微生物基礎(chǔ)知識與生產(chǎn)環(huán)境控制

微生物基礎(chǔ)知識與生產(chǎn)環(huán)境控制第1頁/共60頁一.微生物基礎(chǔ)知識（一）什么是微生物是廣泛存在于自然界當中一群個體微?。ㄖ睆叫∮?mm）、結(jié)構(gòu)簡單、肉眼看不見，必須借助光學或電子顯微鏡放大數(shù)百至數(shù)萬倍才能觀察到的生物。

第2頁/共60頁（二）微生物的類群和形態(tài)結(jié)構(gòu)

微生物根據(jù)其生物學特性可分為細菌、真菌（霉菌和酵母菌）、支原體、立克次體、螺旋體、衣原體、放線菌和病毒2.根據(jù)其有無細胞以及細胞核的結(jié)構(gòu)分為三大類型原核細胞型：細菌、放線菌、支原體真核細胞型：真菌非細胞型微生物：病毒

第3頁/共60頁

細菌

細菌是一類細胞細而短、結(jié)構(gòu)簡單、細胞壁堅韌，以二分裂方式繁殖的原核微生物，分布較廣泛。

細菌的形態(tài)細菌有球形、桿形和螺形。根據(jù)外形不同分為，球菌、桿菌和螺菌。

第4頁/共60頁

細菌的結(jié)構(gòu)細菌的基本結(jié)構(gòu)：細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)。細菌的特殊結(jié)構(gòu)：（某些細菌具備的結(jié)構(gòu)）莢膜、鞭毛、菌毛、芽孢芽孢：某些細菌在一定環(huán)境條件下，細胞質(zhì)脫水濃縮，在菌體內(nèi)形成一個圓形或橢圓形的小體，稱為芽孢。能形成芽孢的細菌多為革蘭氏陽性桿菌，如破傷風桿菌。第5頁/共60頁

細菌的菌落單個或少數(shù)細菌細胞生長繁殖后，會形成以母細胞為中心的一堆肉眼可見、有一定形態(tài)構(gòu)造的子細胞集團，這就是菌落。細菌的菌落特性常表現(xiàn)為濕潤、粘稠、光滑、較透明、易挑取、質(zhì)地均勻以及菌落正反面或邊緣與中央部位顏色一致等。第6頁/共60頁第7頁/共60頁

真菌（霉菌、酵母菌）霉菌、酵母菌的形態(tài)、大小和結(jié)構(gòu)霉菌、酵母菌的繁殖霉菌、酵母菌的菌落第8頁/共60頁3、霉菌

霉菌是絲狀真菌的俗稱，意即“發(fā)霉的真菌”，它們往往能形成分枝繁茂的菌絲體，但又不象蘑菇那樣產(chǎn)生大型的子實體。在潮濕溫暖的地方，很多物品上長出一些肉眼可見的絨毛狀、絮狀或蛛網(wǎng)狀的菌落，那就是霉菌。第9頁/共60頁霉菌的形態(tài)、大小和結(jié)構(gòu)

霉菌的菌絲是構(gòu)成霉菌營養(yǎng)體的基本單位。菌絲是一種管狀的細絲，把它放在顯微鏡下觀察，很像一根透明膠管，它的直徑一般為3-10

微米，比細菌和放線菌的細胞約粗幾倍到幾十倍。菌絲可伸長并產(chǎn)生分枝，許多分枝的菌絲相互交織在一起，就叫菌絲體。第10頁/共60頁霉菌的菌落

由于霉菌的菌絲較粗而長，因而霉菌的菌落較大，有的霉菌的菌絲蔓延，沒有局限性，其菌落可擴展到整個培養(yǎng)皿，有的種則有一定的局限性，直徑1-2厘米或更小。菌落質(zhì)地一般比放線菌疏松，外觀干燥，不透明，呈現(xiàn)或緊或松的蛛網(wǎng)狀、絨毛狀或棉絮狀；菌落與培養(yǎng)基的連接緊密，不易挑取；菌落正反面的顏色和邊緣與中心的顏色常不一致。第11頁/共60頁霉菌的繁殖

有性繁殖和無性繁殖兩種以無性繁殖為主第12頁/共60頁霉菌的菌落第13頁/共60頁4、酵母菌

酵母菌

提起酵母菌這個名稱，也許有人不太熟悉，但實際上人們幾乎天天都在享受著酵母菌的好處。因為我們每天吃的面包和饅頭就是有酵母菌的參與制成的；我們喝的啤酒，也離不開酵母菌的貢獻，酵母菌是人類實踐中應(yīng)用比較早的一類微生物，我國古代勞動人民就利用酵母菌釀酒；酵母菌的細胞里含有豐富的蛋白質(zhì)和維生素，所以也可以做成高級營養(yǎng)品添加到食品中，或用作飼養(yǎng)動物的高級飼料。

第14頁/共60頁

酵母菌生長環(huán)境：酵母菌在自然界中分布很廣，尤其喜歡在偏酸性且含糖較多的環(huán)境中生長，例如，在水果、蔬菜、花蜜的表面和在果園土壤中最為常見。第15頁/共60頁酵母菌的形態(tài)、大小和結(jié)構(gòu)

酵母菌是單細胞真核微生物。酵母菌細胞的形態(tài)通常有球形、卵圓形、臘腸形、橢圓形、檸檬形或藕節(jié)形等。比細菌的單細胞個體要大得多，一般為1-5微米×5-30微米。酵母菌無鞭毛，不能游動。酵母菌具有典型的真核細胞結(jié)構(gòu),有細胞壁、細胞膜、細胞核、細胞質(zhì)、液泡、線粒體等，有的還具有微體。第16頁/共60頁酵母菌的菌落

大多數(shù)酵母菌的菌落特征與細菌相似，但比細菌菌落大而厚，菌落表面光滑、濕潤、粘稠，容易挑起，菌落質(zhì)地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一，菌落多為乳白色，少數(shù)為紅色，個別為黑色。第17頁/共60頁

酵母菌的繁殖

1、芽殖

2、裂殖

3、孢子生殖第18頁/共60頁

酵母菌的無性繁殖芽殖：酵母菌最常見的無性繁殖方式是芽殖。芽殖發(fā)生在細胞壁的預定點上，此點被稱為芽痕，每個酵母細胞有一至多個芽痕。成熟的酵母細胞長出芽體，母細胞的細胞核分裂成兩個子核，一個隨母細胞的細胞質(zhì)進入芽體內(nèi)，當芽體接近母細胞大小時，自母細胞脫落成為新個體，如此繼續(xù)出芽。如果酵母菌生長旺盛，在芽體尚未自母細胞脫落前，即可在芽體上又長出新的芽體，最后形成假菌絲狀。

酵母菌的芽殖過程：

1．泡；2．小管；3．核；4．液泡

酵母菌假菌絲的形成：

1、2、3、4·······

是出芽的順序

第19頁/共60頁

酵母菌的有性繁殖酵母菌是以形成子囊和子囊孢子的方式進行無性繁殖的。兩個臨近的酵母細胞各自伸出一根管狀的原生質(zhì)突起，隨即相互接觸、融合，并形成一個通道，兩個細胞核在此通道內(nèi)結(jié)合，形成雙倍體細胞核，然后進行減數(shù)分裂，形成4個或8個細胞核。每一子核與其周圍的原生質(zhì)形成孢子，即為子囊孢子，形成子囊孢子的細胞稱為子囊。酵母菌子囊孢子的形成過程：1、2、3、4：兩個細胞結(jié)合；5：接合子；6、7、8、9：核分裂；10、11：核形成孢子

第20頁/共60頁裂殖：是少數(shù)酵母菌進行的無性繁殖方式，類似于細菌的裂殖。其過程是細胞延長，核分裂為二，細胞中央出現(xiàn)隔膜，將細胞橫分為兩個具有單核的子細胞。第21頁/共60頁

酵母菌的菌落

第22頁/共60頁（三）微生物特點

1.個體小微生物的個體極其微小，必須借助光學顯微鏡放大幾十倍、幾百倍、上千倍才能看清楚。桿菌的寬度是0.5um，因此80個桿菌“肩并肩”排列，也只有1根頭發(fā)絲寬度。第23頁/共60頁2.種類多、分布廣自然界中到處都有微生物存在，比如在水中、空氣、土壤中等。幾乎無處不有，無孔不入。在人的皮膚上、口腔、腸道里都有許多微生物。微生物聚集最多的是土壤中，微生物總數(shù)的70～90%。空氣里懸浮著無數(shù)細小的塵埃和水滴，他們是微生物在空氣中的藏身之地。第24頁/共60頁3.生長旺、繁殖快微生物有著驚人的繁殖速度，大多數(shù)微生物幾十分鐘就可以繁殖1代，如條件適宜時，細菌一般每

20～30分鐘就可以繁殖1次，由一個細菌分裂成兩個細菌。

第25頁/共60頁4.適應(yīng)強、易變異微生物多以單細胞形式獨立存在，整個細胞與外界環(huán)境直接接觸，因而易受環(huán)境條件變化的影響發(fā)生變異。第26頁/共60頁

5.結(jié)構(gòu)簡單微生物主要以非細胞、單細胞、簡單多細胞或細胞群體的形式存在。例如細菌的一個細胞就是一個獨立的生物體，它的全部生命活動，如生長、呼吸、繁殖等，都是靠這一細胞來完成的。第27頁/共60頁（四）微生物的營養(yǎng)

水分碳源氮源無機鹽類生長因子第28頁/共60頁（五）微生物生長的影響因素

1.營養(yǎng)物細菌在生長中，所需要的營養(yǎng)物質(zhì)即水分、碳源、氮源、無機鹽和生長因子。

2.pH值每一種微生物都有一最適PH值范圍，在此范圍內(nèi)微生物生長速率最大。許多自然環(huán)境的PH值在5～

9之間。第29頁/共60頁3.溫度與醫(yī)藥相關(guān)的細菌大多數(shù)是嗜溫的，它們生長的最適合溫度在環(huán)境溫度與體溫37℃.4.氧氣根據(jù)細菌對氧氣的不同要求，可分為如下幾種：專性好氧菌、兼性厭氧菌、耐氧菌、專性厭氧菌

第30頁/共60頁二.怎樣控制微生物

消毒與滅菌消毒與滅菌是微生物實驗技術(shù)中最基本的操作，從事藥品生產(chǎn)和檢驗的人員都應(yīng)當了解消毒與滅菌的基本概念、方法及其意義，必須嚴格遵守有關(guān)操作規(guī)程，否則不僅對生產(chǎn)與檢驗工作有很大影響，會影響產(chǎn)品的質(zhì)量，危害自身及社會和人民的生命安全。第31頁/共60頁

基本概念

消毒：是指對病原微生物的繁殖體致死作用，但不能殺死芽孢等全部微生物。所以消毒是不徹底的，不能代替滅菌。滅菌：使達到無菌狀態(tài)的方法。用物理和化學方法殺滅傳播媒介上所有微生物，使其達到無菌。通常是指殺滅或除去全部活的微生物，包括繁殖體和芽孢。第32頁/共60頁消毒與滅菌共性及不同共性：殺滅微生物以控制其污染和防止傳播第33頁/共60頁

消毒與滅菌區(qū)別：

殺滅微生物完全性不同。滅菌要求完全殺滅微生物，滅菌后的物品不應(yīng)含任何活的微生物，消毒是不完全的，只能殺滅一分病原微生物。

方法不同。滅菌方法有多種多樣，消毒常常是借助化物質(zhì)。

效果檢查的不同。滅菌效果是用無菌檢查法檢測，而消毒效果是以消毒劑的效價來評定。第34頁/共60頁常用的消毒劑

75%酒精

0.1%新潔爾滅

第35頁/共60頁常用的滅菌方法干熱滅菌法

濕熱滅菌法輻射滅菌法過濾除菌法氣體滅菌法第36頁/共60頁

干熱滅菌法

常見的有火焰、燒灼、干烤和紅外線滅菌等。

濕熱滅菌法

通過熱蒸汽或沸水使蛋白質(zhì)變性而殺滅微生物的方法，稱為濕熱滅菌法。常見的有煮沸、巴氏消毒、流通蒸汽滅菌等。濕熱穿透力強，滅菌效果較干熱好。

第37頁/共60頁

高壓蒸汽滅菌

工作原理：常壓下，水的沸點是100℃，如果在密封緊閉的高壓蒸鍋內(nèi)不使蒸汽外溢，由于連續(xù)加熱，鍋內(nèi)蒸汽不斷加大，溫度逐漸上升。當鍋內(nèi)蒸汽達到平衡時，就為完全飽和蒸汽。飽和蒸汽含量高，穿透力也大，能迅速殺滅細菌和芽孢。第38頁/共60頁（三）生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)控GMP規(guī)定：進入潔凈室（區(qū)）的空氣必須凈化，并根據(jù)生產(chǎn)工藝要求劃分空氣潔凈級別。潔凈室（區(qū)）內(nèi)空氣的微生物數(shù)和塵粒數(shù)應(yīng)定期進行監(jiān)測。第39頁/共60頁相關(guān)概念菌落（colonyformingunits）單個微生物在適宜固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長繁殖到一定程度；形成肉眼可見有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞的群落。一個細菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一個或多個菌細胞生長繁殖而成。因此供試品中所測得的菌落數(shù)，實際為菌落形成單位數(shù)(colonyformingunity，cfu)，不應(yīng)理解為細菌、霉菌、酵母菌的個數(shù)。

第40頁/共60頁

微生物限度檢查法

系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、受微生物污染程度的方法。也是評價生產(chǎn)企業(yè)的藥用原料、輔料、設(shè)備、器具、工藝流程、環(huán)境和操作者衛(wèi)生狀況的重要手段和依據(jù)。第41頁/共60頁

潔凈室（區(qū)）

對塵粒及微生物污染規(guī)定需要進行環(huán)境控制的房間和區(qū)域。其建筑結(jié)構(gòu)、裝備及其使用均具有減少對該區(qū)域內(nèi)污染源的介入、產(chǎn)生和滯留的功能。

單向流（簡稱層流）沿著平行流線，以單一通路以一定流速向單一方向流動的氣流。第42頁/共60頁

靜態(tài)測試

潔凈室（區(qū)）凈化空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)已處于正常運行狀態(tài)，工藝設(shè)備已安裝，潔凈室（區(qū)）內(nèi)沒有生產(chǎn)人員的情況下進行的測試。

動態(tài)測試

潔凈室（區(qū)）已處于正常生產(chǎn)狀態(tài)下進行的測試。

第43頁/共60頁潔凈空氣主要監(jiān)測項目及參數(shù)1.溫度、相對濕度、壓差

潔凈室（區(qū)）的溫度和相對濕度應(yīng)與藥品生產(chǎn)工藝要求相適應(yīng)，無特殊要求時，溫度應(yīng)控制在

18～26℃，相對濕度在45%～65%。

空氣潔凈級別不同的相鄰房間之間靜壓差應(yīng)大于

5pa，潔凈室（區(qū)）與室外大氣壓差應(yīng)大于10pa，并應(yīng)有指示壓差的裝置，相同潔凈級別區(qū)域，產(chǎn)塵量大的操作室應(yīng)保持相對負壓。第44頁/共60頁2.沉降菌

原理：通過自然沉降原理收集在空氣中生物粒子與培養(yǎng)基平皿，經(jīng)若干時間，在適宜的條件下讓其繁殖到可見的菌落進行計數(shù)，以平板培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)來判定潔凈環(huán)境內(nèi)的活微生物數(shù)，并以此來評定潔凈室（區(qū)）的潔凈度。第45頁/共60頁

采樣：將已準備好的培養(yǎng)皿按規(guī)定位置擺放，打開培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)皿表面暴露0.5h,再將培養(yǎng)皿蓋蓋上后倒置。全部采樣結(jié)束后經(jīng)培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間不少于48小時。每批培養(yǎng)基應(yīng)有對照試驗，檢驗培養(yǎng)基本身是否污染?？蛇x定每批3只作對照培養(yǎng)。第46頁/共60頁

結(jié)果評定

用于平均菌落數(shù)判斷潔凈室空氣的微生物。潔凈室內(nèi)的平均菌落數(shù)必須低于所選定的評定標準。若某潔凈室內(nèi)的平均菌落數(shù)超過評定標準，則必須對此區(qū)域先進行消毒，然后重新采樣兩次，測試結(jié)果必須合格。第47頁/共60頁

合格標準

靜態(tài)：百級≤1CFU／皿；萬級≤3CFU／皿十萬級≤10CFU／皿動態(tài)：百級＜3CFU／皿；萬級≤50CFU／皿

第48頁/共60頁

注意事項：溫、濕度，壓差、風速及換氣次數(shù)應(yīng)符合規(guī)定。靜態(tài)監(jiān)測試時，測試人員不得超過2人。沉降菌監(jiān)測每次空氣凈化系統(tǒng)至少正常運行30分鐘以上。第49頁/共60頁

說明：為了盡可能獲得可靠性數(shù)據(jù)沉降碟放置時間不宜過短。美國和歐盟相關(guān)標準指南中建議，一般情況下，將沉降碟暴露于被測環(huán)境中4小時。不能僅僅通過對沉降菌監(jiān)測可以說明空氣環(huán)境潔凈度符合要求，因為有些微生物顆粒不沉降，漂浮在空氣中，對于懸浮在空氣中的生物性微粒要通過浮游菌監(jiān)測，兩者結(jié)合來評價潔凈區(qū)空氣環(huán)境中微生物。第50頁/共60頁

3.浮游菌測試（空氣微生物監(jiān)測）

浮游菌測試是通過收集懸浮在空氣中的生物性微粒，借助采樣器，通過專門的培養(yǎng)基在適宜的生長條件下，讓其繁殖到可見菌落進行計數(shù)。專用設(shè)備，能對單位體積空氣內(nèi)的微生物數(shù)量進行定量評價，因而在制藥企業(yè)得到應(yīng)用，能保證取樣的準確性及數(shù)據(jù)的可靠性。狹縫式取樣器儀器原理不做介紹第51頁/共60頁采樣：日常監(jiān)測最小采樣量100級采樣量需要滿足600L／次10000級采樣量需要滿足400L／次監(jiān)測頻率：每月進行全面監(jiān)測1次第52頁/共60頁

結(jié)果計算

用計數(shù)方法得出各個培養(yǎng)皿的菌落數(shù)。每個測點的浮游菌平均濃度的計算：平均濃度（個／m3）=菌落數(shù)／采樣量采樣量=50L／min×采樣時間第53頁/共60頁

結(jié)果評定

用浮游菌平均濃度判斷潔凈室（區(qū)）空氣中的微生物。每個測點的浮游菌平均濃度低于所選定的評定標準中關(guān)于細菌濃度的界限。若某測點的浮游菌平均濃度超過評定標準，則必須對此區(qū)域先進行消毒，然后重新采樣兩次，測試結(jié)果必須合格。第54頁/共60頁浮游菌合格標準

百級≤5CFU／m3；萬級≤100CFU／m3

第55頁/共60頁

注意事項：測試前，被測試潔凈室（區(qū)）已經(jīng)過消毒，溫度、濕度必須達到規(guī)定的要求，靜壓差、換氣次數(shù)、空氣流速、必須控制在規(guī)定值內(nèi)。測試狀態(tài)有靜態(tài)和動態(tài)兩種，在報告中應(yīng)注明。靜態(tài)測試時室內(nèi)人員不得多于2人第56頁/共60頁4.表面微生物監(jiān)測和人員衛(wèi)生監(jiān)測

目前采用表