腫瘤微環(huán)境中腹腔巨噬細胞的流式檢測方法

腫瘤微環(huán)境中腹腔巨噬細胞的流式檢測方法步驟準(zhǔn)備：大小BD管，10ml空針，1ml空針，無菌生理鹽水或PBS，紅細胞裂解液（4度冰箱保存）。流式管若干。流式抗體：CD45，CD11b，F(xiàn)4/80，CD206，每種抗體均有4中不同的顏色（Percp-cy5.5,APC,FITC,PE),選抗體顏色時每種抗體顏色不能重復(fù)（需要提前一天或半天檢查抗體是否足夠，若不夠，需及時向管家補齊，此點很重要！）。各種型號的槍和槍尖。冰盒（有蓋的，可以避光）。離心機。收集腹腔細胞：15mlBD管收集腹水或腹腔灌洗液，離心（1500rpm，3min），棄上清。裂紅：若腹水中有紅細胞時則裂紅，若無，則省略此步驟。方法：紅細胞裂解液4ml-8ml，冰上裂解3-10min，離心，棄上清。PBS4ml洗一次。說明：根據(jù)紅細胞多少決定裂紅液的量和時間，但時間不能過長。若一次沒有裂干凈，最好先離心，用PBS洗之后再裂第二次，裂紅液持續(xù)作用的時間不能過長。PBS重懸：1ml重懸，細胞計數(shù)（按魏老師的說法是需要計數(shù)的）。將BD管中的細胞轉(zhuǎn)移至流式管中，每個流式管的細胞約1x106個。一般情況，每只老鼠腹腔細胞是多于1x106個的，剩下的細胞可作為單染或空白管的細胞來源。孵抗體：巨噬細胞膜上直標(biāo)抗體選擇CD45，CD11b，F(xiàn)4/80，CD206，冰上避光孵育30min，之后的步驟均避光較好。說明：染色分為：樣品管，空白管，單染管。樣品管每種抗體加1ul，如9個樣品管，可先將每種抗體10ul，加入干凈的小ep管中混勻后，再每個樣品管加4ul?？瞻坠芎蛦稳竟艿募毎擅總€樣品的剩余細胞混合而成?？瞻坠芗词裁炊疾蝗?。單染管只加一種抗體，如CD45單染管只加CD45抗體。PBS1ml洗一次。PBS重懸，novocyte上機：根據(jù)細胞量的多少，加入200-300ulPBS重懸。多則多加，少則少加。腹腔巨噬細胞流式結(jié)果分析NatureImmunology

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JelenaSBezbradica,etal.ArolefortheITAMsignalingmoduleinspecifyingcytokine-receptorfunctionsBlood

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Kurotaki,etal.EssentialroleoftheIRF8-KLF4transcriptionfactorcascadeinmurinemonocytedifferentiationF4/80CD11b圈門方法注意事項1/提取腹腔細胞至細胞染色時間不能太長，因細胞放久了不好，另外巨噬細胞可能發(fā)生變化，比如說它可以吞噬紅細胞，向II型轉(zhuǎn)