基因工程的基本技術(shù)

基因工程的基本技術(shù)第1頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

第2頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四主要內(nèi)容核酸提取技術(shù)凝膠電泳技術(shù)PCR技術(shù)DNA重組技術(shù)核酸雜交技術(shù)基因文庫(kù)構(gòu)建基因工程技術(shù)重組子克隆第3頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因工程的基本技術(shù)

之一第一節(jié)第4頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一、核酸提取技術(shù)核酸包括脫氧核糖核酸（

DNA

）和核糖核酸（RNA）;脫氧核糖核酸（DNA

）包括線(xiàn)狀基因組DNA和環(huán)狀DNA（質(zhì)粒DNA）。第5頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1、植物組織中基因組DNA的提取思考：DNA如何從細(xì)胞中取出？第6頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ⅰ植物組織中基因組DNA的提取原理：用機(jī)械研磨使組織和細(xì)胞破碎，然后加入SDS、CTAB等離子型表面活性劑，使細(xì)胞膜和核膜破裂，解聚核中的核蛋白（并與蛋白質(zhì)形成混合物），然后在酚和氯仿等表面活性劑的作用下使蛋白變性，再經(jīng)離心除去組織和變性蛋白，上清夜加乙醇使DNA沉淀。第7頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四再思考：1、研磨破碎組織必須在低溫下進(jìn)行。------為什么？2、幼嫩組織DNA的得率高還是低？防止DNA降解。得率高！第8頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ⅱ提取DNA的質(zhì)量鑒定：

DNA的相對(duì)完整性：凝膠電泳

DNA的純度：測(cè)OD值吸收峰：DNA紫外光260nm

蛋白質(zhì)紫外光280nm比值：OD260/280=1.8-2.0較純

OD260/280<1.8-2.0雜質(zhì)多第9頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2、質(zhì)粒DNA的提取基因組DNA質(zhì)粒DNA質(zhì)粒具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。第10頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ⅰ質(zhì)粒DNA提取方法：堿裂解法、煮沸法、SDS法等ⅱ

堿裂解法原理：

在堿性條件下，雙連DNA氫鍵斷裂，結(jié)構(gòu)破壞變性，環(huán)狀超螺旋質(zhì)粒不充分變性。在中性條件下變性質(zhì)?；謴?fù)原來(lái)構(gòu)型，而線(xiàn)性大分子細(xì)菌DNA不能復(fù)性呈不溶物而經(jīng)離心除去。第11頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四抽提質(zhì)粒DNA所需的溶液：§、溶液Ⅰ：50mol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl

（pH8.0），10mmol/LEDTA(pH8.0)；§、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS(w/v)，現(xiàn)配現(xiàn)用；§、溶液Ⅲ：3mol/LKAc，用冰醋酸調(diào)pH值至

5.2；第12頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四實(shí)驗(yàn)步驟1、接種、搖菌；2、把菌液放入Ep管中，離心，棄上清；3、加入200μL預(yù)冷的含Rnase的溶液I，渦旋混勻；4、加入200μL的溶液Ⅱ，溫和混勻，室溫靜置5min；5、加入200μL的溶液Ⅲ，溫和混勻，冰浴15min；6、離心，吸上清至另一EP管；第13頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四7、加等量的氯仿/異戊醇（V：V=24：1）抽提，離心；8、移取上清液，加入2倍體積無(wú)水乙醇，混勻，-20℃靜置5min，離心，棄上清；9、用70%乙醇洗DNA沉淀2次，離心，倒掉乙醇，吹干；10、用TE（pH8.0，）溶解質(zhì)粒DNA，并加入RnaseA達(dá)濃度為10μg/ml，37℃放置1小時(shí)11、取1μL質(zhì)粒DNA用于電泳檢測(cè)。第14頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ⅲ抽提出質(zhì)粒的構(gòu)型：1）超螺旋質(zhì)粒DNA:在提取質(zhì)粒過(guò)程中，超螺旋DNA占大部分。2）開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA：如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松馳型的環(huán)狀分子，稱(chēng)開(kāi)環(huán)DNA。3）線(xiàn)狀質(zhì)粒DNA：如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線(xiàn)狀DNA。第15頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四抽提出的質(zhì)粒三種構(gòu)型電泳結(jié)果：1）開(kāi)環(huán)

2）線(xiàn)狀

3）超螺旋+-電泳方向第16頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四DNA的濃縮與純化（P31-33）?

DNA的濃縮：

＠乙醇沉淀法

＠正丁醇抽提法

＠聚已二醇濃縮法?

DNA的純化：

＠氯化銫－溴化已錠連續(xù)梯度離心法

＠離子交換層析法

＠瓊脂糖凝膠電泳洗脫法

＠“基因純”試劑純化第17頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四二、凝膠電泳技術(shù)電泳目的：對(duì)核酸分子進(jìn)行分離和檢測(cè)第18頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳核酸分子分離的原因：

在堿性環(huán)境下，核酸分子帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)的作用下，分子在凝膠多孔性剛性濾孔中從負(fù)極向正極泳動(dòng)，其中主要由于分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)達(dá)到分離不同大小核酸分子的目的。電泳類(lèi)型：第19頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（一）、影響電泳遷移率的因素1、分子本身的影響分子的大?。盒t快帶電荷數(shù)：多則快分子構(gòu)型：超螺旋>解螺旋2、電場(chǎng)：直流電場(chǎng)電壓高則快電壓太高則結(jié)果不準(zhǔn)確常用3~5V/CM第20頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四操作簡(jiǎn)單；分辨范圍：100bp-60kb；有效范圍：200bp-50kb；分辨率：100bp左右3、支持物介質(zhì)低熔點(diǎn)瓊脂糖：用于DNA的回收（65℃）A種類(lèi)：瓊脂糖（agarose）凝膠：第21頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四常用于微衛(wèi)星、測(cè)序分析；分辨范圍：5-500bp；分辨率：1bp聚丙烯酰胺凝膠：注意：有神經(jīng)毒性??！第22頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四?凝膠分辨DNA的能力：

瓊脂糖聚丙烯酰胺凝膠濃度分辨范圍(kb)濃度分辨范圍(bp)0.3%5-603.51000-20000.6%1-20590-500

0.7%0.8-108.060-400

0.9%0.5-71240-200

1.2%0.4-61525-1601.5%0.2-3206-100B

凝膠濃度:濃度大，篩孔小，適合小分子電泳；濃度小，篩孔大，適合大分子電泳凝膠濃度的選擇：取決于待檢測(cè)的DNA的大小原來(lái)如此！第23頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四4

、電泳緩沖液

pH值：偏堿性，帶負(fù)電荷

離子濃度：離子濃度高電流大發(fā)熱快膠溶解種類(lèi)：TAE（Tris+EDTA+醋酸）:電流大，易產(chǎn)生離子富集TBE

（Tris+EDTA+硼酸）:緩沖能力最強(qiáng)TPE（Tris+EDTA+磷酸）:緩沖能力低TNE（Tris+EDTA+醋酸鈉）第24頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四電泳緩沖液的選擇TBE緩沖力大于TAE；高分子量的DNA選用TAE，否則選用TBE；基因組DNA酶切電泳選用TAE；☆實(shí)驗(yàn)技巧：?問(wèn)題：電泳緩沖液使用一定時(shí)間后由于離子的富集作用，DNA在凝膠中出現(xiàn)跑不動(dòng)現(xiàn)象。解決辦法：一是更換成新配置的電泳緩沖液；二是把電泳槽中倒出混勻后重新使用。－－－WHY?大家注意了！第25頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（二）、電泳指示劑和DNA染色劑Ⅰ、類(lèi)型：溴酚蘭，二甲苯青Ⅱ、作用：(1)預(yù)知電泳的速率及方向；(2)使樣品呈現(xiàn)顏色，便于加樣；(3)與一些高濃度蔗糖或其它物質(zhì)增加DNA的密度。電泳指示劑第26頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四DNA染色劑熒光染色劑,溴化已錠：（EB,Ethidiumbromid）吸收300~360nmUV（紫外光）放出590nm可見(jiàn)光（橙紅色）硝酸銀：常用0.1%Goldview染料吸收紫外光，放出綠光（雙鏈DNA）或橙紅色光（單鏈DNA）第27頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（三）凝膠電泳過(guò)程1、制膠：稱(chēng)取一定量的瓊脂糖用電泳緩沖液融解后倒入制膠槽配制；2、放膠：膠放入電泳槽，加入電泳緩沖液至沒(méi)過(guò)膠2－3mm,3、點(diǎn)樣：把DNA樣品加入上樣緩沖液混勻上樣4、電泳：接通電源，調(diào)好電壓5、看結(jié)果：紫外光觀察。第28頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1、單向電泳2、脈沖電場(chǎng)電泳（CHEF）3、反轉(zhuǎn)電場(chǎng)電泳（FIGE）（四）、電泳種類(lèi)－＋第29頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四中文名稱(chēng)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1、PCR原理：

變性溫度下，DNA雙鏈變性雙螺旋解開(kāi)成單鏈DNA，在退火溫度中人工合成的特異引物根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與單鏈DNA特異結(jié)合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸溫度下不同的脫氧核苷酸按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則在引物的引導(dǎo)下合成與模板DNA互補(bǔ)的新鏈，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。技術(shù)3：PCR技術(shù)(polymerasechainreaction)第30頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR操作流程94℃50℃72℃第31頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2、

PCR反應(yīng)過(guò)程：變性：DNA雙鏈變?yōu)閱捂?；退火：引物與模板結(jié)合；延伸：合成互補(bǔ)鏈；上述過(guò)程通過(guò)PCR儀的程序設(shè)計(jì)及自動(dòng)運(yùn)作完成。第32頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3、PCR反應(yīng)體系：體系成分：模板DNA、引物、Taq酶(熱穩(wěn)定性)、dNTP、反應(yīng)緩沖液（Mg2+ 、BSA、Tween20、DTT、Tris.cl）

。第33頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1）、引物（寡聚核苷酸）§一般成對(duì)出現(xiàn)，長(zhǎng)度為15-30個(gè)核苷酸；§使用濃度：0.1-0.5uM，高達(dá)1uM；§引物設(shè)計(jì)原則：

1、G+C含量45-55%；

2、Tm值高于55；

3、引物特異性；

4、引物擴(kuò)增跨度；

5、是否形成引物二聚體第34頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2）、模板DNA：

§基因組DNA、質(zhì)粒DNA、其它DNA片段；

§質(zhì)量要求：不高3）、Taq酶(熱穩(wěn)定性)：

§常規(guī)酶

§高保真酶：ExTaq§LaTaq酶4）、反應(yīng)緩沖液成分：

§BSA、Tween20、DTT、明膠----保護(hù)酶作用

§Tris.cl提供緩沖作用第35頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四§(2)、

dNTP的濃度：常用100-200μmol/L，不能低于20μmol/L，特異性、保真性；

4、影響PCR產(chǎn)量、質(zhì)量的因素：§(1)、

Taq酶：常用1U/25μL

濃度低，擴(kuò)增產(chǎn)物不夠；

濃度高，非特異性擴(kuò)增增加；酶的活性；第36頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四§(3)、模板：主要考慮純度及使用量對(duì)純度要求不高，但含有酚、氯仿等雜質(zhì)則難以成功。使用量從幾個(gè)ng到100ng.§(4)、引物濃度：

0.1-0.5μmol/L之間，過(guò)多則非特異擴(kuò)增增加，形成引物二聚體；§(5)、

Mg2+濃度：常用0.5-2.5mmol/L；影響：酶的活性、引物-模板退火、特異性第37頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

§(6)、

PCR反應(yīng)程序設(shè)定：(1)、變性溫度和時(shí)間：

要求變性徹底，但要考慮酶的半衰期：92.5℃（2小時(shí)）95℃（40min）97℃（5min）94℃變性比較徹底，酶的半衰期也不短。(2)、引物退火溫度Tm與時(shí)間；

Tm值由引物ATGC數(shù)決定每A、T計(jì)為2℃，G、C計(jì)為4℃，時(shí)間一般為40秒到60秒(3)、引物延伸溫度與時(shí)間：

72℃最佳，30-100nt/s，也有用68℃如LaTaq(4)、循環(huán)數(shù)：

25-35cycles之間，過(guò)多則非特異擴(kuò)增增加；平臺(tái)效應(yīng)；第38頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四以普通PCR50lreactionsolution為例)10PCRbuffer25mMMgCl2dNTPMixture(10mMeach)primer1（10M)primer2(10M)Taqpolymerase(5U/l)DNAtemplate(0.1g/l)ddH2Ototal5l(1)4l(2mM)1l(0.1mM)1l(0.2M)1l(0.2M)0.6l(2U/50l)1l36.5l50l5、PCR例子（Exampleofreactionsolution）§反應(yīng)體系配置：第39頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四§

PCRthermalprogram94C94CTm72C72C4C1min30sec30sec1min5Cendless30cycles循環(huán)數(shù)HeatdenaturationHeatdenaturePrimersannealingExtensionLastextensionEndingreactionTa:annealingtemperature設(shè)計(jì)的反應(yīng)程序相應(yīng)作用第40頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四6、PCR的種類(lèi)RT-PCR特異PCR錨定PCR反向PCR套式PCR不對(duì)稱(chēng)PCR長(zhǎng)程PCR鍋柄PCR免疫PCRRAPD定量PCR原位PCR第41頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

F

R（1）特異PCR

擴(kuò)增所用的引物是特異的，擴(kuò)出的產(chǎn)物也是特定的。

（2）RT-PCR：是一類(lèi)以mRNA為最初模板的基因的擴(kuò)增。AAAAAAAAAA5`CAPTTTTTTTTTTT第42頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（3）反向PCR：根據(jù)已知序列擴(kuò)增兩側(cè)序列的方法。已知序列未知序列未知序列酶切酶切引物2引物1此PCR操作過(guò)程：酶切基因組DNA連接環(huán)化目的DNA用引物1和引物2組合擴(kuò)增出側(cè)翼序列第43頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（4）定量PCR用途：分析基因組中某個(gè)基因的拷貝數(shù)或分析基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)豐度。第44頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。概念：第45頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

原理：通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板進(jìn)行定量及定性的分析。初始模板量X0的對(duì)數(shù)值與C(T)值之間呈線(xiàn)性關(guān)系：logX0=-log(1+Ex)*Ct+logN

第46頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04閾值線(xiàn)Ct值Ct值Ct值的定義

在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，