微生物學(xué)的資料

微生物學(xué)的資料第1頁(yè)/共111頁(yè)微生物遺傳學(xué)涉及部分真核生物，所有的原核生物，以及病毒的遺傳；介紹微生物的遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、遺傳信息的表達(dá)與調(diào)控、遺傳變異的基本規(guī)律；介紹通過基因操作改變微生物的遺傳信息從而有效地控制或利用微生物的基本策略。

第2頁(yè)/共111頁(yè)第一節(jié)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)及其特性 一、遺傳物質(zhì)的鑒定 二、脫氧核糖核酸 三、基因組DNA和染色體 四、染色體以外的遺傳因子第3頁(yè)/共111頁(yè)經(jīng)典試驗(yàn)1.肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

圖8.1（a）S型和R型細(xì)胞侵染試驗(yàn)一、遺傳物質(zhì)的鑒定第4頁(yè)/共111頁(yè)分離后的S型細(xì)胞物質(zhì)對(duì)R型細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

圖8.1（b）第5頁(yè)/共111頁(yè)第6頁(yè)/共111頁(yè)第7頁(yè)/共111頁(yè)結(jié)論細(xì)胞生物的遺傳物質(zhì)是雙鏈DNA病毒的遺傳物質(zhì)可以是單鏈的或雙鏈的DNA或RNA，即：ssDNA，dsDNA，ssRNA或dsRNA。第8頁(yè)/共111頁(yè)二、脫氧核糖核酸1．核酸的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)

2．DNA的復(fù)制方式

3．DNA的理化性質(zhì)第9頁(yè)/共111頁(yè)1．核酸的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)

Watson和Crick在1953年描述了DNA的結(jié)構(gòu)模型：

DNA分子是由兩條相互平行、方向相反的多核苷酸單鏈以右手螺旋方向相互纏繞而形成的雙螺旋。脫氧核糖和磷酸構(gòu)成的主鏈位于外圍，通過氫鍵相互交聯(lián)的堿基處于雙螺旋的內(nèi)部。腺嘌呤與胸腺嘧啶配對(duì)，鳥嘌呤與胞嘧啶配對(duì)；兩條單鏈互補(bǔ)；一條鏈的堿基序列限定了另一條鏈的序列。第10頁(yè)/共111頁(yè)RosalindFranklin

的貢獻(xiàn)

WatsonandCrickproposedDNAstructurein1953bybuildingmodelsbasedonchemicalandphysicaldatathathadbeengatheredinotherlabs,primarilyx-raydiffractiondatacollectedbyRosalindFranklin

etal.第11頁(yè)/共111頁(yè)2．DNA的復(fù)制方式

細(xì)菌DNA的q-形復(fù)制真核生物DNA的復(fù)制10～100

mm

復(fù)制叉復(fù)制叉復(fù)制原點(diǎn)

模板 新生鏈第12頁(yè)/共111頁(yè)DNA的滾環(huán)復(fù)制模式

圖8.2切口5’5’3’3’3’

模板 新生鏈新鏈連續(xù)復(fù)制互補(bǔ)鏈合成第13頁(yè)/共111頁(yè)3．DNA的理化性質(zhì)DNA的穩(wěn)定性在溶液中，DNA具有一定的粘性，易受剪切力的破壞；易被核酸酶降解；在強(qiáng)酸中，DNA能被水解成堿基、糖和磷酸；在特定的稀酸中(如pH3~4)，不同堿基與核糖之間的糖苷鍵會(huì)發(fā)生特異性的斷裂，根據(jù)這種特異性可測(cè)定DNA的堿基序列；在稀堿如0.2當(dāng)量NaOH中，雙鏈DNA很快變性產(chǎn)生單鏈DNA，繼而單鏈DNA被進(jìn)一步破壞。第14頁(yè)/共111頁(yè)3．DNA的理化性質(zhì)（2）DNA的光學(xué)性質(zhì)

DNA中的堿基屬于芳香簇化合物，能夠吸收紫外光(UV)。DNA吸收峰的光波波長(zhǎng)為260納米；當(dāng)濃度為1mg/ml時(shí)，

dsDNA：A260=20 ssDNA、RNA：A260≌25

人們根據(jù)A260測(cè)定DNA的濃度，根據(jù)A260/

A280和估算DNA的純度。第15頁(yè)/共111頁(yè)3．DNA的理化性質(zhì)（3）DNA的熱變性雙鏈DNA在一定的高溫下解鏈(變性)產(chǎn)生單鏈DNA。雙鏈DNA完全解鏈后，紫外吸收值A(chǔ)260可以提高40％，當(dāng)吸收值的提高達(dá)到中點(diǎn)時(shí)的溫度稱為解鏈溫度（Tm）。1.41.21.0708090100°CTm第16頁(yè)/共111頁(yè)3．DNA的理化性質(zhì)（4）復(fù)性、退火或雜交

當(dāng)溫度緩慢降低時(shí)，序列互補(bǔ)的單鏈DNA能夠漸漸地重新配對(duì)，即復(fù)性。不同來(lái)源的DNA之間堿基序列互補(bǔ)的區(qū)段進(jìn)行的堿基配對(duì)稱為退火或雜交，這被廣泛應(yīng)用于DNA的擴(kuò)增、定點(diǎn)誘變、基因鑒別。第17頁(yè)/共111頁(yè)3．DNA的理化性質(zhì)（5）分子特征與微生物分類鑒定

DNA中的G＋C含量通常通過Tm值來(lái)測(cè)定。同一個(gè)屬的細(xì)菌，G＋C含量的變化一般小于10％。

DNA－DNA雜交技術(shù)用于研究親緣關(guān)系近的微生物。如果兩菌株在最適條件下雜交，DNA相關(guān)性>70%，且Tm值差別<5％，它們就被認(rèn)為同種。第18頁(yè)/共111頁(yè)三、基因組DNA和染色體

基因組是指一種生物體內(nèi)單套遺傳物質(zhì)的全部遺傳基因。染色體指攜帶細(xì)胞功能所必備的基因的遺傳單元。

病毒是非細(xì)胞生物，它們的全套遺傳基因稱為基因組，但不足以形成染色體。

原核生物的染色體常為一個(gè)環(huán)狀的DNA分子。

真核生物的細(xì)胞有幾條至幾十條染色體，各含一個(gè)線狀的DNA分子。

第19頁(yè)/共111頁(yè)

細(xì)菌染色體DNA的大小和結(jié)構(gòu)(a)大腸桿菌細(xì)胞大小和染色體DNA長(zhǎng)度的比較；(b)細(xì)菌細(xì)胞中的擬核；(c)大腸桿菌染色體結(jié)構(gòu)電鏡圖。寬1.1~1.5mm、長(zhǎng)2~6mm的細(xì)胞里包裝著的一個(gè)DNA分子的長(zhǎng)度達(dá)1mm；這個(gè)環(huán)狀的DNA分子在細(xì)胞中形成含有一個(gè)染色體的擬核；在染色體的中心有一個(gè)由DNA結(jié)合蛋白和膜組成的骨架，DNA分子附著在骨架上形成50~100個(gè)超螺旋的環(huán)，每個(gè)環(huán)中含堿基對(duì)約50~100kb，這種多層次折疊使DNA處于高度壓縮狀態(tài).Fromfiguresinreferencedbook5.第20頁(yè)/共111頁(yè)真核生物細(xì)胞中的DNA中只有不到5％的DNA用于所需蛋白質(zhì)的基因表達(dá)，其余的DNA起“結(jié)構(gòu)”作用或“調(diào)節(jié)”作用。DNA被緊密地包裝在多條染色體中，每條染色體中含有一個(gè)線狀DNA分子，它以左手螺旋方向圍著一個(gè)個(gè)組蛋白八聚體繞圈1.8周，形成串珠狀的染色質(zhì)，被串在一起的小顆粒稱為核小體，染色質(zhì)進(jìn)一步卷曲形成每圈6個(gè)核小體、直徑30nm的染色質(zhì)絲，它折疊成許多超螺旋環(huán)附著在中央骨架上。真核生物的染色體結(jié)構(gòu)

FromBIOLOGYbyJackCCareyetal.,eds第21頁(yè)/共111頁(yè)四、染色體以外的遺傳因子

線粒體和葉綠體中含有的DNA能夠自體復(fù)制，并編碼執(zhí)行線粒體和葉綠體功能的蛋白，屬于染色體以外的遺傳因子。

質(zhì)粒一般指存在于細(xì)菌、真菌等微生物細(xì)胞中，獨(dú)立于染色體以外，能進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳因子。質(zhì)粒的大小為1～1000kb，常為環(huán)狀的雙鏈DNA分子，也有線狀DNA或RNA質(zhì)粒。有些質(zhì)粒既能夠整合到染色體上，又能以游離狀態(tài)存在，并能攜帶部分染色體基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移，它們被稱為附加體。

第22頁(yè)/共111頁(yè)第二節(jié)遺傳信息的表達(dá)

一、真核生物基因的轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控 二、原核生物基因的轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控 三、翻譯過程中的調(diào)控 四、調(diào)控信號(hào)與系統(tǒng)性調(diào)控第23頁(yè)/共111頁(yè)主要調(diào)控機(jī)制的調(diào)控模型

圖8.5第24頁(yè)/共111頁(yè)一、真核生物的基因轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控

1.真核生物的基因轉(zhuǎn)錄 常見啟動(dòng)子是位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游25－30個(gè)堿基對(duì)的TATA盒；另一些基因則含有一個(gè)與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)重疊的起始元件。

RNA聚合酶Ⅱ催化合成的是Pre-RNA，它必須經(jīng)過加工才形成成熟mRNA。

Pre-RNA的加工在細(xì)胞核中進(jìn)行，主要加工步驟：5′端加帽、3′端加尾、剪接去除插入子等。

第25頁(yè)/共111頁(yè)

發(fā)生在pre-mRNA轉(zhuǎn)錄的早期，當(dāng)新生RNA分子長(zhǎng)度達(dá)到25～30核苷酸時(shí)，加帽酶使新生轉(zhuǎn)錄物的5′端第一個(gè)核苷酸(A或G)g位的磷酸水解，并加上7-甲基鳥苷三磷酸。2.5′端加帽反應(yīng)和帽子結(jié)構(gòu)

圖8.8帽子結(jié)構(gòu)：5′端第一個(gè)核苷酸是7-甲基鳥苷三磷酸，它以5′三磷酸酯鍵與第二個(gè)核苷酸的5′端相連，而不是通常的3′,5′磷酸二酯鍵。甲基第26頁(yè)/共111頁(yè)3.

3′端的加尾過程

3′端加poly(A)發(fā)生于插入子剪切之前。

Pre-mRNA的尾部具有非編碼區(qū)，其3′端約20個(gè)核苷酸之前有一個(gè)稱為多聚A位點(diǎn)的序列AAUAAA。特異性的核酸內(nèi)切酶識(shí)別多聚(A)位點(diǎn)后，切除其后面的20個(gè)核苷酸并產(chǎn)生3′端游離羥基。在poly(A)聚合酶的作用下，20～250個(gè)腺嘌呤核苷酸被加到3′端，產(chǎn)生poly(A)。第27頁(yè)/共111頁(yè) pre-mRNA中有編碼和不編碼蛋白質(zhì)的序列相間排列，其中不編碼蛋白質(zhì)的序列被稱為插入子；編碼蛋白質(zhì)的序列被稱為表達(dá)子。4.

剪接去除插入子第28頁(yè)/共111頁(yè)插入子的切除和表達(dá)子的拼接自參考書2第29頁(yè)/共111頁(yè)5.真核生物基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控

真核生物基因表達(dá)的調(diào)控作用可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、mRNA修飾和穩(wěn)定、翻譯、mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)和降解等各個(gè)步驟。 真核細(xì)胞中基因表達(dá)的調(diào)控信號(hào)包括兩類：一類是激素和蛋白質(zhì)分子，另一類是外環(huán)境因素。第30頁(yè)/共111頁(yè)二、原核生物基因的轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控

1.細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)錄過程

mRNA不需要加工，轉(zhuǎn)錄與翻譯同步。

啟動(dòng)子：在－10和－35區(qū)具有特征性的序列，被不同的σ因子所識(shí)別。

多順反子：功能相關(guān)的多個(gè)基因往往聚集成一個(gè)操縱子，處于同一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元中。第31頁(yè)/共111頁(yè)

細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄和翻譯同步進(jìn)行

圖片來(lái)自參考書2第32頁(yè)/共111頁(yè)2.σ因子參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 細(xì)菌RNA聚合酶的核心酶的功能對(duì)任何基因都一樣，而σ因子才是選擇轉(zhuǎn)錄對(duì)象的關(guān)鍵亞基。 每一種σ因子識(shí)別的啟動(dòng)子在－10和－35區(qū)都具有特征性的序列。

－10和－35區(qū)不僅被不同的σ因子所識(shí)別，而且是決定啟動(dòng)子強(qiáng)度。第33頁(yè)/共111頁(yè)例：大腸桿菌 在正常生長(zhǎng)條件下，分子量為70kDa的σ70指導(dǎo)RNA聚合酶的活動(dòng)； 當(dāng)細(xì)胞需要進(jìn)行趨化移動(dòng)時(shí)，就產(chǎn)生分子量為28kDa的σ28啟動(dòng)鞭毛和趨化蛋白的合成； 如果環(huán)境溫度突然上升，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生分子量32kDa的σ32啟動(dòng)熱休克蛋白基因的轉(zhuǎn)錄以保護(hù)細(xì)胞不受高溫傷害，并清除已變性的蛋白。

第34頁(yè)/共111頁(yè)3.操縱子和轉(zhuǎn)錄的正、負(fù)調(diào)節(jié)

在原核細(xì)胞中，幾個(gè)功能相近或相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因經(jīng)常有序地排列在一起，并被轉(zhuǎn)錄在同一個(gè)RNA分子上；這種由一個(gè)轉(zhuǎn)錄控制區(qū)和1至多個(gè)結(jié)構(gòu)基因組成的一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄單元稱為操縱子。 有些基因需要在活化蛋白結(jié)合到DNA的特定位點(diǎn)后才能有效表達(dá)；由活化蛋白激活或促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控方法叫做轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)。 由阻遏蛋白結(jié)合到DNA的特定位點(diǎn)上，對(duì)轉(zhuǎn)錄的起始發(fā)生阻遏或解阻遏作用，這種調(diào)控方法被稱為轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié)。

第35頁(yè)/共111頁(yè)例：乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)

圖8.6

其中有兩個(gè)調(diào)控基因：（1）阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn)Oprator，乳糖參與負(fù)調(diào)節(jié)；（2）激活蛋白CAP的結(jié)合位點(diǎn)，cAMP參與正調(diào)節(jié)。

參考書1第36頁(yè)/共111頁(yè)衰減作用是通過衰減子使已經(jīng)開始的轉(zhuǎn)錄提早終止，從數(shù)量上減少完整mRNA的產(chǎn)生。圖8.74.衰減作用第37頁(yè)/共111頁(yè)三、翻譯過程中的調(diào)控固定式的調(diào)控：包含在DNA序列之內(nèi)，如稀有密 碼子和重疊基因等，其調(diào)控不受環(huán)境影響。非固定式的調(diào)控：作用受環(huán)境因素的影響，與

DNA 序列無(wú)關(guān)。 稀有密碼子出現(xiàn)頻率 基因的重疊排列

SD序列、與起始密碼子的間距

mRNA形成的二級(jí)結(jié)構(gòu) 反義RNA的存在

影響翻譯速度的因素第38頁(yè)/共111頁(yè)四、調(diào)控信號(hào)與系統(tǒng)性調(diào)控微生物必須對(duì)生存條件的變化迅速作出反應(yīng)；必須與其它個(gè)體或群體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，獲取并有效地利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。必須能夠產(chǎn)生、感應(yīng)、傳遞信號(hào)，同時(shí)對(duì)多個(gè)相關(guān)的操縱子進(jìn)行系統(tǒng)性調(diào)控。第39頁(yè)/共111頁(yè)1.葡萄糖效應(yīng)及其機(jī)理

當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)有葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、麥芽糖存在時(shí)，大腸桿菌首先利用葡萄糖，直到葡萄糖快要消耗完畢，其它糖的代謝才能開始，這種由葡萄糖的代謝抑制其它糖代謝現(xiàn)象稱為代謝抑制（cataboliterepression）或葡萄糖效應(yīng)。

第40頁(yè)/共111頁(yè)代謝抑制機(jī)理

細(xì)胞大量攝入并代謝葡萄糖，cAMP的含量隨之降低，使受cAMP正調(diào)控的乳糖操縱子、阿拉伯糖操縱子、麥芽糖操縱子等都不能被激活。 缺乏葡萄糖，或者人為地向培養(yǎng)基中加入cAMP，細(xì)胞中cAMP的濃度升高，產(chǎn)生的cAMP-CAP復(fù)合體與DNA結(jié)合，激活代謝乳糖、阿拉伯糖、麥芽糖的操縱子。第41頁(yè)/共111頁(yè)2.嚴(yán)緊反應(yīng)

細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中如果得不到足夠的氨基酸，細(xì)胞內(nèi)鳥苷四磷酸(ppGpp)和鳥苷五磷酸(pppGpp)的含量迅速上升；與此同時(shí)，RNA的合成速率迅速降低，蛋白質(zhì)的合成也隨之下降，從而細(xì)胞處于低速代謝和緩慢生長(zhǎng)狀態(tài)。當(dāng)環(huán)境中出現(xiàn)足夠的氨基酸時(shí)，pppGpp和ppGpp被迅速降解，RNA和蛋白質(zhì)的合成很快恢復(fù)。這是在困難時(shí)期獲得生存的策略，被稱為嚴(yán)緊反應(yīng)（stringentcontrol）。

第42頁(yè)/共111頁(yè)3.菌量感應(yīng)系統(tǒng)

有些細(xì)菌具有一種能夠感應(yīng)自身細(xì)胞群體密度并對(duì)其作出相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)控系統(tǒng)。 這些細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中釋放某種信號(hào)分子，當(dāng)細(xì)胞群體密度達(dá)到了一個(gè)臨界水平時(shí)，信號(hào)分子積累到起誘導(dǎo)作用的濃度，從而激活目標(biāo)操縱子，這種調(diào)控叫做菌量感應(yīng)作用(quorumsensing)。

第43頁(yè)/共111頁(yè)4.雙組分磷酸接力系統(tǒng)

雙組分磷酸接力系統(tǒng)又名雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，是一種通過磷?；鶊F(tuán)的轉(zhuǎn)移來(lái)傳導(dǎo)信號(hào)，并控制基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。 雙組分是：傳感蛋白激酶、應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白。 雙組分系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌中，也存在于真核微生物中；高等真核生物也利用磷酸化這一信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制傳遞信號(hào)。

第44頁(yè)/共111頁(yè)

例：枯草桿菌調(diào)控芽孢形成的雙組分磷酸接力系統(tǒng)

在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，枯草桿菌RNA聚合酶利用σA

對(duì)與其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)有關(guān)的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；KinA、B、C、D等對(duì)環(huán)境信號(hào)進(jìn)行傳感反應(yīng)的蛋白激酶，在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中以非磷酸化的形式存在。當(dāng)這些激酶感應(yīng)到不適于生長(zhǎng)的信號(hào)時(shí)發(fā)生磷酸化；磷酸化的KinA等將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到SpoOF；SpoOF將磷酸基團(tuán)傳遞給SpoOB；SpoOB再將磷酸基團(tuán)傳遞給SpoOA。磷酸化的SpoOA能與abrB基因的啟動(dòng)子結(jié)合并阻遏abrB基因的表達(dá)，AbrB是許多基因表達(dá)的抑制蛋白；圖8.8

磷酸化的SpoOA能夠激活σF、σE

等Sigma因子的合成。 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的部分σA被σF、σE

取代時(shí)，芽孢開始形成，負(fù)責(zé)芽孢形成后期基因的轉(zhuǎn)錄的σG和σK逐漸產(chǎn)生。第45頁(yè)/共111頁(yè)第三節(jié)細(xì)胞中遺傳信息的變異 一、微生物的遺傳變異現(xiàn)象 二、基因突變的分子基礎(chǔ) 三、基因重組 四、原核生物細(xì)胞間的基因轉(zhuǎn)移 五、真核微生物細(xì)胞間的基因交換第46頁(yè)/共111頁(yè)一、微生物的遺傳變異現(xiàn)象

自發(fā)突變發(fā)生的頻率很低，觀察自發(fā)性突變的經(jīng)典試驗(yàn)是波動(dòng)試驗(yàn)。自發(fā)突變和誘發(fā)突變的本質(zhì)相同：由于理化因子作用于DNA，導(dǎo)致遺傳性狀的變化。少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞的遺傳變異能夠使微生物群體完全地改變成新的菌落。

遺傳學(xué)中常用的突變株包括營(yíng)養(yǎng)缺陷型、抗藥突變型、溫度敏感型等。第47頁(yè)/共111頁(yè)

抗T1噬菌體的大腸桿菌的波動(dòng)試驗(yàn)

表8.1第48頁(yè)/共111頁(yè)艾姆氏試驗(yàn)的基本方法缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)缺乏型平板37℃2～3天.. ......:.¨.:..:..;.;...¨.:.:.¨.:..:..;.;...¨.:.. .....待測(cè)試劑(圖8.10)

正?；貜?fù)突變誘變劑誘變艾姆氏試驗(yàn)已成為測(cè)試化學(xué)物質(zhì)誘變作用的標(biāo)準(zhǔn)方法，其原理是檢驗(yàn)待測(cè)試劑能否使?fàn)I養(yǎng)缺陷型菌株的回復(fù)突變?cè)黾印?/p>

第49頁(yè)/共111頁(yè)二、基因突變的分子基礎(chǔ) DNA分子與其它物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成非正常結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象稱為DNA損傷。

DNA損傷的結(jié)果是導(dǎo)致基因突變或者細(xì)胞死亡。

DNA分子自身的活動(dòng)能夠?qū)е聣A基錯(cuò)配；此外，DNA損傷的分子機(jī)制都是由已知的或未知的理化因素對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了破壞作用。第50頁(yè)/共111頁(yè)

已知的化學(xué)致變劑和物理致變劑

物理致變劑

致變劑

電離輻射、紫外輻射等

化學(xué)致變劑脫氨劑、烷化劑、

大型加合物供體、堿基類似物、 插入劑、交聯(lián)劑。第51頁(yè)/共111頁(yè)常見的致變劑及其致變作用

圖7.11

亞硝基的脫氨作用；(b)烷化劑和被甲基化的堿基；(c)5-溴脫氧嘧啶與鳥嘌呤配對(duì)。第52頁(yè)/共111頁(yè)

嘧啶堿基受紫外輻射后產(chǎn)生的衍生物

圖7.12第53頁(yè)/共111頁(yè)分子的變異與信息的變化第54頁(yè)/共111頁(yè)三、基因重組

同源重組是生物中普遍存在的一種基因重組方式，其特點(diǎn)是可以在任何位置、任何兩個(gè)具有同源序列的DNA分子之間發(fā)生，需要類似RecA的蛋白參與。 位點(diǎn)特異性重組依賴于小范圍同源序列的聯(lián)會(huì)，特點(diǎn)是需要在供體和靶分子中包含特定的DNA序列，并且需要特異性的蛋白質(zhì)因子識(shí)別和催化。 轉(zhuǎn)座子是可在一個(gè)DNA分子內(nèi)或不同DNA分子間移動(dòng)的DNA片段。轉(zhuǎn)座作用即由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的DNA重排現(xiàn)象，它不需DNA同源性，無(wú)RecA參與；轉(zhuǎn)座子的末端帶有倒置重復(fù)序列，由轉(zhuǎn)座酶識(shí)別和切割。第55頁(yè)/共111頁(yè)

大腸桿菌l噬菌體在特異性位點(diǎn)插入染色體(a)和脫離染色體的方式(b)

位點(diǎn)特異性重組

圖8.14第56頁(yè)/共111頁(yè)

轉(zhuǎn)座子的插入和靶序列正向重復(fù)的產(chǎn)生過程。轉(zhuǎn)座作用

圖8.15第57頁(yè)/共111頁(yè)四、原核生物細(xì)胞間的基因轉(zhuǎn)移

在供體細(xì)胞和受體細(xì)胞直接接觸后，質(zhì)粒從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程叫做接合作用(conjugation)。

轉(zhuǎn)化(transformation)是指細(xì)胞從周圍介質(zhì)中攝取來(lái)自不同基因型細(xì)胞的DNA，使受體的基因型或表型發(fā)生相應(yīng)變化的過程。

轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)是由噬菌體介導(dǎo)的將DNA片段從供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌的過程。

第58頁(yè)/共111頁(yè)大腸桿菌中的F質(zhì)粒及其接合作用

圖8.16

第59頁(yè)/共111頁(yè)

大腸桿菌l噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)

圖8.17

(a)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) (b)特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)

第60頁(yè)/共111頁(yè)五、真核微生物細(xì)胞間的基因交換準(zhǔn)性生殖與有性生殖的比較表8.2第61頁(yè)/共111頁(yè)第四節(jié)微生物的誘變育種 和遺傳工程

一、菌株的誘變和篩選 二、DNA重組技術(shù)的發(fā)展 三、基因工程 四、生物種系的遺傳改良第62頁(yè)/共111頁(yè)一、菌株的誘變和篩選

物理致變劑

致變劑

e.g.X-rays,g-rays,UV

化學(xué)致變劑

e.g.baseanalogs,nitrousacid, alkylating,arylatingagents第63頁(yè)/共111頁(yè)UVLVLPhotolyase例：紫外線誘變的分子基礎(chǔ)第64頁(yè)/共111頁(yè)

紫外線誘變的操作步驟第65頁(yè)/共111頁(yè)青霉素生產(chǎn)菌的誘變育種菌株NRRL-B25的誘變過程Strain Mutagen Yield(U/ml)TimeNRRL-B25 250 1943NRRL-X1612 X-rays 500 1943NRRL-Q176 UVlight 850 1945NRRL-WIS-47-1564UVlight 850 1947--- --- 50000 1977第66頁(yè)/共111頁(yè)對(duì)早期生物技術(shù)的發(fā)展貢獻(xiàn)巨大；適用于途徑或基因未得到研究的菌株；產(chǎn)生的變異程度相對(duì)較低；變異的位點(diǎn)及性質(zhì)不明；沒有相應(yīng)的基因就不可能發(fā)生新功能。誘變育種技術(shù)的特點(diǎn)第67頁(yè)/共111頁(yè)二、DNA重組技術(shù)的發(fā)展

1.限制性核酸內(nèi)切酶

2.逆轉(zhuǎn)錄酶

3.DNA連接酶

4.DNA聚合酶和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第68頁(yè)/共111頁(yè)

1.限制性核酸內(nèi)切酶

20世紀(jì)60年代末Arber等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能夠產(chǎn)生識(shí)別特定的DNA序列并對(duì)其加以切割的酶，即限制性核酸內(nèi)切酶，簡(jiǎn)稱DNA內(nèi)切酶。這個(gè)發(fā)現(xiàn)標(biāo)記著DNA重組技術(shù)的誕生。 工具酶識(shí)別序列是4～8個(gè)核苷酸，這些位點(diǎn)的顯著特點(diǎn)是它們具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的結(jié)構(gòu)或稱回紋結(jié)構(gòu).圖7.18.(a)第69頁(yè)/共111頁(yè)

限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式

粘性末端：兩條單鏈上的斷裂位置交錯(cuò)且對(duì)稱，所產(chǎn)生的兩個(gè)末端含有單鏈的互補(bǔ)序列。

平端切割：兩條單鏈上的斷裂位置處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心，裂口處兩條單鏈的長(zhǎng)短平等。XhoISciI圖7.8.限制性內(nèi)切酶切割方式實(shí)例（b）、（c）第70頁(yè)/共111頁(yè)

2.逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄酶是以RNA為模板合成序列與其互補(bǔ)的DNA鏈。1970年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒以逆轉(zhuǎn)錄酶合成它們RNA基因組的DNA拷貝。 以5′→3′方向合成DNA，前提條件：有一段引物、一條模板分子、四種脫氧核糖核苷酸、鎂離子。

第71頁(yè)/共111頁(yè)

3.DNA連接酶

DNA連接酶是一種能夠催化DNA中相鄰的3′-OH和5′-磷酸基團(tuán)末端之間形成磷酸二酯鍵并把兩段DNA拼接起來(lái)的一種酶。

1972年，DavidJackson等使DNA片斷的粘性末端退火（即堿基彼此配對(duì)），然后用DNA連接酶共價(jià)連接這些片段；同年內(nèi)，他們就發(fā)展出基因克隆中所需要的質(zhì)粒載體與外源DNA的連接技術(shù)，成功地獲得了重組DNA分子。第72頁(yè)/共111頁(yè)4.DNA聚合酶和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

DNA聚合酶在有一條DNA單鏈為模板和一段寡核苷酸為引物的條件下，催化與模板互補(bǔ)的另一條DNA新鏈的合成反應(yīng)。1985年KaryMullis等用DNA聚合酶創(chuàng)建了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；用該技術(shù)進(jìn)行特定DNA片段的體外擴(kuò)增，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異序列的拷貝。 由于PCR技術(shù)對(duì)現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的巨大貢獻(xiàn)，發(fā)明人獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。第73頁(yè)/共111頁(yè)來(lái)自極端微生物的熱穩(wěn)定性DNApolymerase如來(lái)自Thermusaquatcus

的Taqpolymerase 95?C，半衰期>2h

使PCR實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。上圖為PCR儀，下圖為示PCR循環(huán)。T(?C)

907050Time(min)循環(huán)1 循環(huán)2循環(huán)3循環(huán)第74頁(yè)/共111頁(yè)三、基因工程

1.基因工程總體策略

2.目標(biāo)基因的克隆與鑒定

3.宿主和載體

4.重組蛋白的生產(chǎn)第75頁(yè)/共111頁(yè)1.基因工程總體策略（1）

基因工程指用人為的方法將所需要的某一供體生物的DNA提取出來(lái)，在適當(dāng)?shù)臈l件下用適當(dāng)?shù)拿盖懈詈?，把它與載體DNA分子連接起來(lái)形成具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子，并將它轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)。第76頁(yè)/共111頁(yè)基因工程總體策略（2）重組蛋白的生產(chǎn) 品種、菌株改良 遺傳基因分析第77頁(yè)/共111頁(yè)2.目標(biāo)基因的克隆與鑒定第78頁(yè)/共111頁(yè)藍(lán)-白選擇第79頁(yè)/共111頁(yè)活性篩選第80頁(yè)/共111頁(yè)放射自顯影或生色反應(yīng)用32P標(biāo)記探針迪高莘標(biāo)記探針及Marker第81頁(yè)/共111頁(yè)3.宿主和載體

克隆載體

是一個(gè)能復(fù)制的DNA分子，被用來(lái)運(yùn)載插入的外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞。它可以是質(zhì)粒、噬菌體、粘?；蛉斯と旧w。

-----LMPrescottetal.,in MICROBIOLOGY,5thed.第82頁(yè)/共111頁(yè)外源基因由克隆載體攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞OriAmpRForeign

geneMCSVectorscarrygenesintohostcells第83頁(yè)/共111頁(yè)質(zhì)粒圖譜范例第84頁(yè)/共111頁(yè)大腸桿菌K12及其衍生菌株第85頁(yè)/共111頁(yè)重組蛋白生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì): a.

可以對(duì)基因加以改造; b.

基因拷貝數(shù)大量提高; c.

用強(qiáng)啟動(dòng)子進(jìn)行快速轉(zhuǎn)錄; d.基因翻譯得到優(yōu)化; e.可進(jìn)行主動(dòng)調(diào)節(jié); f.

宿主細(xì)胞易于培養(yǎng).4.重組蛋白的生產(chǎn)第86頁(yè)/共111頁(yè)a.基因定位突變技術(shù)GGGTTTCCCGGGTTTAAACCCAAAGGGCCCAAATTTCCCAAAGGGCCCAAATTTGGGTTTCCCGGGTTTAAAGGGTTTAAATTTYYYXXXGGGTTTCCCGGGTTTAAACCCAAAGGGCCCAAATTTYYYYYYXXXXXXYYYAAATTT

CCCAAAYYYXXXTTTAAA

GGGTTTXXXBluntingKination LigationPCR第87頁(yè)/共111頁(yè)極耐熱性木聚糖酶基因的突變效果第88頁(yè)/共111頁(yè)DNAmRNAProtein基因組 重組基因轉(zhuǎn)錄翻譯多拷貝強(qiáng)轉(zhuǎn)錄優(yōu)化翻譯b.c.d.

蛋白質(zhì)合成過程中的優(yōu)勢(shì)第89頁(yè)/共111頁(yè)E.coli中l(wèi)ac啟動(dòng)子

lac&trp啟動(dòng)子的雜 合體Ptac

E.coli

噬菌體T7啟動(dòng) 子

E.coli

的l噬菌體啟 動(dòng)子PLphage

PHshfrom E.colie.主動(dòng)調(diào)節(jié)E.coli表達(dá)體系中的調(diào)控模式第90頁(yè)/共111頁(yè)

PL啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控PL+1RBS FG Terminator

30℃40℃mRNA熱激熱敏感性抑制子cI第91頁(yè)/共111頁(yè)

T7啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控T7Promoter待表達(dá)基因宿主細(xì)胞宿主染色體質(zhì)粒質(zhì)粒PlacT7RNA聚合酶基因第92頁(yè)/共111頁(yè)f.極端酶高效表達(dá)極耐熱性木聚糖酶基因的表達(dá)第93頁(yè)/共111頁(yè)四、生物種系的遺傳改良 及疾病的基因治療和基因藥物

1.基因重組微生物

2.通過植物轉(zhuǎn)基因改良品種

3.動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因

4.基因治療與基因藥物第94頁(yè)/共111頁(yè)定義：代謝(途徑)工程istheuseofmoleculartechniques(orrecombinantDNAtechniques)toimprovetheefficiencyofpathwaysthatsynthesizespecificproducts.

-----LMPrescottetal.,in MICROBIOLOGY,5thed1.基因重組微生物第95頁(yè)/共111頁(yè)Zymomonasmobilis的乙醇發(fā)酵途徑Entner-Doudoroffpathway丙酮酸乙醛+CO2乙醇乙醇脫氫酶丙酮酸脫羧酶第96頁(yè)/共111頁(yè)E.coli

的部分代謝途徑

EMP途徑乳酸 丙酮酸 甲酸 CO2+H2

乙酰輔酶A

磷酸轉(zhuǎn)移酶 乙醛脫氫酶 乙酰磷酸 乙醛

乙酸激酶

乙醇脫氫酶 乙酸 乙醇 乳酸脫氫酶

第97頁(yè)/共111頁(yè)E.coli

的代謝工程

EMP途徑乳酸 丙酮酸 乙醛 甲酸 CO2+H2

乙酰輔酶A 乙醇

磷酸轉(zhuǎn)移酶 乙醛脫氫酶 乙酰磷酸 乙醛

乙酸激酶

乙醇脫氫酶 乙酸 乙醇 乳酸脫氫酶

丙酮酸脫羧酶乙醇操縱子設(shè)計(jì)宿主菌株的選擇基因的整合表達(dá)水平的篩選條件優(yōu)化等乙醇脫氫酶外原基因構(gòu)建途徑第98頁(yè)/共111頁(yè)利用木質(zhì)纖維水解液的乙醇發(fā)酵菌株菌株 產(chǎn)量得率 速率 （g/l）（%）（g/l/h）Sacharomyces140021.0981.60Z.mobilisCP4 22.6881.04E.coliKO1134.7801.16代謝工程菌發(fā)酵水平比較第99頁(yè)/共111頁(yè)2.通過植物轉(zhuǎn)基因改良品種

農(nóng)桿菌屬細(xì)菌生活在土壤中，從傷口侵入植物組織后，將T-DNA插入植物的染色體，產(chǎn)生激素刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，并指導(dǎo)細(xì)胞合成細(xì)菌所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

A.tumefaciens促使細(xì)胞過量生長(zhǎng)產(chǎn)生大塊細(xì)胞團(tuán)，引起冠癭?。籄.rhizogenes侵染植物根部導(dǎo)致異常生長(zhǎng)，形成“發(fā)根”。 這兩個(gè)種是植物遺傳工程的重要工具。第100頁(yè)/共111頁(yè)T-DNA整合分泌細(xì)胞分裂素植物生長(zhǎng)素植物細(xì)胞核孔VirD2分泌冠癭堿傷害分泌乙酰丁香酮農(nóng)桿菌細(xì)胞核Pi-VirA誘導(dǎo)vir表達(dá)從Ti質(zhì)粒中切出T－DNAVirD4VirD2VirB農(nóng)桿菌和植物的相互作用第101頁(yè)/共111頁(yè)

用Ti質(zhì)粒構(gòu)建的穿梭載體第102頁(yè)/共111頁(yè)

3.動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因最有效方法：用病毒轉(zhuǎn)染動(dòng)物或動(dòng)物胚胎。主要目的：用動(dòng)物表達(dá)產(chǎn)生人類特定的組織或器官；建立人類疾病治療的動(dòng)物模型；昆蟲、豬、羊等都能被用來(lái)表達(dá)人類蛋白。

第103頁(yè)/共111頁(yè)逆轉(zhuǎn)錄蛋白（retrovirus）單鏈RNA，侵染哺乳動(dòng)物；侵染后，RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈DNA；啟動(dòng)