基因工程第四章目的基因的分離與修飾

基因工程第四章目的基因的分離與修飾第1頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第四章目的基因的分離與修飾Chapter4PreparationamdModificationsofTargetGene第2頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)基因的基本結(jié)構(gòu)特征（CharacterofGeneBasicStructure）作為一個(gè)具有功能的結(jié)構(gòu)基因應(yīng)具備下列的元件：轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)核糖體識(shí)別區(qū)編碼區(qū)（包括起始密碼子）開(kāi)發(fā)閱讀框終止密碼子轉(zhuǎn)錄終止區(qū)第3頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一、原核生物基因的組成（CompositionofprokaryoticGene）1.1基因區(qū)：原核生物的基因多數(shù)以操縱子（Operon）形式存在，操縱子中的各個(gè)基因分別有各自的起始密碼子和終止密碼子。1.2啟動(dòng)區(qū)：包括－35區(qū)和－10區(qū)1.3SD區(qū)：在起始密碼子ATG上游約10bp，富含嘌呤的保守區(qū)，與16SrRNA結(jié)合。1.4轉(zhuǎn)錄終止子和終止因子第4頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第5頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四原核生物基因的組成基因區(qū)：多以操縱子形式存在，多順?lè)醋觤RNA第6頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四啟動(dòng)區(qū)（promoter）：DNA分子可以與RNA聚合酶特異結(jié)合的部位，轉(zhuǎn)錄開(kāi)始的部位。SD區(qū)：位于AUG上游4~13個(gè)NT處的富含嘌呤的序列，為AGGAGG。與16SrRNA的3’端(3’-UCCUCC-5’）,使AUG定位在P位。轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)-35-10第7頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)錄終止子(terminator)強(qiáng)終止子，也稱(chēng)為內(nèi)部終止子。弱終止子，又稱(chēng)為ρ依賴(lài)終止子。第8頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四二、真核生物基因的組成（CompositionofEukaryoticGene）2.1基因區(qū)：真核生物的基因含有內(nèi)含子（Intron）和外顯子（Exon）。1.2轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)：包括TATA框，CAAT框和GC框1.3Kozak區(qū)：

GCCACCATGG

1.4轉(zhuǎn)錄終止子第9頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四真核生物基因的組成基因區(qū)：

割裂基因，外顯子，內(nèi)含子第10頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)單順?lè)醋觤RNA轉(zhuǎn)錄終止子第11頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四三、其他基因組基因的組成質(zhì)粒的基因：不含內(nèi)含子病毒的基因：以多順?lè)醋舆M(jìn)行轉(zhuǎn)錄；有重疊基因；線(xiàn)粒體的基因：以多順?lè)醋舆M(jìn)行轉(zhuǎn)錄；無(wú)SD序列；葉綠體的基因：以多順?lè)醋舆M(jìn)行轉(zhuǎn)錄，含有類(lèi)似于原核基因組的啟動(dòng)子和SD序列第12頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四四、基因的排列基因組中的基因一個(gè)接一個(gè)排列在DNA分子上，基因之間存在長(zhǎng)度不等的間隔區(qū)，但某些生物基因組中的基因存在重疊、重復(fù)、加倍和重排等現(xiàn)象。重疊基因第13頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四重復(fù)基因原核生物無(wú)重復(fù)序列低等真核生物10-20%高等植物80%高等動(dòng)物50%重復(fù)基因第14頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四加倍基因高等生物含倍性染色體，基因組為多倍。原核生物的單倍，質(zhì)粒是多拷貝的第15頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1目的基因2目的基因的制備3目的基因的分離第16頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2目的基因的制備2.1直接分離法2.2基因文庫(kù)技術(shù)分離目的基因2.3基因組文庫(kù)分離法2.4cDNA基因文庫(kù)分離2.5PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因2.6化學(xué)合成基因第17頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.1直接分離法-限制性?xún)?nèi)切核酸酶酶切法該法適于從簡(jiǎn)單基因組中分離目的基因，如質(zhì)粒和病毒等DNA。BamHI和EcoRI酶切，可獲得目的基因。第18頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四對(duì)于高等真核生物而言，基因組DNA十分龐大,基因可達(dá)數(shù)萬(wàn)個(gè)，且基因組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除編碼序列，還有非編碼序列及調(diào)控序列，基因間還存在大量的間隔序列和重復(fù)序列，因此，單個(gè)目的基因在整個(gè)基因組中所占的比例極其微小，除少數(shù)例外，絕大多數(shù)基因難以直接分離得到。第19頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四為了解決這個(gè)難題，一種可行的方法就是將這個(gè)基因擴(kuò)增，增加成功分離目的基因的可能性。但是由于要分離的目的基因往往是未知基因，因此無(wú)法對(duì)它進(jìn)行特異性擴(kuò)增，只能對(duì)所有的基因進(jìn)行擴(kuò)增，也就是構(gòu)建該生物材料的基因文庫(kù)，然后再根據(jù)不同的方法將所需的克隆篩選出來(lái)，最后分離得到目的基因。第20頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1）概念：基因文庫(kù)(genelibrary)：指某一生物類(lèi)型全部基因的集合。以重組體形式出現(xiàn)。基因文庫(kù)由外源DNA片段、載體和宿主組成。一個(gè)理想的基因文庫(kù)應(yīng)包括該生物染色體基因組全部遺傳信息(即全部DNA序列)。2.2基因文庫(kù)技術(shù)分離目的基因第21頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四用途：

a）分離有用的目的基因

b）保存某種生物的全部基因第22頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2)基因文庫(kù)構(gòu)建的基本程序：①DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。②載體的選擇及制備。③DNA片段或cDNA與載體連接。④重組體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。⑤轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選。第23頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四限制性?xún)?nèi)切酶……克隆、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、鑒定基因組DNA基因文庫(kù)第24頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因文庫(kù)技術(shù)分離目的基因----未知基因

基因的克?。韩@得含重組DNA的宿主細(xì)胞克隆基因的分離:從文庫(kù)中分離出目的基因分離基因的鑒定:確定基因的結(jié)構(gòu)及功能

第25頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3）基因文庫(kù)的類(lèi)別基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)：指將某生物的全部基因組DNA切割成一定長(zhǎng)度的DNA片段克隆到某種載體上而形成的集合。基因組文庫(kù)分為：核基因組文庫(kù)、葉綠體基因組文庫(kù)及線(xiàn)粒體基因組文庫(kù)。第26頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四cDNA文庫(kù)：是指某生物基因組轉(zhuǎn)錄的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。cDNA(complementaryDNA，互補(bǔ)DNA)：是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的互補(bǔ)DNA。第27頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四結(jié)構(gòu)基因外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄、加工修飾mRNA第28頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2目的基因的制備2.1直接分離法2.2基因文庫(kù)技術(shù)分離目的基因2.3基因組文庫(kù)分離法2.4cDNA基因文庫(kù)分離2.5PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因2.6化學(xué)合成基因第29頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.3.1基因組文庫(kù)的概念和大小2.3.2λ噬菌體基因組文庫(kù)的構(gòu)建2.3.3考斯質(zhì)粒基因組文庫(kù)的構(gòu)建2.3.4YAC基因組文庫(kù)的構(gòu)建2.3基因組文庫(kù)的構(gòu)建第30頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.3.1基因組文庫(kù)(Genomiclibrary)的概念和大小概念：基因組文庫(kù)：某種生物基因組的全部遺傳信息通過(guò)克隆載體儲(chǔ)存于某一受體菌的群體中。第31頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因組DNA文庫(kù)的類(lèi)型根據(jù)所選用的載體可以分為：質(zhì)粒文庫(kù)、噬菌體文庫(kù)、粘粒文庫(kù)、人工染色體文庫(kù)（細(xì)菌人工染色體文庫(kù)、酵母人工染色體文庫(kù)）。第32頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一個(gè)理想的基因組文庫(kù)要有足夠多的克隆子數(shù)，保證所有的基因都在克隆子群體中。以某生物基因組約3106kb，酶切片段平均長(zhǎng)度15kb。理論克隆數(shù)：

基因組DNA總長(zhǎng)

DNA片段平均長(zhǎng)度

3106/15=2105基因組文庫(kù)的大小實(shí)際克隆數(shù)：DNA片段是隨機(jī)克隆的，因此理論值只是基因組文庫(kù)所需要的最小數(shù)值。一個(gè)完全的基因文庫(kù)就必須含有更多的重組體克隆數(shù)。

文庫(kù)理論克隆子數(shù)＝第33頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四以上的例子，N值應(yīng)是：ｌｎ（１－0.99）ｌｎ[1-（15/3106

）]

1975年，L.Clark和J.Carbon的經(jīng)驗(yàn)公式：文庫(kù)實(shí)際克隆子數(shù)N＝ｌｎ（１－ｐ）ｌｎ（１－ｆ）N:基因組文庫(kù)必需的克隆子數(shù)；P:文庫(kù)中目的基因出現(xiàn)的機(jī)率，一般情況下期望值99％，即0.99?:分離的DNA片段平均大小與基因組大小的比值。一個(gè)完全的基因文庫(kù)必須含有3-10倍于最低重組體克隆數(shù)的克隆。

N==91053106/15=2105第34頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因組文庫(kù)應(yīng)具有的克隆子數(shù)第35頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因組DNA文庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一個(gè)理想的基因組DNA文庫(kù)應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過(guò)大，以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度，避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域，以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選第36頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.2.1基因組文庫(kù)的概念和大小2.2.2λ噬菌體基因組文庫(kù)的構(gòu)建2.2.3考斯質(zhì)?；蚪M文庫(kù)的構(gòu)建2.2.4YAC基因組文庫(kù)的構(gòu)建2.2基因組文庫(kù)構(gòu)建第37頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四連接克隆載體的選擇質(zhì)粒載體可承載15kbDNA片段

載體可承載23kbDNA片段

Cosmid載體可承載45kbDNA片段

YAC文庫(kù)4000kbBAC文庫(kù)300kb第38頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四利用質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)該法簡(jiǎn)單、快速、易于操作，但僅適合一些低等真核生物和原核生物。第39頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1）載體的特點(diǎn)：λ噬菌體是一種溫和噬菌體，可保存在大腸桿菌中。承載較大外源DNA，約23kb。有多種限制酶識(shí)別位點(diǎn)。

2.2.2構(gòu)建λ噬菌體基因組文庫(kù)第40頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四獲得含目的基因的DNA片段與λ噬菌體載體重組重組DNA的包裝轉(zhuǎn)化受體菌2）構(gòu)建λ噬菌體基因組文庫(kù)的步驟重組克隆的挑選和保存第41頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四目的基因DNA片段化方法：超聲波處理限制性?xún)?nèi)切酶部分酶切第42頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四A機(jī)械切割法（超聲波處理）：優(yōu)點(diǎn)：可獲得較均一的隨機(jī)片段，缺點(diǎn)：DNA片段呈平末端，片段不能直接用于克隆，需經(jīng)末端修飾，連上接頭后再用限制性?xún)?nèi)切酶消化產(chǎn)生黏性末端。B限制酶消化：選用四或六核苷酸的限制性?xún)?nèi)切酶，如：（GATC）Sau3AI或MboI、BamHI(GGATCC)等。優(yōu)點(diǎn)：直接產(chǎn)生黏性末端，缺點(diǎn)：片段的隨機(jī)性較差。第43頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因組DNA的不完全酶切確定限制酶用量，改變酶切時(shí)間固定酶切時(shí)間，改變限制酶的用量第44頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四載體的結(jié)構(gòu)左臂：編碼噬菌體頭部和尾部蛋白的基因右臂：復(fù)制起始點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)和其它必須基因左臂和右臂末端的Cos位點(diǎn)中央片段：不含必須基因第45頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因文庫(kù)

Sau3AI或MboI密度梯度離心或電泳第46頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四重組DNA分子的包裝:

a.λDNA的包裝物的制備:

使用的大腸桿菌菌株：

E.coliBHB2688-包裝蛋白

E.coliBHB2690-頭部蛋白第47頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

b.重組λDNA分子的包裝過(guò)程包裝制備物（-70℃）于冰上緩慢融化加入重組λDNA分子邊融化邊混合邊包裝離心除去細(xì)胞碎片λ顆粒于-70℃保存待用5)基因組文庫(kù)的保存

包裝的λ顆粒感染E.coli

培養(yǎng)分離λ顆粒-70℃保存第48頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四DNA片段之間的連接具互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接具平末端DNA片段之間的連接

DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接

DNA片段加連桿或銜接物后連接回顧第49頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（1）具互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接基本原理：

DNA連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端DNA片段?；仡櫟?0頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（2）具平末端DNA片段之間的連接基本原理：直接用T4DNA連接酶連接.

回顧第51頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（3）DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接1)DNA末端同聚物加尾后進(jìn)行連接回顧第52頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2)黏性末端修飾成互補(bǔ)粘端或平末端后進(jìn)行連接①修平：用核酸酶切除雙鏈DNA分子的突出核苷酸，修平后用T4連接酶作平末端連接。②補(bǔ)平：用Klenow酶將粘端補(bǔ)平，產(chǎn)生平末端或匹配粘端，再用T4連接酶進(jìn)行連接?；仡櫟?3頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3)DNA片段5’端脫磷酸化后連接基本原理：堿性磷酸酶催化去除DNA的5’磷酸根，防止DNA的自身環(huán)化或連接形成多聚體?；仡櫟?4頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（4）DNA片段加連桿或銜接物后連接

連桿(linker)：指用化學(xué)方法合成的一段由10-12個(gè)核苷酸組成的、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段?；仡櫟?5頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四DNA銜接物（adaptor）：由化學(xué)合成的一端具有某種限制酶的粘性末端而另一端為平末端的雙鏈寡聚核苷酸短片段?；仡櫟?6頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.3.1基因組文庫(kù)的概念和大小2.3.2λ噬菌體基因組文庫(kù)的構(gòu)建2.3.3考斯質(zhì)?；蚪M文庫(kù)的構(gòu)建2.3.4YAC基因組文庫(kù)的構(gòu)建

2.3基因組文庫(kù)構(gòu)建第57頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因文庫(kù)

Sau3AI或MboI第58頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.3.3構(gòu)建考斯質(zhì)?；蚪M文庫(kù)1）特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可在細(xì)菌中保存和大量復(fù)制。含有Cosmid位點(diǎn)，可進(jìn)行體外包裝；克隆容量很高，45kb，載體的分子較小，在10kb以下。第59頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2）基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程第60頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四缺點(diǎn)：篩選困難；重組效率低；文庫(kù)不易保存。第61頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.3.1基因組文庫(kù)的概念和大小2.3.2λ噬菌體基因組文庫(kù)的構(gòu)建2.3.3考斯質(zhì)?；蚪M文庫(kù)的構(gòu)建2.3.4YAC基因組文庫(kù)的構(gòu)建

2.3基因組文庫(kù)構(gòu)建第62頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.3.4構(gòu)建YAC基因組文庫(kù)1）載體的特點(diǎn)：YAC載體的基本組成部分：*自主復(fù)制序列(ARS)*著絲粒序列（CEN）*端粒序列（TEL）*選擇標(biāo)記基因*多克隆位點(diǎn)（MCS）優(yōu)點(diǎn)：承載長(zhǎng)達(dá)1000kb甚至3000kb的外源DNA片段，第63頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2）基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程第64頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2目的基因的制備2.1直接分離法2.2基因文庫(kù)技術(shù)分離目的基因

2.3基因組文庫(kù)分離法2.4cDNA基因文庫(kù)分離2.5PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因2.6化學(xué)合成基因第65頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.4cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建及目的基因分離2.4.1cDNA基因文庫(kù)的概念cDNA文庫(kù)：是指某生物基因組轉(zhuǎn)錄的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。2.4.2cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建2.4.3mRNA豐度與cDNA基因文庫(kù)大小的關(guān)系2.4.4cDNA克隆的優(yōu)越性第66頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.4.2cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建主要步驟：①?gòu)纳矬w或細(xì)胞中提取mRNA；②利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一條鏈；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當(dāng)引物合成cDNA第二條鏈，④cDNA與載體的重組后導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞增值。第67頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四mRNA的提取全長(zhǎng)mRNA具有一個(gè)polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分離；用寡聚纖維素柱，選擇性地吸附mRNA純化第68頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四①分離細(xì)胞總RNA，從中分離純化mRNA；②合成cDNA的第一條鏈：

a.oligo(dT)引導(dǎo)的DNA合成法：原理：真核mRNA分子具有poly(A)尾巴，加入oligo(dT)短片段，由反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈。缺陷：逆轉(zhuǎn)錄酶通常無(wú)法到達(dá)mRNA分子的5’-末端，必須從3’-末端開(kāi)始合成cDNA。第69頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四b.隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA合成法：原理：隨機(jī)引物：人工合成的含有各種可能的排列順序的六核苷酸片段的混合物，可以與任何核酸片段雜交，并作為聚合酶反應(yīng)的引物。應(yīng)用這種混合引物，cDNA的合成從mRNA模板的許多位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生，從而保證得到mRNA的編碼區(qū)和5’端旁側(cè)。多用于mRNA分子較大且3’端非編碼區(qū)序列較長(zhǎng)；AAAAAAAAAAAA3’

5’3’第70頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.4.2cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建主要步驟：①?gòu)纳矬w或細(xì)胞中提取mRNA；②利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一條鏈；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當(dāng)引物合成cDNA第二條鏈，④cDNA與載體的重組后導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞增值。第71頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四③合成cDNA第二條鏈a.自身引導(dǎo)合成法b.大腸桿菌RNaseH酶降解取代法c.oligo(dG)寡聚引物引導(dǎo)法d.PCR法

第72頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四a.自身引導(dǎo)合成法：原理：?jiǎn)捂渃DNA的3’端能夠形成發(fā)夾狀的結(jié)構(gòu)作為引物，在大腸桿菌聚合酶I、Klenow或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈。缺點(diǎn)：S1核酸酶切割發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)會(huì)丟失對(duì)應(yīng)于mRNA5’端的序列。

S1核酸酶偶爾破壞合成的雙鏈cDNA分子。第73頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四b.大腸桿菌RNaseH酶降解取代法-置換合成法原理：以第一鏈合成產(chǎn)物cDNA-mRNA作為切口平移的模板，

RNA酶H對(duì)mRNA造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物，大腸桿菌DNA聚合酶I

的作用下合成cDNA的第二鏈。第74頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四優(yōu)點(diǎn)：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，不需純化

c）避免使用S1核酸酶來(lái)切割雙鏈cDNA第75頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四c.oligo(dG)寡聚引物引導(dǎo)法oligo(dG)作為引物可與cDNA第一鏈3’末端的poly(T)序列相結(jié)合，有效的引發(fā)cDNA第二鏈的合成。第76頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四d.RCR法

以cDNA的第一條鏈為模板設(shè)計(jì)引物。優(yōu)點(diǎn)：可獲得多拷貝的雙鏈cDNA;不用純化mRNA;同聚物尾巴保護(hù)末端.

第77頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.4.2cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建主要步驟：①?gòu)纳矬w或細(xì)胞中提取mRNA；②利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一條鏈；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當(dāng)引物合成cDNA第二條鏈，④cDNA與載體的重組后導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞增值。第78頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四④cDNA與載體的重組后導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞增值。

cDNA末端的處理由于大片段的平末端連接效率非常低，因此為了避免用平末端與載體連接，對(duì)雙鏈cDNA的末端進(jìn)行加工.方法：添加特異性核酸接頭以形成適合于克隆的黏性末端末端轉(zhuǎn)移酶—可以向cDNA末端加上與克隆載體末端互補(bǔ)的尾部第79頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第80頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第81頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.4cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建及目的基因分離2.4.1cDNA基因文庫(kù)的概念2.4.2cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建2.4.3mRNA豐度與cDNA基因文庫(kù)大小的關(guān)系2.4.4cDNA克隆的優(yōu)越性第82頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.4.3mRNA豐度和cDNA基因文庫(kù)大小的關(guān)系cDNA文庫(kù)中儲(chǔ)存某種基因的概率與總mRNA中這種基因的mRNA的拷貝數(shù)有關(guān)。某種mRNA的拷貝數(shù)越多，意味著cDNA文庫(kù)中儲(chǔ)存該基因的概率越大，越容易分離出來(lái)。

某種mRNA在不同組織不同發(fā)育時(shí)期的豐度不同。第83頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

mRNA的豐度與文庫(kù)克隆子數(shù)的關(guān)系

N=ln(1-P)/ln(1-f)N:所需克隆數(shù);P:要求的概率;f:一種mRNA的豐度與總mRNA的比值第84頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四哺乳動(dòng)物細(xì)胞含有10,000-30,000種不同的mRNA分子，某些mRNA分子的拷貝數(shù)很低甚至只有一個(gè)拷貝。要富集或增大克隆數(shù)目來(lái)保證構(gòu)建的文庫(kù)中能夠含有它們的克隆。第85頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1)按大小對(duì)mRNA進(jìn)行分級(jí)分離通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離大小不同的mRNA分子,該方法的分離效果最好，但從凝膠中回收的得率較低.蔗糖梯度離心：分離不同分子量的mRNA.第86頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2)cDNA的分級(jí)分離*mRNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，在插入到克隆載體前，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，將不同大小的cDNA分子分離開(kāi)來(lái)。*優(yōu)點(diǎn)：

a）避免了分離過(guò)程中mRNA被污染的RNA酶降解

b）增加了獲得全長(zhǎng)cDNA克隆的概率

c）獲得更準(zhǔn)確的分級(jí)分離效果（分子量）第87頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3）多聚核糖體免疫學(xué)純化法使用抗體純化合成目的多肽的多聚核糖體。將正在合成的新生多肽鏈的多聚核糖體結(jié)合到免疫親和柱上，隨后用EDTA將多聚核糖體解離下來(lái)，并通過(guò)Oligo(dT)層析分離mRNA,利用該方法可將目的mRNA純化數(shù)千倍。第88頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.4cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建及目的基因分離2.4.1cDNA基因文庫(kù)的概念2.4.2cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建2.4.3mRNA豐度與cDNA基因文庫(kù)大小的關(guān)系2.4.4cDNA克隆的優(yōu)越性第89頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.4.4cDNA克隆的優(yōu)越性①cDNA文庫(kù)以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒等的基因組結(jié)構(gòu)研究及有關(guān)基因的克隆分離。②cDNA文庫(kù)的篩選比較簡(jiǎn)單易行。③每一個(gè)cDNA文庫(kù)都含有一種mRNA序列，這樣在目的基因的選擇中出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率就會(huì)比較低，因此陽(yáng)性雜交信號(hào)一般都是有意義的，由此選擇出來(lái)的陽(yáng)性克隆將會(huì)含有目的基因。④cDNA文庫(kù)可用于在細(xì)菌中能進(jìn)行表達(dá)的基因的克隆，直接應(yīng)用于基因工程操作。⑤cDNA克隆還可用于真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)和功能研究。第90頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四局限性：1）cDNA文庫(kù)包含的遺傳信息比基因組文庫(kù)的少，且受細(xì)胞來(lái)源或發(fā)育時(shí)期的影響。2）不能直接獲得基因的內(nèi)含子序列和基因編碼區(qū)外大量的調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能方面的信息。3）分離到的多為高豐度mRNA的產(chǎn)物。第91頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2目的基因的制備2.1直接分離法2.2基因文庫(kù)技術(shù)分離目的基因

2.3基因組文庫(kù)分離法2.4cDNA基因文庫(kù)分離2.5PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因2.6化學(xué)合成基因第92頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR，PolymeraseChainReaction

（1）反應(yīng)體系：含有目的基因或序列的DNA模板熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）一對(duì)脫氧寡核苷酸引物（primer）4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)Buffer及Mg2+等第93頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55（2）基本工作原理第94頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Cycle355

555

5

555

5

55

555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。第95頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（3）PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第96頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四如果知道目的基因的全序列或其兩側(cè)的序列，可以合成一對(duì)與模板DNA互補(bǔ)的引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出含目的基因的DNA片段。2.5利用PCR擴(kuò)增目的基因第97頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四局限性：必須知道側(cè)接靶序列的核苷酸序列，以制備引物。常規(guī)PCR擴(kuò)增片段一般在lkb以?xún)?nèi)。未知序列的目的基因和大片段基因的擴(kuò)增，則需要特殊類(lèi)型的PCR

：套式PCR、反向PCR、不對(duì)稱(chēng)PCR、多重PCR、錨定PCR、長(zhǎng)程PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR和原位PCR等。第98頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1）Nestedpcr （套式PCR）特點(diǎn):

需要設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，一對(duì)引物擴(kuò)增稍長(zhǎng)片段，在這一擴(kuò)增范圍內(nèi)再設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增的產(chǎn)物是以第一對(duì)引物的產(chǎn)物為模版套式PCR

通過(guò)內(nèi)外引物進(jìn)行兩次擴(kuò)增，大大提高了檢測(cè)的敏感性第99頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2）反向PCR（InversePCR）基本原理：擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，在引物外側(cè)合成DNA。第100頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四已知序列未知序列未知序列連接酶第101頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3）不對(duì)稱(chēng)PCR

目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物，最佳比例一般是0.01∶0.5μM。

第102頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

高濃度引物低濃度引物第103頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四以其中的mRNA作為模板，以O(shè)ligo（dT）或隨機(jī)引物或基因特異性為引物，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)

4）RT-PCR:提取組織或細(xì)胞中的總RNA第104頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四5）多重PCR：在一個(gè)反應(yīng)體系中使用一對(duì)以上引物的PCR稱(chēng)，其結(jié)果是產(chǎn)生多個(gè)PCR產(chǎn)物，用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。電泳引物第105頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四6）原位PCR原位雜交PCR首先將樣品組織切片或細(xì)胞涂片，然后固定在載玻片上；適當(dāng)預(yù)處理后，將細(xì)胞核內(nèi)的DNA加熱變性形成兩條單鏈DNA。針對(duì)待檢測(cè)的選定序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，直接將引物dNTP緩沖液及TaqDNA聚合酶加到載玻片上在原位聚合酶儀內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)完畢后將PCR產(chǎn)物固定在載玻片上用相應(yīng)的檢測(cè)信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)?？梢詸z測(cè)組織細(xì)胞中微量DNA或RNA，且可精確定位第106頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四人類(lèi)染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片第107頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四7）定量PCR：熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。常用的熒光標(biāo)記方法：非特異檢測(cè)——雙鏈DNA內(nèi)插式熒光染料；代表是SYBRGreenI熒光染料擴(kuò)增序列專(zhuān)一檢測(cè)——主要指TaqMan熒光探針熒光染料技術(shù)成本低廉，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便；而探針雜交技術(shù)在原理上嚴(yán)格，所得數(shù)據(jù)特異性高、更為精確第108頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四SYBRGreenI工作原理：

SYBRGreen1

染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。單鏈DNA、變性DNA:無(wú)熒光信號(hào)GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第109頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四TaqMan探針?lè)ǎ?指PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)另外加入一個(gè)特異性的熒光探針：該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q。當(dāng)探針完整的時(shí)候，5′端報(bào)告基團(tuán)經(jīng)儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3′端熒光基團(tuán)淬滅，儀器檢測(cè)不到5′端報(bào)告基團(tuán)所激發(fā)的熒光信號(hào)與目標(biāo)序列互補(bǔ)第110頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

PCR擴(kuò)增過(guò)程中：Taq酶在鏈延伸時(shí)遇到與模板結(jié)合的探針，其5′-3′外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）就會(huì)將切割探針釋放5′端報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中，遠(yuǎn)離3′端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，5′端報(bào)告基團(tuán)受激發(fā)所發(fā)射的熒光信號(hào)就可以被探頭檢測(cè)到。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。報(bào)告信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)第111頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2目的基因的制備2.1直接分離法2.2基因文庫(kù)技術(shù)分離目的基因

2.3基因組文庫(kù)分離法2.4cDNA基因文庫(kù)分離2.5PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因2.6化學(xué)合成基因第112頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.6化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列第113頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因的化學(xué)合成20世紀(jì)70年代，Khorana提出，

提出體外擴(kuò)增DNA1922-）印度-美國(guó)化學(xué)家遺傳密碼的破譯，獲得1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。第114頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四DNA合成儀的基本工作原理是：將要合成的DNA片段3’端的第一個(gè)核苷酸固定于不溶性載體上．該核苷酸開(kāi)始與另一核苷酸進(jìn)行縮合反應(yīng)，形成二核苷酸分子通過(guò)酸或堿洗脫其一端的保護(hù)基團(tuán)，再次與另一個(gè)5’或3’保護(hù)的核苷酸分子進(jìn)行第二次縮合反應(yīng)，形成三核苷酸分子；再用同樣的步驟與下一個(gè)核苷酸進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)。每循環(huán)反應(yīng)一次就接長(zhǎng)一個(gè)核苷酸，一般一個(gè)循環(huán)只需幾分鐘。接長(zhǎng)的鏈?zhǔn)冀K被固定在不溶的固相載體上，合成結(jié)束后，將寡核苷酸鏈從固相載體上洗脫下來(lái)。第115頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四化學(xué)合成法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確性極高，合成速度較快缺點(diǎn)：合成的寡核苷酸鏈長(zhǎng)度短(不大于80個(gè)堿基)一般用于PCR引物、寡核苷酸探針、人工接頭、較小基因的合成。對(duì)于超過(guò)該法合成范圍的寡核苷酸鏈的合成，可采用分段合成法，再連接組裝成完整的基因。第116頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四圖1基因合成的全片段酶促連接法第117頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四圖2基因合成的酶促填充法第118頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2目的基因的制備直接分離法基因文庫(kù)技術(shù)分離目的基因基因組文庫(kù)分離法

cDNA基因文庫(kù)分離

PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因化學(xué)合成基因第119頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的建立組織可克隆之DNA載體DNAcDNAmRNA部分或完全酶解DNADNA長(zhǎng)度分級(jí)甲基化，雙鏈接頭DNADNA與載體連接引入大腸桿菌鑒定文庫(kù)的克隆數(shù)和特性擴(kuò)增后供長(zhǎng)期儲(chǔ)存篩選出所需要的克隆從中分離出目的基因第120頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因文庫(kù)技術(shù)分離目的基因

基因的克?。韩@得含重組DNA的宿主細(xì)胞克隆基因的分離:從文庫(kù)中分離出目的基因分離基因的鑒定:

確定基因的結(jié)構(gòu)及功能

測(cè)序自動(dòng)測(cè)序儀功能分析預(yù)測(cè)軟件第121頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1目的基因2目的基因的制備3目的基因的分離第122頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因文庫(kù)的篩選和基因分離：在成千上萬(wàn)的克隆中僅極少數(shù)含目的基因，且大多數(shù)基因的產(chǎn)物不具有可選擇的表型特征，如何篩選？：(1)用特異探針進(jìn)行分子雜交；(2)用免疫和生化方法來(lái)檢測(cè)基因產(chǎn)物；(3)用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第123頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雜交：親緣關(guān)系很近的不同來(lái)源的DNA單鏈或RNA單鏈與DNA單鏈之間通過(guò)堿基互補(bǔ)形成雜交分子的過(guò)程。分子雜交第124頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四分子探針標(biāo)記核酸分子探針：用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)記一小段已知核苷酸序列作為探針，探針的序列如果與DNA或RNA序列互補(bǔ)，就可以探知核酸分子。粗線(xiàn)表示分子探針檢測(cè)方法：同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、顏色標(biāo)記第125頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四平板雜交/菌落雜交技術(shù)第126頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3目的基因的分離3.1編碼產(chǎn)物已知的目的基因3.2編碼產(chǎn)物未知的目的基因第127頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3目的基因的分離3.1編碼產(chǎn)物已知的目的基因根據(jù)特異蛋白分離目的基因氨基酸順序反推核苷酸序列蛋白免疫反應(yīng)功能互補(bǔ)法分離基因根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因3.2編碼產(chǎn)物未知的目的基因第128頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.1已知編碼產(chǎn)物的目的基因分離3.1.1根據(jù)特異蛋白分離目的基因功能克隆法：依賴(lài)于基因表達(dá)產(chǎn)物及其生物功能進(jìn)行基因克隆。①分析特異蛋白質(zhì)中氨基酸順序，合成寡核苷酸探針，從文庫(kù)中分離出相應(yīng)基因。第129頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala六肽

對(duì)應(yīng)mRNAQUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCNN=ACGT/U探針序列

CAN-AAP-GTP-CTP-CGQ=CT/UP=AG32種14聚體混合物，其中必有一種14聚體與待測(cè)DNA完全互補(bǔ)第130頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四利用這種方法首次人工合成了胰島素基因。雖然在早期采用這種方式已經(jīng)成功地克隆了許多基因。局限性：兼并密碼子效率低未知基因及產(chǎn)物第131頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四②制備特定的蛋白質(zhì)抗體及蛋白質(zhì)功能檢測(cè)，篩選相應(yīng)的基因。待分離基因的表達(dá)產(chǎn)物—蛋白質(zhì)純化和制備出相應(yīng)抗體。再用特異的蛋白質(zhì)抗體篩選含有目的基因的cDNA表達(dá)文庫(kù)，分離含目的基因的克隆。局限性：特異蛋白必須是已知且分離純化的。將菌落或噬菌斑原位復(fù)制到膜上處理之后蛋白質(zhì)暴露，與第一抗體溫育漂洗未結(jié)合的抗體，加入經(jīng)標(biāo)記的第二抗體能與第一抗體結(jié)合第132頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.1.2功能互補(bǔ)法分離基因基本原理：利用被克隆的DNA片段與寄主細(xì)胞的染色體DNA在功能上有同源互補(bǔ)性來(lái)分離基因。例如：營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因。第133頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四實(shí)例：基因組文庫(kù)DNA→

轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞（leu2,Leu-）→轉(zhuǎn)化細(xì)胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因Leu2(基因型),Leu-（表型）營(yíng)養(yǎng)缺陷型特點(diǎn)：在選擇培養(yǎng)基（一般為基本培養(yǎng)基）上不生長(zhǎng)第134頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.1.3根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因基本原理：從DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)（Genbank

等）中查找有關(guān)基因的序列，以此為核酸探針進(jìn)行雜交篩選。對(duì)雜交后的陽(yáng)性克隆子重組DNA進(jìn)行測(cè)序，與已知基因的核苷酸序列進(jìn)行比較和鑒定，確定是否是待分離的目的基因。第135頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四舉例：菠菜的基因組中尋找耐受重金屬基因?qū)?yīng)mRNAAUC-GUG-UUA-CAU-GAA-GCA

（擬南芥/水稻的Genbank

）探針序列

TAG-CAC-AAT-GTA-CTT-CGT

缺陷：分離的基因一般不是新的基因。第136頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3目的基因的分離3.1編碼產(chǎn)物已知的目的基因根據(jù)特異蛋白分離目的基因氨基酸順序反推核苷酸序列蛋白免疫反應(yīng)功能互補(bǔ)法分離基因根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因3.2編碼產(chǎn)物未知的目的基因第137頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.2編碼產(chǎn)物未知的基因分離采用特殊手段獲得探針，再?gòu)奈膸?kù)中分離；差別雜交(differentialhybridization)，減法雜交（subtractivehybridization）DNA標(biāo)簽法，也叫DNA插入誘導(dǎo)法mRNA差別顯示技術(shù),DD-PCR酵母雙雜交系統(tǒng)染色體步查法第138頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.2.1差別雜交法基本原理：利用兩組細(xì)胞mRNA種類(lèi)的差異，分離克隆差異mRNA所對(duì)應(yīng)的cDNA，用于分離克隆新基因；分別制備兩種細(xì)胞群體的mRNA提取物，以這兩種總mRNA（或其cDNA)，分別篩選由表達(dá)目的基因的細(xì)胞群體構(gòu)建的cDNA文庫(kù)。第139頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四舉例：分離受生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的基因1）構(gòu)建的cDNA文庫(kù)涂鋪在平板上2）一式兩份轉(zhuǎn)至膜上。3）用血清刺激的和未刺激的細(xì)胞的po1y(A)RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄制備放射性標(biāo)記的總cDNA探針4）分別與已轉(zhuǎn)移噬菌體DNA的膜雜交5）通過(guò)對(duì)雜交結(jié)果的仔細(xì)對(duì)比分析，可以找到那些僅與血清刺激細(xì)胞總cDNA探針雜交的或雜交信號(hào)明顯強(qiáng)烈的克隆，它們代表了血清誘導(dǎo)表達(dá)的mRNA。第140頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四根據(jù)目的基因特異性表達(dá)進(jìn)行分離：有的基因只有在某生物的一定的生長(zhǎng)發(fā)育階段或一定的器官中才能表達(dá)。例如，待分離的目的基因只有在植物的根中才能有效表達(dá)，而在其他器官中(如植物的葉)不能表達(dá)。因此用根構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中含有攜帶目的基因cDNA的克隆子，而用葉構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中不含攜帶目的基因cDNA的克隆子。根據(jù)這一性質(zhì)以根和葉的總mRNA(或它們的cDNA)為探針，分別對(duì)兩種cDNA文庫(kù)進(jìn)行雜交比較(圖)。用根的總mRNA(或它們的cDNA)制備的探針對(duì)這兩個(gè)cDNA文庫(kù)進(jìn)行雜交時(shí)，所有克隆子都呈陽(yáng)性反應(yīng)；而用葉的總mRNA(或它們的cDNA)制備的探針進(jìn)行雜交時(shí)，葉cDNA文庫(kù)中的所有克隆子都呈陽(yáng)性反應(yīng)，根cDNA文庫(kù)中的某些克隆子呈陰性反應(yīng)。最后比較4份雜交結(jié)果，便可以在根cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)膜的大量菌落中挑選出含目的基因的菌落。分離特定組織中表達(dá)的基因第141頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四差示雜交法的特點(diǎn)：不需要知道目的基因的序列特別適用于分離在特定組織中表達(dá)的基因特定發(fā)育階段表達(dá)的基因受生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的基因或者分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達(dá)的基因。第142頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四差示雜交法的局限1）反應(yīng)靈敏性不夠高，不適用于低豐度的mRNA的目的基因。2）需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量噬菌斑，十分費(fèi)時(shí)耗力；3）重復(fù)性差。第143頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.2.2減法雜交基本原理：盡量消除兩種樣品共同存在的基因序列，從而有效富集目的基因序列，提高基因篩選分離的敏感性。第144頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1）mRNA減法雜交從表達(dá)目的基因的組織提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再與無(wú)目的基因表達(dá)的組織提取的mRNA做過(guò)量雜交，兩者均表達(dá)的基因產(chǎn)物將形成cDNA/mRNA雜交分子，而特異mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA仍單鏈，將其分離即為差異表達(dá)序列。第145頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四圖用遞減文庫(kù)和探針?lè)蛛xT細(xì)胞受體基因從T細(xì)胞提取RNA假定編碼T細(xì)胞受體的基因僅在T細(xì)胞中表達(dá)而在B細(xì)胞中不表達(dá)用從T細(xì)胞制備的單鏈cDNA與過(guò)量的B細(xì)胞poly(A)RNA雜交，在這兩種類(lèi)型細(xì)胞中均表達(dá)的分子將以cDNA-RNA的形式發(fā)生雜交，那些僅在T細(xì)胞中表達(dá)的cDNA分子(約占總mRNA的2％)仍以游離的單鏈形式存在。從B細(xì)胞制備RNA用羥磷灰石柱分離這種雜交混合物，在一定洗脫條件下，DNA-RNA雜交雙鏈分子結(jié)合在柱上，單鏈cDNA則從柱中流出。回收這些T細(xì)胞特異的單鏈cDNA分子并把它們轉(zhuǎn)變成雙鏈，再克隆至λ噬菌體載體中，產(chǎn)生一個(gè)約含5000個(gè)克隆的遞減文庫(kù)。第146頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2）基因組DNA減法雜交可以用來(lái)分離缺失突變基因。第147頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.2.3mRNA差別顯示技術(shù)mRNAdifferentialdisplaybyRCR,DD-PCR基因的差異表達(dá)：在生物個(gè)體發(fā)育不同階段，或不同的組織與細(xì)胞中或不同環(huán)境下，基因表達(dá)差異。即不同基因有序的時(shí)空表達(dá)方式。差異顯示PCR(DD-PCR)：通過(guò)對(duì)特定組織類(lèi)型的總mRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳，并找出待測(cè)組織和對(duì)照之間的特異擴(kuò)增條帶。第148頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四差異顯示PCR(DD-PCR）的引物:3’-端錨定引物，5’-T11MN或5’-T12MN通式表示。其中M為除了T以外的任何一種核苷酸（即A、G或C），而N則為任何一種核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12種不同的排列組合方式。5’端隨機(jī)引物：10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，20種全部的240組引物，以反轉(zhuǎn)錄第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以得到20000條DNA帶，基本涵蓋了一定發(fā)育階段某種類(lèi)型細(xì)胞所表達(dá)的全部mRMA。第149頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四DD－PCR第150頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第151頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四切割差異條帶，回收cDNA制備探針在基因文庫(kù)中篩選，獲得該差異片段對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng)cDNA或者完整基因第152頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四優(yōu)點(diǎn)：

1)可以同時(shí)比較多個(gè)樣品表達(dá)的差異；

2)可以同時(shí)檢測(cè)“上游”及“下游”的基因；

3)檢測(cè)靈敏度高，所需樣品少，經(jīng)PCR擴(kuò)增一些低峰度的mRNA也可以被檢測(cè)出來(lái)；

4)結(jié)合使用了PCR和序列膠電泳分析兩項(xiàng)技術(shù)，使本方法顯得較單方便。第153頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四局限性：1)假陽(yáng)性比例高（50%～75%）；同一長(zhǎng)度的條帶，含有多種DNA序列；鄰近條帶回收時(shí)，造成人為誤差；

mRNA3’-端序列保守性高，而常用3’-端cDNA作探針。2)擴(kuò)增的差別條帶分子長(zhǎng)度比較短?。?10～450bp）；

第154頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Ac/Ds玉米轉(zhuǎn)座子

第155頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

T-DNA插入基因組

第156頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.2.4DNA標(biāo)簽法也稱(chēng)DNA插入誘變法分離目的基因?；驹恚阂欢翁囟―NA序列插入到植物基因的內(nèi)部或鄰近位置時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)該基因發(fā)生突變形成突變體植株，或者在插入位置產(chǎn)生一個(gè)新基因。以插入序列DNA分子探針，從突變體植株的基因組DNA文庫(kù)中篩選突變基因片段。再以此為探針，從野生型植株中克隆出該目的基因。

第157頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)座子載體構(gòu)建↓

轉(zhuǎn)化植物（T1，雜合子)收獲T2種子↓

篩選T2，獲突變體↓

提取其DNA,建立基因組文庫(kù)↓

以轉(zhuǎn)座子為探針，篩選突變體文庫(kù)↓

PCR技術(shù)克隆轉(zhuǎn)座子兩側(cè)的DNA序列↓

利用側(cè)翼DNA序列作探針從野生型植物的基因組文庫(kù)中釣取基因↓

基因功能的驗(yàn)證

轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法克隆基因第158頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

3.2.5酵母雙雜合系統(tǒng)

---利用生物大分子之間的互作分離基因轉(zhuǎn)錄激活因子參與真核生物的基因轉(zhuǎn)錄。ADBD許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上可以分開(kāi)的、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成.第159頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四酵母雙雜交法原理:利用釀酒酵母的GAL4蛋白質(zhì)N-端和C-端分別融合的兩種蛋白質(zhì)相互作用可激活具有UAS（upstreamactivatingsequence，上游激活序列）報(bào)告基因表達(dá)篩選目的基因的方法。i.

GAL4蛋白質(zhì)是一個(gè)調(diào)控基因，控制半乳糖利用酶類(lèi)基因的表達(dá)，這些基因的5’-端存在UAS序列；ii.

GAL4存在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：N-端(1-147)具有UAS-DNA結(jié)合域(DNA-bindingdomain,BD),C-端(768-881)具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcriptionalactivationdomain,AD)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可以單獨(dú)起作用。ADBD第160頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第161頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

iii.

如果AD和BD分別與兩個(gè)基因編碼序列融合，且兩種蛋白質(zhì)能相互發(fā)生結(jié)合，就可導(dǎo)致GAL1-LacZ基因的表達(dá)。其中與AD融合的基因稱(chēng)之為釣餌基因，與BD融合的基因可稱(chēng)之為目的基因(即建立的基因文庫(kù))。

第162頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第163頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四酵母雙雜交技術(shù)的基本原理第164頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1）已知蛋白之間相互作用的檢測(cè)：2）蛋白質(zhì)的功能域研究：通過(guò)對(duì)其中某一個(gè)蛋白質(zhì)作缺失或定點(diǎn)突變，再用此系統(tǒng)檢測(cè)是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關(guān)鍵氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質(zhì)基因與AD基因構(gòu)建成“誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，將某一器官或組織的cDNA文庫(kù)與BD基因構(gòu)建成“獵物”基因庫(kù)，共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，可篩到與感興趣蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的cDNA序列，并推測(cè)其蛋白質(zhì)序列。

用途第165頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.2.6染色體步差法分離目的基因

---基因定位克隆技術(shù)

利用已知基因或DNA分子標(biāo)記來(lái)分離與其緊密連鎖的目的基因。已知基因或分子標(biāo)記做探針第166頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四目的基因的制備和分離2.1直接分離法2.2基因文庫(kù)技術(shù)分離目的基因2.3基因組文庫(kù)分離法2.4cDNA基因文庫(kù)分離2.5PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因2.6化學(xué)合成基因第167頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四思考題圖示說(shuō)明考斯質(zhì)粒基因組文庫(kù)的構(gòu)建，指出與λ噬菌體載體的區(qū)別。有何優(yōu)缺點(diǎn)？cDNA基因文庫(kù)有何優(yōu)點(diǎn)？如何構(gòu)建？怎么樣樣估算基因組文庫(kù)大??？結(jié)合圖示簡(jiǎn)要說(shuō)明λ噬菌體基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程。什么叫差別雜交？簡(jiǎn)述其原理？第168頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第169頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四本章重點(diǎn)和思考題目的基因的概念基因文庫(kù)的概念基因組文庫(kù)的概念及操作步驟。cDNA文庫(kù)的概念及操作步驟基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的優(yōu)缺點(diǎn)？什么叫差別雜交？簡(jiǎn)述其原理？第170頁(yè)，共188頁(yè)，2023年，2月20日，星期四例如，已知某目的基因位于1