單倍體細(xì)胞培養(yǎng)

單倍體細(xì)胞培養(yǎng)第1頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四第2頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四第3頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四單倍體植物與它們的二倍體相比較，有三個(gè)明顯的特點(diǎn)：

1、體細(xì)胞染色體數(shù)減半；2、生長(zhǎng)發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減??；3、雌、雄配子嚴(yán)重?cái)∮械纳踔敛荒苓M(jìn)入有性世代。第4頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四（二）誘發(fā)植物產(chǎn)生單倍體主要有四種方法：1、種間和屬間雜交。遠(yuǎn)緣花粉的的誘導(dǎo)，卵細(xì)胞在花粉的刺激下進(jìn)行孤雌發(fā)育，生成單倍體。2、物理照射和化學(xué)誘變。花粉用射線處理后失去受精能力，然后與母株授粉，卵細(xì)胞在花粉的刺激下進(jìn)行孤雌發(fā)育，生成單倍體。3、雙生苗的篩選。有些植物可產(chǎn)生多胚的種子，兩個(gè)或多個(gè)胚被共同的種皮包著，可產(chǎn)生單倍體-單倍體，二倍體-二倍體，單倍體-二倍體植株。4、花藥和花粉培養(yǎng)。可產(chǎn)生單倍體胚，或者先誘導(dǎo)單體愈傷組織再經(jīng)適當(dāng)途徑產(chǎn)生單倍體植株。第5頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四二、單倍體的應(yīng)用價(jià)值第五章

1、在植物育種中使后代迅速純合，縮短育種年限母本ⅹ

父本F2F1品系比較試驗(yàn)區(qū)域試驗(yàn)品種花藥培養(yǎng)花粉植株加倍選擇鑒定5-8代第6頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四第五章

2、可以提高選擇效率AAbb(母本）aaBB(父本）Ab(雌配子）aB(雄配子）AaBb(F1）常規(guī)雜交育種不同類型卵ABAbaBab精子ABAbaBab單倍體育種AABBAABbAaBBAaBbAABbAAbbAaBbAabbAaBBAaBbaaBbaaBBAaBbAabbaaBbaabbAABBAAbbAAbbaaBBaabb第7頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四第五章3、排除雜種優(yōu)勢(shì)對(duì)后代選擇的干擾4、突變體的篩選5、消除致死基因6、選育新型自交系7、遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料8、基因表達(dá)研究的良好實(shí)驗(yàn)材料第8頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)離體培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育一、活體小孢子的正常發(fā)育第9頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四二、離體培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育離體條件下，改變了花粉原來的生活環(huán)境，花粉第二次分裂不再像花粉發(fā)育那樣由生殖核再分裂一次形成兩個(gè)精子核，而是像胚細(xì)胞一樣持續(xù)分裂。離體條件下花粉分裂方式有四種類型：1、營養(yǎng)細(xì)胞發(fā)展育途徑?；ǚ鄣谝淮斡薪z分裂形成不等的營養(yǎng)核和生殖核，生殖核較小，退化，而較大的營養(yǎng)核多次分裂形成細(xì)胞團(tuán)，形成胚狀體或者愈傷組織，最后形成單倍體。2、生殖細(xì)胞發(fā)育途徑。營養(yǎng)核分裂幾次退化，生殖核形成細(xì)胞團(tuán)。3、營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞并進(jìn)發(fā)育途徑。一種情況各自形成愈傷組織或者是胚狀體，另一種情況為融合后再分裂4、花粉均等分裂途徑。花粉均等分裂形成2個(gè)均等子核，以后形成2個(gè)子細(xì)胞，最后形成胚狀體或者愈傷組織。第10頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四途徑一途徑二小孢子正常發(fā)育途徑和培養(yǎng)條件下胚胎發(fā)育途徑比較第11頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四途徑一A途徑：自然下小孢子第二次分裂及萌發(fā)形成花粉管。B途徑：營養(yǎng)核重復(fù)分裂生殖核敗育C途徑：生殖細(xì)胞重復(fù)分裂，營養(yǎng)細(xì)胞敗育。途徑二

D途徑：兩個(gè)核共同分裂形成單倍體胚。

E途徑：兩個(gè)核融合后分裂形成純合的二倍體。第12頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)花藥培養(yǎng)花藥(anther)：植物花的雄性生殖器官，包括二倍體的花藥壁、藥隔和單倍體的雄性性細(xì)胞（花粉粒）培養(yǎng)前要用醋酸洋紅壓片鏡檢確定發(fā)育時(shí)期?；ㄋ幣囵B(yǎng):將花粉發(fā)育至一定階段的花藥培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上，(先暗培養(yǎng)，愈傷形成后移到光下促進(jìn)分化)誘導(dǎo)其花粉粒改變發(fā)育進(jìn)程，形成花粉胚或愈傷組織，進(jìn)而分化成苗的過程。（器官培養(yǎng)）第13頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四第14頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四A：從裂開的花藥中長(zhǎng)出胚狀體;B、C：從藥室中直接長(zhǎng)出的幼苗;D、E：具有根、莖、葉的小苗;F：小苗發(fā)達(dá)的根系第15頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四花藥和花粉培養(yǎng)實(shí)質(zhì)：把發(fā)育到一定階段的花藥（或花粉）接種在人工培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑，使其不形成配子，而像體細(xì)胞一樣進(jìn)行分裂、分化，最終發(fā)育成完整植株的過程。廣義的花粉培養(yǎng)，孤雄生殖。培養(yǎng)類型：花藥---器官培養(yǎng)培養(yǎng)類型：花粉---單細(xì)胞培養(yǎng)兩者目的一致：誘導(dǎo)花粉細(xì)胞發(fā)育成單倍體植株。第16頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四再生植株途徑有2種：1、經(jīng)由成愈傷組織再生植株2、經(jīng)由胚狀體再生植株第17頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四第18頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四

花藥培養(yǎng)的步驟1.取材供體植株最好栽種在溫光可控條件下，以保證花的發(fā)育條件穩(wěn)定，試驗(yàn)具有可重復(fù)性?；ㄋ帒?yīng)取自幼年植株，多數(shù)植物以單核中央期或單核靠邊期為宜。以花的外觀形狀來確定采花標(biāo)準(zhǔn)，用醋酸洋紅壓片法或者碘-碘化鉀壓片法四分體時(shí)期單核靠邊期花藥切片顯微觀察第19頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四2.滅菌及預(yù)處理未開放的花蕾，常規(guī)滅菌后直接取出花藥在4~5℃條件下冷處理2~4d，易產(chǎn)生胚狀體。3.接種盡量不使花藥損傷并去除花絲，排除二倍體組織對(duì)單倍體植株再生的影響。4.培養(yǎng)常用培養(yǎng)基有MS、B5、White等，3~8周后花粉中形成了胚狀體或愈傷組織。先暗培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，再轉(zhuǎn)至25℃，光照2000lx/14h條件下促進(jìn)分化。第20頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四影響花藥培養(yǎng)的因素：1、供體植株的生長(zhǎng)條件：不同的生長(zhǎng)季節(jié)、環(huán)境、不同部位的花蕾，其花粉的生理狀態(tài)也不同，培養(yǎng)效果也會(huì)有明顯的差異2、供體植株的年齡：多數(shù)情況下幼年的植株好于老年的植株，但是甘藍(lán)型油菜相反。3、花粉的發(fā)育時(shí)期：煙草中處于第一次有絲分裂期的花粉最好；而在禾本科和蕓苔屬中，單核早期最好。4、花蕾、花藥的預(yù)處理：低溫5、供體植株的基因型6、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及活性碳第21頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四第22頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四第四節(jié)花粉培養(yǎng)

定義：將發(fā)育至一定階段花粉從花藥中分離出來成為分散或游離狀態(tài)，花粉脫分化后再生成苗。（類似單細(xì)胞培養(yǎng)）

第23頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四小孢子：處于四分體到單核早期的花粉習(xí)慣上，把處于四分體到單核早期的花粉稱小孢子。進(jìn)入單核以后則稱為花粉。四分體—單核早期—單核晚期—雙核早期—雙核晚期—三核期小孢子花粉粒第24頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四花粉發(fā)育時(shí)期：1、適宜時(shí)期：?jiǎn)魏似?尤其是單核中、晚期(單核靠邊期)雄配子體的發(fā)育

營養(yǎng)細(xì)胞生殖細(xì)胞精子第25頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四花粉粒形態(tài)：

花粉粒即雄配子體。為2細(xì)胞花粉或3細(xì)胞花粉2--細(xì)胞花粉3--細(xì)胞花粉第26頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四花粉的分離、純化1）花粉漂浮自然釋放法:將花藥接種于液體培養(yǎng)中，使花粉自然釋放。

2）人工擠壓法:用玻璃棒搗碎花藥使花粉釋放。

3）機(jī)械法:用磁力攪拌器打碎花藥釋放花粉。釋放的花粉?！猃埦W(wǎng)（孔徑20—60um）過濾，除去藥壁等組織→500-1000轉(zhuǎn)/分離心1-5分鐘，收集花粉。第27頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四花粉培養(yǎng)方法1.平板培養(yǎng)：直接取新鮮花藥的花粉粒在平板培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的方法2.液體培養(yǎng)：比固體培養(yǎng)法效果好。將花藥接種到液體培養(yǎng)基內(nèi)，在搖床上振蕩（100轉(zhuǎn)/分鐘），誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體或懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。需要定期更換培養(yǎng)基（在超凈工作臺(tái)上靜置沉淀，去上清，然后加入新培養(yǎng)基）。3.雙層培養(yǎng)(固-液培養(yǎng)）固相和液相雙層培養(yǎng)。4.看護(hù)培養(yǎng)：將花藥水平放于固體培養(yǎng)基上，在其上覆蓋小圓形濾紙，在濾紙滴加0.5ml含10個(gè)花粉粒的懸浮液滴的培養(yǎng)方法。5.微室培養(yǎng)：將一滴花粉懸液滴在蓋玻片上，在翻過來放在凹穴載玻片上，蓋玻片四周用石蠟密封。6.預(yù)培養(yǎng)：將花藥先懸浮培養(yǎng)2-4天（50個(gè)花藥/5ml），再擠出花粉，經(jīng)離心洗滌純化后懸浮培養(yǎng)。7.哺育培養(yǎng)：將在合適培養(yǎng)基上培養(yǎng)裂開的花藥作為哺育組織，將預(yù)培養(yǎng)的花粉接種在其中的方法。

第28頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四第29頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四二、移栽馴化花粉植株弱小，移栽難。關(guān)鍵---保持高空氣濕度（80-90%