誘導(dǎo)多能干細(xì)胞研究進(jìn)展20131126課件

InducedpluripotentstemcellsPluripotentstemcellsandadultstemcells胚胎干細(xì)胞(ESCs)優(yōu)點：可分化發(fā)育成任何細(xì)胞類型，擴(kuò)增能力強(qiáng)；缺點：(1)供體卵母細(xì)胞的來源困難,ES細(xì)胞建系效率低，無法建立所有個體的ES細(xì)胞系；(2)免疫排斥反應(yīng)；(3)ES細(xì)胞具有成瘤性；(4)倫理學(xué)爭議；干細(xì)胞替代治療前提條件能產(chǎn)生足夠數(shù)量的細(xì)胞能產(chǎn)生特定的組織細(xì)胞類型能整合至病損組織并發(fā)揮修復(fù)功能無免疫排斥------能否獲得來源于自身的多能干細(xì)胞?------能否將自身成體細(xì)胞逆分化為多能干細(xì)胞？骨髓來源的極小胚胎干細(xì)胞（VSELSCs）??Leukemia(2006)20,857–869逆分化--細(xì)胞核重編程技術(shù)核移植（cloning）細(xì)胞融合（cellfusion）細(xì)胞轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)（iPS）卵母細(xì)胞的核移植將一個活細(xì)胞核成功地移植到已經(jīng)去核的蛙卵中的實驗，首次證明可以通過實驗方法來逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的分化狀態(tài)。Briggs和King首次成功實現(xiàn)通過移植Ranapipiens（豹紋蛙

）的囊胚細(xì)胞核產(chǎn)生會游動的蝌蚪。按照同樣的實驗方法，其他科學(xué)家發(fā)現(xiàn)即使用于移植的核是來自于完全分化的細(xì)胞，也能得到發(fā)育完全正常并且具有生育能力的雄性和雌性青蛙，在該實驗中是供體蛙的小腸上皮細(xì)胞。這些實驗結(jié)果告訴人們，細(xì)胞分化是可以被完全逆轉(zhuǎn)的。這一領(lǐng)域的突破來自于多利羊的實驗。

細(xì)胞核移植的效率研究發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞重編程體細(xì)胞核的效率最高。與這個重編程伴隨而生的機(jī)制包括：全能性基因的表達(dá)、異染色體的開放；分化標(biāo)記的去除，如DNA甲基化；組蛋白修飾以及組蛋白交換等等。這些機(jī)制發(fā)生的基礎(chǔ)是，受精卵擁有能引起上述效應(yīng)的高濃度特定蛋白。核移植重編程的機(jī)理核移植重編程的局限性克隆的效率極低；產(chǎn)生的許多后代在各個階段都體現(xiàn)出嚴(yán)重的發(fā)育異常；由于需要卵母細(xì)胞/ES細(xì)胞，有倫理學(xué)爭議；制約了核移植技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。

將成熟的體細(xì)胞與多能干細(xì)胞（ES細(xì)胞）融合，或者用胚胎干細(xì)胞提取物來處理體細(xì)胞，也可以在一定程度上使體細(xì)胞發(fā)生重編程。利用這兩種方法，可以實現(xiàn)某些多功能性標(biāo)志分子的重新表達(dá)和多種分化潛能的獲得。細(xì)胞融合重編程細(xì)胞融合重編程的局限性體細(xì)胞與多能干細(xì)胞的融合率較低融合之后的細(xì)胞具有兩套染色體（4倍體）在移植后會發(fā)生排斥現(xiàn)象，制約了細(xì)胞融合的臨床應(yīng)用。有沒有相對簡單，又可擺脫材料來源和倫理學(xué)諸多限制，重編程的效率和程度都十分可觀的新方法呢？基因?qū)氲霓D(zhuǎn)分化現(xiàn)象Weintraub發(fā)現(xiàn)在一系列非肌肉細(xì)胞導(dǎo)入肌肉發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子MyoD后，這些細(xì)胞都轉(zhuǎn)變成為肌肉細(xì)胞。一旦轉(zhuǎn)變成為肌肉細(xì)胞以后，MyoD就會激活自身的持續(xù)表達(dá)，外源MyoD的過表達(dá)就不再是必需的了。24個基因3組多潛能性誘導(dǎo)因子：第一組是特異性表達(dá)在ESCs的轉(zhuǎn)錄因子，包括Nanog，Oct3/4，Sox2，UTF1，Sall4，Sox15和Rex1；第二組是在ESCs中起重要作用的生長和腫瘤相關(guān)的基因產(chǎn)物，包括c-Myc，Stat3，β-catenin，Grb2，KLF4，TCL1andEras；第三組也是特異性表達(dá)在ESCs但功能仍不確定的因子，包括ECAT1，ESG1，F(xiàn)bx15，DNMT3L，ECAT8，GDF3，ECAT15—1，ECAT15—2，F(xiàn)thl17和Stella。-4day0day3day5dayRetrovirustransductionPlateonFeederESmediumiPSgeneration5*104hiPSCsTRA-1-60,200×SSEA4,200×Oct4,200×200×100×ab,200×cdefiPS體內(nèi)外分化能力iPS研究進(jìn)展（1）iPS細(xì)胞的建系MouseiPScellsYamanaka.S..Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell,2006.京都大學(xué)

HumaniPScellsYamanakaS.Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell,2007.YuJ,ThomsonJA.Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.Science,2007.威斯康辛大學(xué)

京都大學(xué)

MonkeyiPScellsDengHK.Generationofinducedpluripotentstemcellsfromadultrhesusmonkeyfibroblasts.CellStemCell.2008.北京大學(xué)

Retrovirus-mediatedintroductionofmonkeytranscriptionfactorsOCT4,SOX2,KLF4,andc-MYC.RatiPScellsDingS.Generationofratandhumaninducedpluripotentstemcellsbycombininggeneticreprogrammingandchemicalinhibitors.CellStemCell.2009.加州大學(xué)舊金山分校豬iPSCynomolgus

monkey,marmoset

monkeys,sheep,canine,

rabbit,goat,bovine,horse,quailiPS技術(shù)的進(jìn)展(2)整合型：逆轉(zhuǎn)錄病毒:Oct4,Sox2,Klf4,c-mYC慢病毒:Oct4,Sox2,Nanog,Lin28非整合型腺病毒,仙臺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Cre-LoxP重組系統(tǒng),PiggyBac轉(zhuǎn)座子,Episomalvectors

mRNA,miRNA,重組蛋白小分子小分子：VPA,CHIR99021,616452,Tranylcypromine,FSK,DZNep效率：0.2%VPA:組蛋白去乙酰化酶抑制劑；CHIR99021:GSK3抑制劑；616452，TGFb抑制劑，替代SOX2；tranylcypromine：anH3K4demethylationinhibitor；Forskolin：cAMPagonists，替代OCT4；DZNep：組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑；SeesawmodelOCT4andGATA3CanInhibitaGroupofECTGenesthatAreElevatedbySKMduringReprogramming;SOX2andItsSubstitutesAttenuatetheExpressionofMEGenesthatAreElevatedbyOKMduringReprogramming;GATA3,GATA6,PAX1,andSOX1orSOX3+KMGATA6,GMNN+KMiPS技術(shù)的進(jìn)展(3)iPS形成效率的提高６因子法組蛋白乙?；敢种苿篤PA；組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑：BIX-01294,5-AZA;下調(diào)P53表達(dá)

VitC信號通路抑制劑：MAPK-PD0325901;GSK3-Chir99021;低氧：５％VitC:降低P53表達(dá)，效率可達(dá)10%

PeiD.VitaminCenhancesthegenerationofmouseandhumaninducedpluripotentstemcells.

CellStemCell.2010中科院廣州下調(diào)ROS的產(chǎn)生降低P53的表達(dá)ActivationofTLR3signalingLeeJ.Activationofinnateimmunityisrequiredforefficientnuclearreprogramming.Cell2012Nature.

2013Oct3;502(7469):65-70.進(jìn)展（4）Mbd3/NuRD(nucleosomeremodellinganddeacetylation)repressorcomplexMbd3在所有體細(xì)胞表達(dá)。Mbd3干擾后7天可得到人或小鼠iPS，效率接近100%Overexpression

of

Cx43

can

enhance

human

iPS

cells

generation

AblationofendogenousCx43Cx43overexpressionNTC10d(bar=50μm)HumMolGenet.2013Jun1;22(11):2221-33.

NewmarkerforiPSMarker1negativeMarker1positiveMarker1positiveMarker1negativeInvivoiPScellspresentaremarkablecapacitytoundergotrophectodermlineagedifferentiation,apropertythatislargelyabsentinEScellsNature.

2013Sep11iPS技術(shù)的進(jìn)展(3)成體細(xì)胞包括：皮膚成纖維細(xì)胞，血細(xì)胞，肌肉細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞，羊水細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，腦膜細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞，脂肪干細(xì)胞，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞等；iPS技術(shù)的進(jìn)展(４)iPS全能性的鑒定小鼠：Oct4,SSEA-1,畸胎瘤，嵌合體，四倍體實驗；人：Oct4,SSEA-4,畸胎瘤小鼠iPS四倍體實驗ZhouQ.iPScellsproduceviablemicethroughtetraploidcomplementation.Nature,2009.GaoSR.iPScellscansupportfull-termdevelopmentoftetraploidblastocyst-complementedembryos.CellStemCell,2009.中科院北京北京生科院中科院北京北京生科院小鼠iPS四倍體實驗人或者動物都是二倍體，在胚胎發(fā)育到2-細(xì)胞階段的時候，可用電融合的方法使兩個細(xì)胞融合為一個細(xì)胞，這樣就獲得了四倍體胚胎，四倍體胚胎是不能正常發(fā)育的，但是可以形成胎盤，如果將一種多能干細(xì)胞注入四倍體囊胚，可以獲得一個完整的動物個體，那證明移進(jìn)去的干細(xì)胞是全能的干細(xì)胞。iPS技術(shù)的進(jìn)展(5)XuY.Immunogenicityofinducedpluripotentstemcells.Nature,2011.加州大學(xué)圣地亞哥分校小鼠的ES/iPS細(xì)胞移植到了提供起源細(xì)胞的小鼠體內(nèi)。發(fā)現(xiàn)移植的ES細(xì)胞形成了畸胎瘤。然而，由于受到宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，大部分iPS細(xì)胞未能形成畸胎瘤。同時他們也發(fā)現(xiàn)由iPS形成的畸胎瘤中某些基因呈高水平表達(dá)。其中的Zg16及Hormad1兩個基因的異常表達(dá)可直接導(dǎo)致遭受特異的免疫攻擊。非整合型iPS受到的排斥比整合型iPS低。iPS技術(shù)的進(jìn)展(6)疾病特異性iPS遺傳性疾?。号两鹕　⒑嗤㈩D舞蹈病、范可尼貧血、1型糖尿病、家族性自主神經(jīng)功能障礙、α/β地中海貧血、克氏綜合癥、21三體綜合癥、肥厚性心肌病、長QT綜合癥、腓骨肌萎縮癥、SMA等；探討發(fā)病機(jī)制及篩選藥物、基因修復(fù)等iPS細(xì)胞的應(yīng)用安全性研究自殺基因的應(yīng)用，啟動子的選擇特意表面抗原小分子藥物或化合物iPS技術(shù)的進(jìn)展(7)自殺基因的應(yīng)用XiangP.Protectingagainstwaywardhumaninducedpluripotentstemcellswithasuicidegene.Biomaterials,2012.XuY.Ascalableapproachtopreventteratomaformationofhumanembryonicstemcells.JBiolChem,2012.中山大學(xué)加州大學(xué)自殺基因的應(yīng)用XiangP.Protectingagainstwaywardhumaninducedpluripotentstemcellswithasuicidegene.Biomaterials,2012.XuY.Ascalableapproachtopreventteratomaformationofhumanembryonicstemcells.JBiolChem,2012.AsingletreatmentofhESC-derivedmixedpopulationwithchemicalinhibitorsofsurvivin(e.g.,quercetinorYM155)inducedselectiveandcompletecelldeathofundifferentiatedhPSCs.Incontrast,differentiatedcelltypesderivedfromhPSCssurvivedwellandmaintainedtheirfunctionality.Wefoundthatquercetin-inducedselectivecelldeathiscausedbymitochondrialaccumulationofp53andissuf?cienttopreventteratomaformationaftertransplantationofhESC-orhiPSC-derivedcells.ProcNatlAcadSciUSA.

2013Aug27;110(35):E3281-90iPS存在問題（8）GeneticinstabilityTumorigenicityImmunogenicityChromosomalanalysesofESCs/iPSCsNatBiotechnol.2011Apr;29(4):313-4.比較了ES和iPS，病毒方法和episomal方法的染色體突變情況。+8,+12,+12P,+17,+X意思為3體，多了一條染色體。SomaticcodingmutationsinhiPSCsNature.2011March3;471(7336):63–67.對來自7個實驗室利用5種不同方法誘導(dǎo)人類成纖維細(xì)胞生成的22種iPS細(xì)胞系進(jìn)行了外顯子組測序。研究人員在這些iPS細(xì)胞中確認(rèn)了124個點突變。鑒別了多個有可能改變蛋白質(zhì)功能的錯義突變，同時發(fā)現(xiàn)一些點突變富集于與癌癥相關(guān)的基因中。研究人員利用超深度測序（ultradeepsequencing）證實約一半的突變以低水平存在于起源的成纖維細(xì)胞群中，而另一半則發(fā)生在重編程過程中或之后。這些突變負(fù)荷有可能是在重編程和培養(yǎng)過程中受到了選擇作用而并非重編程固有誘變作用的影響。黃色標(biāo)記為episomal方法