原位雜交組織化學(xué)

原位雜交組織化學(xué)第1頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三原位雜交組織化學(xué)（ISHH）原理：用標(biāo)記的DNA或RNA為探針，在原位檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的方法。特點(diǎn)：雜交在載玻片上的細(xì)胞進(jìn)行。分類(lèi)：根據(jù)所用探針和靶核苷酸不同--DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交、RNA-RNA雜交根據(jù)探針標(biāo)記物是否直接被檢測(cè)—

直接法、間接法第2頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一原位雜交的由來(lái)與發(fā)展

（一）核酸分子雜交技術(shù)

按其作用方式大致分為液相雜交和固相雜交兩種液相雜交：參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。液相分子雜交技術(shù)包括：①吸附雜交②發(fā)光液相雜交③液相夾心雜交④復(fù)性速率液相分子雜交第3頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三固相雜交：是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈固定在固體的支持物上常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等），另一條參加反應(yīng)的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交技術(shù)包括：①菌落原位雜交②斑點(diǎn)雜交法③Southern印跡雜交④Northern印跡雜交⑤組織原位雜交第4頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（二）原位雜交技術(shù)的發(fā)展在近20年飛躍發(fā)展的突出特點(diǎn)：①由分子遺傳學(xué)研究提供的探針大量增加；②探針生產(chǎn)的可靠性和速率大大發(fā)展了；③非放射性標(biāo)記物的發(fā)展使原位雜交技術(shù)成為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)和臨床日常應(yīng)用的診斷技術(shù)。④新的非放射性標(biāo)記技術(shù)正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。第5頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二原位雜交組織化學(xué)基本技術(shù)原位雜交的基本方法和應(yīng)用原則：①雜交前準(zhǔn)備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強(qiáng)核酸探針的穿透性、減低背景染色等；②雜交；③雜交后處理；④顯示（visualization）：放射性自顯影顯色、非放射性標(biāo)記顯色第6頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（一）原位雜交的基本要求1固定2玻片和組織切片的處理3雜交4雜交后處理5顯示6對(duì)照實(shí)驗(yàn)和ISHH結(jié)果的判斷第7頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

1固定

固定劑的應(yīng)用和選擇原則：①保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)；②最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA水平；③使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。DNA：比較穩(wěn)定，對(duì)于DNA的定位來(lái)說(shuō)，固定劑的種類(lèi)和濃度并不十分重要。RNA：易被降解，在RNA的定位上，要使RNA的降解減少到最低限度，固定劑的種類(lèi)、濃度和固定的時(shí)間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。第8頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三固定劑：多聚甲醛、醋酸-酒精混合液、Bouin’s固定劑、Carnoy’s液

優(yōu)缺點(diǎn)：

沉淀性固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液能增加核酸探針的穿透性，但不能最大限度地保存RNA，且對(duì)組織結(jié)構(gòu)有損傷。

戊二醛：能較好地保存RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而影響了核酸探針的穿透性。多聚甲醛：仍被公認(rèn)為ISHH較為理想的固定劑。第9頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

多聚甲醛——mRNA的定位

將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1～2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過(guò)夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機(jī)或振蕩切片機(jī)切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃可保存數(shù)月之久不會(huì)影響雜交結(jié)果。第10頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三病理學(xué)活檢取材——

福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標(biāo)本對(duì)檢測(cè)DNA和mRNA有時(shí)也可獲得雜交信號(hào)。石蠟包埋切片——

由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號(hào)常低于冰凍切片，同時(shí)，在包埋的過(guò)程中可減低mRNA的含量。冷凍切片——

應(yīng)用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿(mǎn)意效果。第11頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2玻片和組織切片的處理

（1）玻片的處理熱肥皂刷洗自來(lái)水清洗清潔液中浸泡24h清水洗凈烘干95%酒精中浸泡24h蒸餾水沖洗烘干

烘箱溫度＞150℃過(guò)夜以去除RNA酶蓋玻片硅化處理錫箔紙包裹無(wú)塵存放第12頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（2）增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性根據(jù)應(yīng)用固定劑種類(lèi)、組織種類(lèi)、切片厚度和核酸探針長(zhǎng)度而定。

常用方法：稀釋的酸洗滌、去垢劑或稱(chēng)清洗劑TritonX-100、酒精或某些消化酶等。

優(yōu)點(diǎn):

通過(guò)去蛋白作用增強(qiáng)組織通透性和探針的穿透性,提高雜交信號(hào).

缺點(diǎn):

減低RNA的保存,影響組織結(jié)構(gòu)形態(tài).因此，在用量及孵育時(shí)間上應(yīng)慎為掌握。第13頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（3）減低背景染色

預(yù)雜交（Prehybridization）:

是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉非特異性雜交點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。雜交后洗滌:

采用低濃度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗滌一次，去除殘留的和內(nèi)源性的RNA酶，減低背景染色。第14頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（4）防止RNA酶的污染①在整個(gè)雜交前處理過(guò)程都需戴消毒手套。②所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫烘烤——消除RNA酶,亦可用消毒鍋。③要破壞RNA酶，最低溫度必須在150℃左右。④消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標(biāo)記和防止取出時(shí)空氣污染。⑤雜交前及雜交時(shí)所用的溶液需經(jīng)高壓消毒處理。第15頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3雜交（Hybridisation）雜交:核酸探針進(jìn)入細(xì)胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。是ISHH中關(guān)鍵的而且是最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。

雜交方式:是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。

加蓋片的目的

防止孵育過(guò)程中的高溫（50℃左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā);

硅化的蓋玻片的優(yōu)點(diǎn)是清潔無(wú)雜質(zhì)，光滑,無(wú)氣泡,不會(huì)影響組織切片與雜交液的接觸;

蓋玻片自身重量能與雜交液吸附達(dá)到覆蓋和防蒸發(fā)的作用。第16頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第17頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三雜交注意環(huán)節(jié)（1）探針的濃度原則:探針濃度必須給予該實(shí)驗(yàn)最大的信/噪比值。最佳原則應(yīng)是應(yīng)用最低探針濃度以達(dá)到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合度為目的。雜交液的量要適當(dāng):以10～20μl/每張切片為宜。雜交液過(guò)多浪費(fèi)，且液量過(guò)多常易致蓋玻片滑動(dòng)脫落,過(guò)量的雜交液含核酸探針濃度過(guò)高，易導(dǎo)致高背景染色等后果。第18頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

（2）探針的長(zhǎng)度

最佳長(zhǎng)度應(yīng)在50～100個(gè)堿基之間。探針短---易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。

500個(gè)堿基的探針---雜交時(shí)間約需20h左右。

200～500個(gè)堿基的探針---可應(yīng)用.

超過(guò)500個(gè)堿基的探針---在雜交前最好用堿或水解酶進(jìn)行水解，使其變成短的片段，達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需求的堿基數(shù)。第19頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

（3）雜交的溫度和時(shí)間

雜交溫度：

DNA或RNA需加熱或變性、解鏈后才能進(jìn)行雜交。原位雜交中，DNA、RNA探針需要的Tm分別是90℃、95℃，這種高溫對(duì)保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。因此，在雜交液中加入鹽和甲酰胺，減低Tm。根據(jù)探針的種類(lèi)不同，溫度略有差異。

第20頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三雜交時(shí)間：

16-20h或孵育過(guò)夜甲酰胺：在雜交液中占50%左右；調(diào)節(jié)雜交反應(yīng)溫度，利于保持組織形態(tài)結(jié)構(gòu)；防止低溫時(shí)非同源性片段結(jié)合；但具有破壞氫鍵的不穩(wěn)定作用。硫酸葡聚糖：在核酸雜交液中硫酸葡聚糖占10%左右；是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強(qiáng)的水合作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度；促進(jìn)雜交率，特別是對(duì)雙鏈核酸探針。甲酰胺和硫酸葡聚糖：第21頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

（4）雜交嚴(yán)格度（Hybridizationstringency）

雜交嚴(yán)格度：表示通過(guò)雜交及沖洗條件的選擇對(duì)完全配對(duì)及不完全配對(duì)雜交體的鑒別程度。錯(cuò)配對(duì)雜交的穩(wěn)定性較完全配對(duì)雜交體差，因此，通過(guò)控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強(qiáng)，但敏感性降低，反應(yīng)亦然。低嚴(yán)格度：雜交及沖洗條件在Tm35–40℃之間，高鹽或低甲酰胺濃度。大約有70%～90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，可導(dǎo)致非特異性雜交信號(hào)的產(chǎn)生。中嚴(yán)格度：Tm20-30℃的范圍。高嚴(yán)格度：為T(mén)m10-15℃，低鹽和高甲酰胺濃度。只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。第22頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。目的：通過(guò)雜交后的洗滌將組織切片中非堿基配對(duì)除去，有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。洗滌的條件：如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時(shí)間因核酸探針的類(lèi)型和標(biāo)記的種類(lèi)不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低，而溫度則由低到高。注意事項(xiàng)：漂洗過(guò)程中切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強(qiáng)了背景染色。放射性標(biāo)記探針雜交后漂洗過(guò)程中可用底片曝光的方法測(cè)背景染色作為改善漂洗程序的指針。第23頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5顯示Visualization

又稱(chēng)檢測(cè)系統(tǒng)Detectionsystem根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類(lèi)分別進(jìn)行放射自顯影或利用酶檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行不同顯色處理。放射自顯影：

圖象分析儀檢測(cè)銀粒的數(shù)量和分布的差異。

非放射性核酸探針雜交的細(xì)胞或組織：

酶檢測(cè)系統(tǒng)顯色顯微分光光度計(jì)或圖像分析儀檢測(cè)。第24頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三6對(duì)照實(shí)驗(yàn)和ISHH結(jié)果的判斷①Northern和Southern印跡雜交法。②可用結(jié)合的免疫組織化學(xué)和ISHH法從蛋白質(zhì)（或多肽）水平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應(yīng)mRNA共存于同一細(xì)胞中。

③預(yù)先將切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技術(shù)證明丟失的是DNA或RNA。事先與特異性的cRNA或cDNA進(jìn)行雜交。再進(jìn)行ISHH，其結(jié)果應(yīng)為陰性。由于同一RNA探針和組織內(nèi)mRNA序列順序是相同的，應(yīng)用其進(jìn)行ISHH，結(jié)果應(yīng)為陰性。④檢測(cè)系統(tǒng)的對(duì)照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應(yīng)在無(wú)標(biāo)記探針的情況下進(jìn)行。多因素都將影響ISHH的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第25頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（二）核酸探針1核酸探針的種類(lèi)2探針的標(biāo)記與應(yīng)用第26頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1核酸探針的種類(lèi)

（1）按標(biāo)記方式分類(lèi)

直接法和間接法：１）直接標(biāo)記探針

應(yīng)用藕聯(lián)異硫氰酸熒光素（FITC）或羅丹明Rhodamine等熒光物質(zhì)的dNTP或NTP直接標(biāo)記探針，雜交洗滌后即可在顯微鏡下檢測(cè)。

２）間接標(biāo)記探針采用生物素或地高辛等半抗原分子作為分子標(biāo)記探針，雜交洗滌后分別用抗生物素抗體和抗地高辛抗體作為配體進(jìn)行檢測(cè)，配體上分別連有不同的熒光物質(zhì)，在熒光顯微鏡下觀察分析。第27頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三兩種方法的比較：（1）直接標(biāo)記的DNA探針雜交后經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單洗滌就可顯示雜交信號(hào)，簡(jiǎn)單方便，而間接標(biāo)記的探針雜交后需通過(guò)繁瑣的檢測(cè)步驟；（2）間接標(biāo)記的探針可進(jìn)行多步驟信號(hào)放大，但其受配基親和力的影響。而直接標(biāo)記的信號(hào)放大一般受到限制，目前多用Dupon公司的TSA系統(tǒng)進(jìn)行直接標(biāo)記信號(hào)的放大。（3）對(duì)于多色FISH，往往選擇直接標(biāo)記法標(biāo)記探針。第28頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

（2）按核酸性質(zhì)分類(lèi)

①DNA探針②cDNA探針③RNA探針④寡核苷酸探針（3）按染色體上位置分類(lèi)：①重復(fù)序列探針②涂染探針③基因探針及其它第29頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2探針的標(biāo)記與應(yīng)用

切口平移法（Nicktranslation）隨機(jī)引物法(RandomPrimer)末端標(biāo)記法PCR標(biāo)記法體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法不同模板需不同標(biāo)記方法第30頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

生物素標(biāo)記cRNA探針

在原位雜交組織化學(xué)中的應(yīng)用1光敏生物素標(biāo)記cRNA探針的應(yīng)用2酶促生物素標(biāo)記cRNA探針的應(yīng)用第31頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1光敏生物素標(biāo)記cRNA探針的應(yīng)用

光敏生物素標(biāo)記核酸方法，不需昂貴的酶，只在光照10～20min，生物素就結(jié)合在DNA或RNA分子上，屬于化學(xué)修飾法，此方法簡(jiǎn)單；成本低；適用于大量制備（>50ug）。光敏生物素試劑種類(lèi)：

光生物素（乙酸鹽）補(bǔ)骨脂素生物素。生物素-聚乙二醇-當(dāng)歸素（BPA）：在長(zhǎng)波UV下它可與DNA堿基共價(jià)鍵結(jié)合。BPA反應(yīng)物與DNA結(jié)合比光敏生物素更特異，在可見(jiàn)光下它不與核酸反應(yīng)，這個(gè)特異性可使BPA只標(biāo)記粗制細(xì)胞裂解物中的核酸，而不標(biāo)記蛋白、多糖和其他細(xì)胞大分子。第32頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第33頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三光敏生物素核酸探針原位雜交組化程序如下：１石蠟切片脫蠟入水后，PBS洗；冰凍切片直接入PBS洗。２0.1mol/L甘氨酸PBS洗5min。３0.4%TrixtionX-100PBS洗15min。４1ug/ml蛋白酶K，37℃保溫30min。５4%多聚甲醛PBS固定。６0.1mol/LPBS洗2×3min。７0.25%乙酸酐10min。８2×SSC洗10min。９取10ul含相應(yīng)探針的雜交液滴于標(biāo)本上，如果是cDNA探針，則用前將探針于95℃水浴中保溫10min，馬上冰浴冷卻，然后再用。10蓋上硅化蓋玻片或蠟?zāi)ぃ?3℃濕盒保溫12—16h。第34頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三114×SSC洗脫蓋片，并在同一液中，37℃漂洗10-30min。122×SSC（含20ug/mlRNaesA，適于RNA探針）37℃洗30min。131×SSC，0.1×SSC，37℃各漂洗10-30min。140.05mol/LPBS洗4×5min。153%BSA（0.4%TritonX-100PBS配）37℃保溫30min。16堿性磷酸酶室溫1~3h。170.05mol/LPBS洗4×5min。18緩沖液Ⅰ洗2×5min。19緩沖液Ⅱ洗2×5min。20NBT/BCIP液顯色，室溫，暗處3h。2120mmol/LEDTA，pH8.0終止顯色。22甘油明膠直接封片。第35頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2酶促生物素標(biāo)記cRNA探針的應(yīng)用原理：酶促生物素標(biāo)記探針是用缺口平移法，隨機(jī)引物法或末端加尾法等把修飾的核苷酸摻入到探針DNA中，制成標(biāo)記探針，敏感度高于化學(xué)修飾法，但操作程序復(fù)雜，產(chǎn)量低，成本高。反應(yīng)步驟如下：①用PBS沖洗黏附有切片的載玻片。②將載玻片浸入0.3%H2O2，以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。③PBS洗2×3min，加入抗生物素血清和正常山羊血清，室溫1h或4℃過(guò)夜。④PBS洗2×3min。第36頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三⑤加生物素化室溫30min孵育。⑥PBS洗2×3min。⑦應(yīng)用ABC復(fù)合物與等量的1%牛血清白蛋白-PBS液混合，室溫孵育1h。⑧PBS洗2×3min。⑨DAB溶液孵育3-15min。⑩水洗，復(fù)染，脫水，透明和以甘油/PBS或DPX封固。第37頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三地高辛標(biāo)記cRNA探針的應(yīng)用第38頁(yè)，共42頁(yè)，2023年，2月20日，星期三地高辛標(biāo)記cRNA探針的應(yīng)用原理：

地高辛（Dig）為類(lèi)固醇半抗原，僅存在于洋地黃類(lèi)植物，其抗體與其它任何固醇類(lèi)似物無(wú)交叉反應(yīng)，地高辛標(biāo)記于脫氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成Dig-11-dUTP。通過(guò)隨即引物或缺口平移法，將Dig-11-dUTP與探針的核酸分子相連，構(gòu)成Dig-配基標(biāo)記的核酸探針。

將這種標(biāo)記的探針與組織、細(xì)胞或染色體