免疫凝集類實驗演示文稿

免疫凝集類實驗演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有52頁\編輯于星期三（優(yōu)選）第單元免疫凝集類實驗現(xiàn)在是2頁\一共有52頁\編輯于星期三顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接反應(yīng)，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下出現(xiàn)的肉眼可見的凝集現(xiàn)象。常用的試驗方法有玻片凝集法和試管凝集法。本實驗以試管法凝集試驗——肥大試驗（Widaltest）驗證凝集反應(yīng)及其特點。現(xiàn)在是3頁\一共有52頁\編輯于星期三

Widaltest原理

將已知的顆粒性抗原（傷寒沙門菌）定量加入到系列倍比稀釋的待測血清中，根據(jù)各血清稀釋度凝集情況，測定血清中有無相應(yīng)抗體及其相對含量?，F(xiàn)在是4頁\一共有52頁\編輯于星期三實驗器材和材料器械

試管、吸管、恒溫水浴箱等試劑

抗體待測傷寒沙門菌免疫血清、抗原傷寒沙門菌診斷菌液（7×108/ml)、生理鹽水現(xiàn)在是5頁\一共有52頁\編輯于星期三實驗方法（Widaltest）

取試管7支，依次編號并做好標(biāo)記。每支試管中加生理鹽水0.5ml。倍比稀釋血清：

取1∶20稀釋的待測血清0.5ml加入到第1管，混勻后吸取0.5ml加入到第2管，如此連續(xù)稀釋至第6管，混勻后吸取0.5ml棄去；第7管不加血清作為陰性對照。

加診斷菌液：

每管加傷寒沙門菌H或O診斷菌液0.5ml，此時各管血清最終稀釋度依次為1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560搖勻后置37℃水浴2～4h，取出觀察結(jié)果或放室溫過夜，次日觀察結(jié)果?，F(xiàn)在是6頁\一共有52頁\編輯于星期三試管凝集法操作程序試管號1234567生理鹽水（ml)0.50.50.50.50.50.50.5待測血清（ml)0.50.50.50.50.50.5傷寒O菌液(ml)0.50.50.50.50.50.50.5血清稀釋度1:801:1601:3201:6401:12801:2560現(xiàn)在是7頁\一共有52頁\編輯于星期三0.50.50.50.50.5棄掉0.5結(jié)果

1234567菌液試管凝集試驗原理現(xiàn)在是8頁\一共有52頁\編輯于星期三

結(jié)果判斷實驗結(jié)果 將試管置于有良好光源和黑色背景下，觀察管底凝集物的范圍和上清液的濁度，記錄凝集程度，判斷凝集效價用++++、+++、++、+、-等符號記錄凝集效價。對照管：應(yīng)無凝集現(xiàn)象試驗管：“++++”：上清液澄清，細(xì)菌全部凝集，凝集塊全部沉于管底

“+++”：上清液稍混濁，細(xì)菌大部分凝集并沉于管底

“++”：上清液較混濁，約50%的細(xì)菌凝集并沉于管底

“+”：上清液混濁，僅少量細(xì)菌凝集

“-”：不凝集，液體濁度與對照管相同血清抗體效價：試驗管出現(xiàn)“++”以上的凝集現(xiàn)象即可判斷為陽性；以出現(xiàn)“++”凝集的最高血清稀釋度為該待測血清的抗體效價?，F(xiàn)在是9頁\一共有52頁\編輯于星期三注意事項凝集反應(yīng)只有在抗原抗體比例適當(dāng)時，才能出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)一般情況下，隨著血清濃度的逐漸稀釋，凝集反應(yīng)越來越弱，但在抗體濃度過高時，反而無凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，此為前帶現(xiàn)象，出現(xiàn)該情況時，須加大抗體稀釋倍數(shù)重新試驗。直接凝集試驗也可以用玻片法以鑒定傷寒沙門菌為例：取潔凈載玻片2張，在玻片的左上角分別標(biāo)明“1”、“2”；加入已知抗體（傷寒沙門菌診斷血清）和待測菌液（傷寒沙門菌或其他細(xì)菌）。1生理鹽水

+傷寒桿菌

1:40傷寒桿菌診斷學(xué)清

+

傷寒桿菌2生理鹽水

+大腸桿菌

1:40傷寒桿菌診斷學(xué)清

+

大腸桿菌玻片凝集試驗鑒定傷寒沙門菌現(xiàn)在是10頁\一共有52頁\編輯于星期三玻片凝集試驗(slideagglutinationtest)顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合

出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象

在玻片上YYY+？Y+現(xiàn)在是11頁\一共有52頁\編輯于星期三將載玻片置黑色背景上觀察。在診斷血清中，混懸液由混濁變澄清并出凝集物，則為陽性結(jié)果；混懸液仍為勻混濁的乳狀液，則為陰性結(jié)果。肉眼觀察不夠清晰者，可在低倍鏡下觀察。

結(jié)果分析現(xiàn)在是12頁\一共有52頁\編輯于星期三實驗討論肥大試驗是一種經(jīng)典的半定量試管凝集試驗。在臨床上主要用已知的傷寒沙門菌O或H抗原檢測血清中有無相應(yīng)的特異性抗體及其效價，以協(xié)助診斷傷寒病或供流行病學(xué)調(diào)查。凝集反應(yīng)只有在抗原抗體比例適當(dāng)時，才能出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。臨床上開展的外斐反應(yīng)是利用與立克次體有共同耐熱性多糖抗原的變形桿菌OX19、OX2、OXk菌株代替立克次體作為已知抗原，與患者血清進(jìn)行凝集試驗，以輔助診斷斑疹傷寒、恙蟲病等立克次體疾病?，F(xiàn)有OX19、OX2、OXk三種診斷菌液和待測血清，請寫出利用試管凝集法進(jìn)行的外斐試驗的操作步驟?，F(xiàn)在是13頁\一共有52頁\編輯于星期三思考題為什么臨床上不直接利用立克次體作為已知抗原進(jìn)行血清學(xué)診斷呢？

現(xiàn)在是14頁\一共有52頁\編輯于星期三驗證實驗二間接凝集實驗

現(xiàn)在是15頁\一共有52頁\編輯于星期三間接凝集實驗（indirectAgglutinationTest)

將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無關(guān)、大小均勻的惰性載體顆粒表面，使其成為致敏載體，然后再與相應(yīng)抗體（或抗原）結(jié)合，在適當(dāng)電解質(zhì)存在的條件下，載體顆粒被動地發(fā)生凝集，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。

以膠乳凝集試驗檢測類風(fēng)濕因子（rheumatoidfactor,RF）為例驗證間接凝集實驗的原理和特點現(xiàn)在是16頁\一共有52頁\編輯于星期三

實驗原理

類風(fēng)濕因子（RF）是一種抗變性IgG的自身抗體，具有與人或動物變性IgG結(jié)合的特點。將處理過的人IgG與聚苯乙烯膠乳顆粒結(jié)合成致敏顆粒，當(dāng)待測血清中含有RF時，則與致敏顆粒上變性的IgG發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象?，F(xiàn)在是17頁\一共有52頁\編輯于星期三膠乳顆粒人IgG致敏致敏膠乳NS凝集顆粒待測RF現(xiàn)在是18頁\一共有52頁\編輯于星期三實驗器材

器械 黑色方格反應(yīng)板、毛細(xì)滴管、試管、試管架、吸耳球、恒溫水浴箱等試劑 人IgG致敏膠乳試劑（市售類風(fēng)濕因子檢測試劑） 類風(fēng)濕因子陽性血清和陰性血清：臨床標(biāo)本篩選獲得

待測血清現(xiàn)在是19頁\一共有52頁\編輯于星期三實驗方法

待測血清、陽性血清、陰性血清分別用生理鹽水作1∶20稀釋。在黑色方格反應(yīng)板上取3個格，用毛細(xì)滴管分別滴加稀釋待測血清、陽性血清、陰性血清各1滴，然后每格加入人IgG致敏膠乳試劑1滴。連續(xù)輕輕搖動反應(yīng)板，2～3分鐘后觀察結(jié)果。現(xiàn)在是20頁\一共有52頁\編輯于星期三結(jié)果判斷

若膠乳顆粒凝集且液體澄清者為陽性反應(yīng)膠乳顆粒不凝集仍保持均勻膠乳狀者為陰性反應(yīng)現(xiàn)在是21頁\一共有52頁\編輯于星期三注意事項試劑應(yīng)4℃保存，嚴(yán)禁凍結(jié)，用時搖勻；所有試驗器皿和反應(yīng)板均應(yīng)洗凈、干燥；若陰性對照出現(xiàn)凝集，則表示致敏乳膠試劑有質(zhì)量問題，不能使用?，F(xiàn)在是22頁\一共有52頁\編輯于星期三實驗結(jié)果分析和討論膠乳凝集試驗方法簡便、快速，但易發(fā)生非特異性凝集反應(yīng)，試分析如何判定實驗的非特異性凝集反應(yīng)。判斷凝集或凝集程度除目測外，是否還有其他方法？現(xiàn)在是23頁\一共有52頁\編輯于星期三驗證實驗三間接凝集抑制實驗現(xiàn)在是24頁\一共有52頁\編輯于星期三概念間接凝集抑制試驗（indirectagglutinationinhibitiontest）是以抗原致敏的載體及相應(yīng)抗體作為診斷試劑，用于檢測標(biāo)本中是否含有與致敏抗原相同的抗原的試驗。檢測時先將抗體試劑與待測標(biāo)本混合，再加入抗原致敏的載體。若標(biāo)本中沒有與抗體試劑相對應(yīng)的抗原，則抗體試劑與隨后加入的致敏載體上的抗原結(jié)合而出現(xiàn)凝集；若標(biāo)本中存在與抗體試劑相對應(yīng)的抗原，抗體先與之結(jié)合，隨后加入的致敏載體上的抗原則無抗體結(jié)合，凝集反應(yīng)被抑制。本實驗以檢測尿絨毛膜促性腺激素（HCG）的妊娠免疫診斷試驗為例進(jìn)行膠乳凝集抑制現(xiàn)象的觀察和驗證?，F(xiàn)在是25頁\一共有52頁\編輯于星期三實驗原理

孕婦尿液中含有HCG，正常人尿中無HCG。當(dāng)向孕婦尿中加入一定量抗HCG抗體時，尿HCG即與抗HCG發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，此時，再加入膠乳抗原（吸附有HCG的聚苯乙烯膠乳顆粒），因抗體被消耗，故不能發(fā)生凝集，即凝集被抑制，為凝集抑制試驗陽性；反之，若待檢尿中無HCG（非妊娠尿），則加入的抗HCG抗體未被結(jié)合和消耗，可與隨后加入的乳膠抗原發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)小顆粒，即凝集未被抑制，為凝集抑制試驗陰性?，F(xiàn)在是26頁\一共有52頁\編輯于星期三待測尿液(含HCG)抗HCG特異結(jié)合抗原抗體復(fù)合物NS＋致敏膠乳無凝集顆粒為陽性現(xiàn)在是27頁\一共有52頁\編輯于星期三待測尿液(無HCG)抗HCG無結(jié)合NS＋致敏膠乳有凝集顆粒為陰性現(xiàn)在是28頁\一共有52頁\編輯于星期三實驗器材和材料器械 黑色方格反應(yīng)板、毛細(xì)滴管試劑與標(biāo)本膠乳抗原（HCG致敏的膠乳顆粒）、抗HCG抗體（商品化）孕婦尿液、正常人尿液、待測尿液。生理鹽水現(xiàn)在是29頁\一共有52頁\編輯于星期三實驗方法在黑色方格反應(yīng)板上取3個格，用毛細(xì)滴管分別加待測尿液、孕婦尿液、正常人尿液（或生理鹽水）1滴，然后每格加抗HCG抗體1滴，輕輕搖動1～2min。于上述3格中各滴加膠乳抗原1滴，輕輕搖動2～3min后觀察結(jié)果?，F(xiàn)在是30頁\一共有52頁\編輯于星期三結(jié)果判斷如肉眼觀察結(jié)果不清楚，可用顯微鏡在低倍鏡下觀察樣本待測尿液孕婦尿液正常人尿(或NS)現(xiàn)象凝集或不凝集不凝集凝集結(jié)果判定非妊娠尿或妊娠尿陽性對照陰性對照現(xiàn)在是31頁\一共有52頁\編輯于星期三

注意事項待測尿液宜采用晨尿，不能及時檢測檢測的標(biāo)本應(yīng)保存于2~8℃，不能使用嚴(yán)重蛋白尿、血尿、菌尿標(biāo)本；試劑應(yīng)4℃保存，切勿凍存。使用前使試劑接近室溫并搖勻；應(yīng)同時設(shè)置陽性、陰性對照，以排除非特異性凝集；所加液滴應(yīng)大小一致；結(jié)果應(yīng)在強光下觀察，觀察時應(yīng)置黑色背景下或稍傾斜反應(yīng)板?，F(xiàn)在是32頁\一共有52頁\編輯于星期三實驗結(jié)果分析和討論妊娠免疫診斷試驗是臨床常用的經(jīng)典膠乳凝集抑制試驗，操作簡便、快速、特異性強，停經(jīng)35～40天以上的孕婦可測得陽性結(jié)果。需注意的是，絨毛膜上皮癌、葡萄胎及睪丸畸胎瘤病人尿中HCG含量遠(yuǎn)較正常妊娠尿液為高，將尿液作1∶200稀釋后仍可呈陽性反應(yīng)。待測尿液以晨尿為好。測試時應(yīng)注意標(biāo)本及各診斷試劑加入的順序，并設(shè)立陽性和陰性對照。試分析若隨意變更加樣順序，如先加標(biāo)本、再加膠乳抗原，最后加抗HCG或先加膠乳抗原、再加抗HCG，最后加標(biāo)本，結(jié)果如何？

凝集抑制試驗可用于確證呈陽性反應(yīng)的間接凝集實驗是否是非特異凝集反應(yīng)，試討論如何進(jìn)行該項實驗？

現(xiàn)在是33頁\一共有52頁\編輯于星期三

不完全抗體檢測的實驗設(shè)計（設(shè)計性實驗）

現(xiàn)在是34頁\一共有52頁\編輯于星期三實驗?zāi)康?/p>

采用紅細(xì)胞作為凝集試驗的抗原，創(chuàng)造條件設(shè)法使相鄰的紅細(xì)胞靠近、聚攏、凝集從而達(dá)到對紅細(xì)胞不完全抗體的檢測目的。現(xiàn)在是35頁\一共有52頁\編輯于星期三問題背景資料

抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合后，在適宜的介質(zhì)參與下可出現(xiàn)可見的抗原抗體反應(yīng)。但有些分子較小的7S的IgG類抗體，體積小，長度短，在適宜介質(zhì)中與相應(yīng)抗原結(jié)合后不出現(xiàn)可見反應(yīng)，這種抗體稱為不完全抗體，如抗紅細(xì)胞Rh抗原的抗體等，這種抗紅細(xì)胞不完全抗體的存在是引起輸血不良反應(yīng)的主要原因之一，有必要設(shè)計檢測不完全抗體，特別是針對紅細(xì)胞抗原不完全抗體的的檢測方法。現(xiàn)在是36頁\一共有52頁\編輯于星期三實驗設(shè)計的策略不完全抗體只含有一個抗原結(jié)合位點，

能與相應(yīng)抗原結(jié)合，但不產(chǎn)生可見反應(yīng)，因此也稱單價抗體?？辜t細(xì)胞不完全抗體與紅細(xì)胞結(jié)合后，因抗體分子小，不能有效地連接紅細(xì)胞，僅使紅細(xì)胞處于致敏狀態(tài)，而不出現(xiàn)可見的凝集反應(yīng)。在實驗設(shè)計時，基本的思路是采用紅細(xì)胞作為凝集試驗的抗原，創(chuàng)造條件設(shè)法使相鄰的紅細(xì)胞靠近、聚攏、凝集從而達(dá)到對紅細(xì)胞不完全抗體的檢測目的?，F(xiàn)在是37頁\一共有52頁\編輯于星期三實驗方案討論凝集反應(yīng)可分為哪兩個階段？其中可見反應(yīng)階段主要受哪些因素影響？可否根據(jù)影響因素，通過設(shè)置低離子強度介質(zhì)以降低紅細(xì)胞的Zeta電位和加入高價陽離子鹽類以中和紅細(xì)胞表面負(fù)電荷等來促使紅細(xì)胞凝集？此時又如何判斷是特異性凝集還是非特異性凝集？紅細(xì)胞表面的不完全抗體是IgG，即免疫球蛋白，此時若在反應(yīng)體系中加入抗人球蛋白，會出現(xiàn)何結(jié)果？抗人球蛋白如何制備？如何檢測血清中未與紅細(xì)胞結(jié)合和與紅細(xì)胞結(jié)合的不完全抗體？現(xiàn)在是38頁\一共有52頁\編輯于星期三免疫凝集分析系統(tǒng)——全自動血型分析系統(tǒng)（臨床見習(xí)）

現(xiàn)在是39頁\一共有52頁\編輯于星期三基本原理全自動血型分析系統(tǒng)采用柱凝集血型診斷系統(tǒng)試劑卡技術(shù)和數(shù)字圖像處理技術(shù)自動實現(xiàn)人血樣本的體外免疫血液檢測。ABO/Rh血型診斷試劑卡是基于獨特的柱凝集技術(shù)原理而設(shè)計的。該卡是在一種特制的塑料卡上設(shè)計有6個微柱，每個微柱中均裝有一定數(shù)量具有分子篩作用的玻璃珠，并分別預(yù)置了抗A、抗B、抗D特異性抗體的試劑。當(dāng)受檢者紅細(xì)胞進(jìn)入測試柱與相應(yīng)抗體反應(yīng)并經(jīng)低速和高速雙相離心后，發(fā)生凝集的紅細(xì)胞被阻滯在玻璃珠的上層（陽性），而未凝集的游離紅細(xì)胞則會在離心力的作用下通過玻璃珠介質(zhì)之間的間隙沉積于柱的底部（陰性）。由此可將凝集紅細(xì)胞與未凝集紅細(xì)胞分開，達(dá)到鑒定ABO/Rh血型的目的。現(xiàn)在是40頁\一共有52頁\編輯于星期三見習(xí)內(nèi)容與要點全自動血型分析系統(tǒng)了解該分析系統(tǒng)的整體結(jié)構(gòu)和工作性能掌握人血樣本體外免疫血液自動檢測的基本原理熟悉整個操作流程現(xiàn)在是41頁\一共有52頁\編輯于星期三本實驗以AutoVue＠全自動血型分析系統(tǒng)用于人紅細(xì)胞ABO/Rh血型的正定型為例進(jìn)行介紹整體結(jié)構(gòu)計算機打印機不間斷電源(可選)儲液桶試劑卡AutoVueInnova現(xiàn)在是42頁\一共有52頁\編輯于星期三樣本的識別與加樣紅細(xì)胞混懸與制備試劑的識別與分配孵育離心結(jié)果的閱讀與解釋試劑卡的保存與移動

AutoVueInnova的功能現(xiàn)在是43頁\一共有52頁\編輯于星期三AutoVueInnova的檢測菜單ABO/Rh定型ABO反定型Rh表型鑒定病人/獻(xiàn)血員主側(cè)與次側(cè)交叉配血抗體篩選抗體鑒定直接抗人球蛋白實驗酶實驗特殊血型抗原鑒定質(zhì)控實驗現(xiàn)在是44頁\一共有52頁\編輯于星期三柱凝集血型診斷系統(tǒng)試劑卡每張卡上有六個微柱微柱內(nèi)裝有一定數(shù)量、大小均一的玻璃珠和分別預(yù)置了含抗A、抗B、抗D特異性抗體受檢者紅細(xì)胞進(jìn)入測試柱與相應(yīng)抗體反應(yīng)經(jīng)低速和高速雙相離心，發(fā)生凝集的紅細(xì)胞被阻滯在玻璃珠的上層（陽性），而未凝集的游離紅細(xì)胞則會通過玻璃珠介質(zhì)之間的間隙沉積于柱的底部（陰性）,達(dá)到血型鑒定的目的。用于人紅細(xì)胞ABO/Rh血型正定型的原理現(xiàn)在是45頁\一共有52頁\編輯于星期三微柱凝膠試驗示意圖現(xiàn)在是46頁\一共有52頁\編輯于星期三

標(biāo)本采集和要求血液的采集

用真空采血針取肘靜脈血3ml放入含有干燥抗凝劑的抗凝管中，并做好標(biāo)識。

采集后的標(biāo)本可