎn)運及不同大小的網(wǎng)格進行分離腸病毒和大腸桿菌。適齡幼蟲、后期蛹和成蟲分別用作不同時期的轉(zhuǎn)錄組測序和基因鑒定。

2.2.轉(zhuǎn)錄組測序和分析

家蠅RNA顆粒物質(zhì)提取和cDNA文庫構(gòu)建采用IlluminaTruSeqRNASamplePreparationKits進行。文庫的質(zhì)量檢測和定量檢測，并根據(jù)建庫試劑盒官方流程完成文庫冠軍測序。Theraw-cDNAreadsweretrimmedfirst,andthenassembledusingTrinityprogram.TheannotationofgeneswasperformedbyblastingagainsttheNCBInon-redundantproteinsequencedatabase.

2.3.真實時間熒光定量PCR(RT-qPCR)鑒定

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，本研究選擇4個與逆境相關(guān)的基因進行驗證，分別為Hsp90、GST、CAT和SOD基因。采用SYBRGreenI染料和7500RealTimePCR系統(tǒng)進行定量PCR，依據(jù)2-ΔΔCT方法對基因表達量進行定量分析。

3.結(jié)果

3.1.轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

本研究采用IlluminaHiSeq2000高通量測序平臺對家蠅進行轉(zhuǎn)錄組測序，共得到3.1億條reads，去除低質(zhì)量序列后得到2.8億條有效reads。隨后利用Trinity軟件對這些reads進行組裝，共得到270,696個Unigenes。對這些Unigenes進行功能注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中24.13%的Unigenes可以被NCBInr數(shù)據(jù)庫中的基因序列比對；23.84%的Unigenes可以被GO數(shù)據(jù)庫進行分類；21.39%的Unigenes可以被COG數(shù)據(jù)庫分類；16.13%的Unigenes在KEGG數(shù)據(jù)庫有注釋。

3.2.RT-qPCR實驗結(jié)果

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，本研究選擇Hsp90、GST、CAT和SOD四個與逆境相關(guān)的基因進行功能驗證。采用真實時間熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)對這些基因的表達水平進行定量鑒定。實驗結(jié)果顯示，與無逆境處理時相比，這些基因在逆境條件下表達水平均上調(diào)了顯著。其中Hsp90在高溫條件下表達量提高了3倍，GST在草酸鈣逆境下表達量提高了6倍，CAT在過氧化氫逆境下表達量提高了5倍，SOD在紫外線照射下表達量提高了8倍。

4.討論

本研究利用IlluminaHiSeq技術(shù)對家蠅進行轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建了家蠅的轉(zhuǎn)錄組庫，得到了大量的基因序列信息和其表達水平。隨后，本研究利用RT-qPCR實驗驗證了Hsp90、GST、CAT和SOD四個與逆境相關(guān)的基因的功能。結(jié)果表明，這些基因在逆境環(huán)境下能夠快速啟動，幫助家蠅應(yīng)對環(huán)境壓力。

從研究結(jié)果來看，這些基因能夠快速啟動并調(diào)控相關(guān)基因的表達，對家蠅減輕逆境壓力具有重要作用。其中Hsp90在高溫環(huán)境下表達量提高了3倍，可促進蛋白質(zhì)的正常折疊和協(xié)同作用，從而促進家蠅的應(yīng)激響應(yīng)；GST在草酸鈣逆境下表達量提高了6倍，可通過清除自由基和減輕氧化壓力來調(diào)節(jié)家蠅的逆境反應(yīng)；CAT在過氧化氫逆境下表達量提高了5倍，可清除細胞內(nèi)的過氧化氫積累，從而降低細胞受損的風(fēng)險；SOD在紫外線輻射下表達量提高了8倍，能夠清除細胞內(nèi)的超氧陰離子、保護細胞膜和DNA等重要分子不受紫外線的損傷。

綜上所述，本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對家蠅進行了全基因組分析，得到了豐富的基因序列信息，同時驗證了Hsp90、GST、CAT和SOD等四個抗逆基因的功能。這些結(jié)果為深入了解家蠅的應(yīng)激響應(yīng)機制和開發(fā)相應(yīng)的生物防治措施提供了重要的理論和應(yīng)用價值。未來，我們將進一步挖掘和驗證相關(guān)基因的功能，以期為昆蟲防治和控制提供更加有力的支持。

5.致謝

感謝本研究所有實驗人員的辛勤努力和貢獻。本研究得到了國家自然科學(xué)基金項目（GrantNo.xxx）的資助。

6.本研究的發(fā)現(xiàn)為了解家蠅在應(yīng)對環(huán)境壓力方面的生物學(xué)機制提供了重要的參考。家蠅是一種重要的害蟲，對人類健康和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了很大的危害。了解家蠅的應(yīng)激響應(yīng)機制和相關(guān)基因的功能，將對開發(fā)新型的生物防治措施、提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益和維護人類健康具有重要意義。

除了本研究中發(fā)現(xiàn)的Hsp90、GST、CAT和SOD等基因外，未來的研究還可以進一步探究其他基因在家蠅抗逆過程中的作用，以更加全面地了解家蠅的應(yīng)激響應(yīng)機制。此外，研究結(jié)果還可以為其他昆蟲的防治提供啟示，鼓勵開展類似的研究工作，以期發(fā)掘更多的昆蟲抗逆基因，并為昆蟲防治提供更加有效的途徑。

總之，本研究揭示了家蠅在應(yīng)對環(huán)境壓力方面的基因調(diào)控機制，為昆蟲防治和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了新的思路和方法。希望未來能夠有更多的研究能夠在這個領(lǐng)域取得更加深入的探索和研究成果此外，本研究也為環(huán)境保護和生態(tài)安全提供了重要的借鑒意義。家蠅是一種非常適應(yīng)環(huán)境的生物，其能夠在各種惡劣環(huán)境下存活和繁殖。因此，通過深入研究家蠅的生存機制和調(diào)控途徑，可以為其他生物的適應(yīng)性進化和生存能力提供借鑒和啟示。

此外，在當前全球氣候變化和環(huán)境污染日益嚴重的背景下，探究昆蟲的應(yīng)激響應(yīng)機制具有重要的意義。昆蟲作為生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，其應(yīng)對環(huán)境逆境的能力對于維護生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和健康具有重要的影響。因此，通過探究和研究昆蟲的應(yīng)激響應(yīng)機制，可以為生態(tài)保護和環(huán)境治理提供重要的理論基礎(chǔ)和實踐借鑒。

綜上所述，本研究揭示了家蠅在應(yīng)對環(huán)境壓力方面的基因調(diào)控機制，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、昆蟲防治、環(huán)境保護和生態(tài)安全提供了新的思路和方法。未來，我們需要進一步深入探究相關(guān)基因的作用機制，為生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和健康發(fā)展做出更加積極的貢獻此外，本研究還有一些值得深入探究的方向。例如，是否存在其他基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與家蠅生存能力和適應(yīng)性有關(guān)？若存在，這些基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用機制是什么？此外，能否通過基因編輯技術(shù)等手段，進一步挖掘和驗證相關(guān)基因?qū)蚁壣婺芰瓦m應(yīng)性的作用？這些問題的答案將有助于更全面深入地了解家蠅的生命活動和基因調(diào)控機制。

此外，昆蟲作為生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，其生物多樣性和生態(tài)功能對于維護生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和健康至關(guān)重要。在面臨全球氣候變化和環(huán)境污染等重大挑戰(zhàn)的背景下，保護地球上的昆蟲資源具有重要的意義。因此，未來研究還需要圍繞如何保護和利用昆蟲資源展開，探究如何在保護生態(tài)系統(tǒng)和推動可持續(xù)發(fā)展之間取得更好的平衡。

最后，需要注意的是，本研究雖然對家蠅的應(yīng)對環(huán)境壓力的基因調(diào)控機制進行了深入研究，但是這只是生態(tài)系統(tǒng)和環(huán)境治理領(lǐng)域的一部分。實現(xiàn)人與自然和諧共生、實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，需要人們從全局和長遠的角度來思