口腔微生物分子生物學

口腔微生物分子生物學第1頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第2頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三生命的主要遺傳物質脫氧核糖核酸（DNA）第3頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三DNA結構的推衍Chargaff:T+C=A+G A=T G=CX線衍射：

DNA在兩條鏈組成，相互平行第4頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三核酸的組成DNA RNA脫氧核糖 核糖腺嘌吟胞嘧啶 腺嘌呤胞嘧啶鳥嘌呤胸腺嘧啶 鳥嘌呤尿嘧啶雙鏈 單鏈第5頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第6頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第7頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三DNA復制半保留復制第8頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三DNA復制半不連接復制由于DNA多聚酶只能從5’→

3’方向合成DNA，因而半保留復制不能完全解釋。第9頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第10頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三DNA復制的特點新合成的子代DNA與親代DNA完全一樣，保證了遺傳的穩(wěn)定性。第11頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三RNA信使RNA（mRNA)核蛋白體RNA（rRNA)轉運RNA（tRNA)第12頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三RNA的生物合成——轉錄以DNA為模板合與RNA由RNA多聚酶合成從DNA上特定起始序列（啟動子）開始，至終止信號結束第13頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第14頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三蛋白質的生物合成——翻譯遺傳密碼

由3個連續(xù)的核苷酸組成第15頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三蛋白質的生物合成——翻譯蛋白質合成過程Ⅰ.氨基酸活化Ⅱ.蛋白質合成的起始AUG→甲?；琢虬彼幔╢Met)Ⅲ.蛋白質合成的終止終止碼UAA、UGA、UAG第16頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第17頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第18頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第19頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第20頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三蛋白質的生物合成——翻譯新生多肽的加工Ⅰ.fMet水解Ⅱ.磷酸化、糖基化、甲基化修飾Ⅲ.信號肽蛋白質向細胞外分泌第21頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三基因表達DNA→RNA→蛋白質豐富的生命現(xiàn)象第22頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三基因表達的調節(jié)機體的每一個細胞都有一套完全相同的基因共同表達的基因特異性表達的基因第23頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第24頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三基因表達的調節(jié)共同表達的基因維持細胞基本結構、功能第25頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三基因表達的調節(jié)特異性表達的基因紅細胞產生血紅蛋白B淋巴細胞產生抗體成牙本質細胞分泌牙本質蛋白第26頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三基因表達調控的原因動力細胞內、細胞間，或細胞與外界環(huán)境間關系的變化。第27頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三基因表達調節(jié)的方式啟動子強啟動子與RNA多聚酶有較強的結合能力，轉錄水平較高；弱啟動子則反之。第28頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三基因表達調節(jié)的方式調節(jié)蛋白的作用—負向調節(jié)—正向調節(jié)第29頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三負向調節(jié)乳糖操縱子學說第30頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第31頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第32頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三正向調節(jié)第33頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三原核生物基因表達的調節(jié)主要在轉錄水平第34頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三真核基因生物調節(jié)多層次復雜性第35頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三分子克隆技術第36頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三限制性內切酶特定的識別序列，4~6個堿基對在識別序列內固定位置切割，5’–端磷酸基因，

3’-端羥基基團切割后形成粘性或平滑末端第37頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第38頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三DNA連接酶催化DNA中相鄰3’羥基和5’磷酸基團之間形成3’，5’–磷酸二酯鍵。第39頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三質粒細胞內獨立于染色體外的環(huán)狀DNA，能自我復制其上基因可借助宿主細胞的轉錄、翻譯系統(tǒng)得以表達分子2000~50000bp第40頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三TpGEM-TVector(3003bp)AmprlacZoriXmnI1994ScaI1875NaeI2695ApaIAatIISphIBstZINcoISacIIT7SpeINotIBstZIPstISaLINdeISacIBstXINsiISP6T1start14202631374655626273758294103112126

pGEM-Tvectormap第41頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三XhoISmaIXhoISmaIXhoISmaIpCIpCIA-PpGEM-T/A-P

A-PfragmentSub-cloningconstructionofrecombinantpCIA-PinsertionofA-PDNAfragmentintoplasmidpCIXhoISmaIT4LigaseA-Pfragment第42頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三構建質粒的特點Ori區(qū)：復制起點Par區(qū)：保證質粒均勻分布于子細胞多克隆區(qū)：人為構建，便于克隆操作選擇因子：含特定基因，如耐抗生素基因，使克隆后便于挑選第43頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三接合在適當?shù)臈l件下，雄性菌和雌性菌混合時形成配對的雄性-雌性菌，并有遺傳物質的單向轉移。雄性菌：含F(xiàn)性因子，染色體外環(huán)狀DNA第44頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第45頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三轉化外源DNA能進入細胞內并通過整合至宿主DNA中或獨立復制保存于宿主細胞內。第46頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三轉錄利用噬菌體為媒介，將供體DNA轉移到受體菌內的現(xiàn)象，能在自然狀態(tài)下發(fā)生。第47頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第48頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三分子克隆常用技術DNA電泳基因轉移核酸雜交聚合酶鏈反應PCR第49頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三DNA電泳可分離不同分子量的DNA第50頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第51頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三

Ladder1234567891011121314Ladder對臨床菌株的第二次PCR擴增產物電泳圖譜分析

Lane1~7:臨床菌株S.sobrinus;Lane8~14:臨床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW第52頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三核酸雜交原理：在一定條件下（溫度、pH值等）DNA雙股螺旋可解開并分離在一定條件下，兩股游離的互補的核苷酸可自行配對形成雙股第53頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三SouthernBlot電泳、轉移、雜交確定分子量第54頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第55頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三第56頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三斑點雜交目標序列的存在目標序列的量第57頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三聚合酶鏈反應PCR第58頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三與齲病相關微生物的定量檢測方法細菌形態(tài)生化反應免疫反應分子生物學方法----分子探針雜交----RFLP----PCR唾液在與齲病相關微生物檢測中的應用第59頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三在人類口腔中檢出率很高茸毛鏈球菌可能比變形鏈球菌與齲損活躍性之間的關系更密切變形鏈球菌和茸毛鏈球菌唾液在與齲病相關微生物檢測中的應用第60頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三套式PCR快速檢測人類唾液中變形鏈球菌和茸毛鏈球菌.譚海平，邊專，樊明文，陳智，范兵.中華口腔醫(yī)學雜志，2003，38：223-226唾液在與齲病相關微生物檢測中的應用第61頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三套式PCR(NestedPCR)5′

3′

TemplateOuterprimer2Outerprimer1ThefirstPCR5′

3′

Interprimer2Interprimer1NexttemplateThesecondPCR5′

3′ThesecondPCRproduct第62頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三本套式PCR的引物是分別根據(jù)變形鏈球菌gtfB基因和茸毛鏈球菌gtfI基因設計的內、外兩套引物（outerprimer,interprimer）gtfBgeneofS.mutansOuterprimerthp4Outerprimerthp3ThefirstPCRInterprimerthp8Interprimerthp7Outerprimerthp6gtfIgeneofS.sobrinusOuterprimerthp5ThefirstPCRInterprimerthp10Interprimerthp9ThesecondPCRThesecondPCR

第63頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三抽提細菌染色體DNA(Igarashietal.1996)----細菌----唾液PCR反應過程第一次PCR反應

預變性:94℃4min

變性:94℃1min

退火:51℃1min30cycles

延伸:72℃2min

最后延伸:72℃5min

第二次PCR反應第64頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三

abcdefghLadder12345678選擇外引物行第一次PCR后擴增產物電泳圖譜分析以變鏈菌組(MutansStreptococci)染色體DNA為模板

Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7;6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.

MW(Kb)2.01.00.250.10.750.5第65頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三

abcdefghLadder12345678選擇內引物行第二次PCR后擴增產物電泳圖譜分析

Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7:6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.Marker:DL2,000Ladder

MW(Kb)2.00.750.51.00.250.1第66頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三

Ladder123456第一次PCR的靈敏度

變形鏈球菌S.mutansIngbritt的數(shù)量

Lane1:108CFU;Lane2:107CFU;Lane3:106CFU;Lane4:105CFUMW(Kb)2.00.750.51.00.25第67頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三

2.0

0.5

Ladder1234561.00.750.25MW(Kb)第二次PCR的靈敏度

變形鏈球菌S.mutansIngbritt的數(shù)量

Lane1:104CFU,Lane2:103CFU

第68頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三

Ladder1234567891011121314Ladder對臨床菌株的第二次PCR擴增產物電泳圖譜分析

Lane1~7:臨床菌株S.sobrinus;Lane8~14:臨床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW第69頁，共77頁，2023年，2月20日，星期三

Ladder12345LadderMW1.0(Kb)0.750.50.250.1