分子生物學(xué)分子生物學(xué)研究法

（優(yōu)選）分子生物學(xué)分子生物學(xué)研究法現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四一.重組DNA技術(shù)概論現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四二.常見的DNA操作技術(shù)2.1瓊脂糖凝膠電泳2.2SDS電泳2.3PCR技術(shù)2.4測(cè)序技術(shù)2.5雜交技術(shù)2.6ELISA技術(shù)2.7細(xì)菌轉(zhuǎn)化2.8cDNA文庫(kù)2.9SNP技術(shù)及應(yīng)用2.10基因打靶現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四瓊脂糖凝膠電泳1、原理：2、用途：3、技術(shù)要點(diǎn)現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四瓊脂糖凝膠電泳的原理

1.DNA電泳遷移：電荷效應(yīng)＋分子篩效益（1）DNA帶負(fù)電，電場(chǎng)中，向正極移動(dòng)；（2）決定移動(dòng)速度三因素：DNA大小，電荷數(shù)，構(gòu)型；

(3)線性DNA分子移動(dòng)速度與其分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成反比；（分子量越大，跑得越慢）

2、檢測(cè)原理：（1）溴化乙錠（EB）可插入雙鏈DNA分子中，在紫外光照射下，發(fā)射熒光。現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四瓊脂糖凝膠電泳用途1.DNA分子量測(cè)定（距離－>分子量）2.基因，克隆的鑒定（通過(guò)1完成）3、不同長(zhǎng)度的基因片斷的分離4、DNA濃度的測(cè)定

（熒光的強(qiáng)度與DNA含量成正比）*也可用于蛋白的分離鑒定現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四加標(biāo)準(zhǔn)分子量DNAMarker,測(cè)定分子量加標(biāo)準(zhǔn)濃度的DNA，測(cè)定濃度現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)要點(diǎn)1.不同濃度凝膠分辨DNA片段能力不一樣(p33)(1)低:不利于小片段的分辨(擴(kuò)散)(2)高:不利于大片段的分辨(遷移不動(dòng))(3)一般選1.0%2.凝膠要用緩沖液配(TBE或TAE)3.EB強(qiáng)致癌，帶手套操作；4.agarose(瓊脂糖）－－－電泳

agar(含瓊脂糖和瓊脂膠）－－－平板培養(yǎng)基現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四SDS電泳1、原理2、用途3、技術(shù)要點(diǎn)現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四SDS電泳原理1.SDS(帶負(fù)電)和還原劑破壞蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu),同時(shí)SDS與蛋白定量結(jié)合,消除蛋白之間的電荷差異,使得蛋白的遷移率主要依賴分子量(分子小跑得快).2.不連續(xù)電泳:上層為濃縮膠,可將樣品壓縮到同一起跑線,下層為分離膠;可獲得更高的分辨率.3.考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色.現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四SDS電泳用途1.蛋白分子量的測(cè)定2.蛋白濃度的測(cè)定3.蛋白的鑒定(通過(guò)1來(lái)實(shí)現(xiàn))現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四SDS技術(shù)要點(diǎn)1.濃縮膠一般用5%,

分離膠:次高分子(10萬(wàn)-20萬(wàn))用7%,

低分子(1.4萬(wàn)－10萬(wàn)）用12％2、PAGE配制時(shí)帶手套，（Acr-Bis液體有積累性神經(jīng)毒，聚合后無(wú)毒)3.SDS－PAGE測(cè)定的是單體蛋白分子量；（多亞基不行）4、SDS－PAGE不適于：（1）電荷異常蛋白：組蛋白（＋電多）（2）構(gòu)象異常的蛋白（3）帶有較大輔基的蛋白－－糖蛋白，脂蛋白。現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四PCR技術(shù)1、原理2、應(yīng)用3、技術(shù)要點(diǎn)現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四PCR技術(shù)原理循環(huán)過(guò)程(32次左右）1.解鏈：94℃,30s2.引物結(jié)合:？

℃，30s3.延伸：72℃，？Min

特點(diǎn)1.引物兩條，以2n指數(shù)擴(kuò)增（前20-25次），后面擴(kuò)增效率降低，30次以后，基本進(jìn)入平臺(tái)期。2.引物結(jié)合溫度？

℃一般為50-55℃，需要調(diào)整；3.延伸時(shí)間？Min需要調(diào)整，一般1kb/min.現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四PCR技術(shù)應(yīng)用1.基因檢測(cè)；2.基因的制備（包括基因的修飾）現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四PCR技術(shù)操作要點(diǎn)1.靈敏度高，防止污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性(帶手套，設(shè)立陰性，陽(yáng)性對(duì)照）；2.需要摸索結(jié)合溫度，提高擴(kuò)增的特異性?，F(xiàn)在是18頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四雜交技術(shù)1.Southernblot檢測(cè)DNA2.Northernblot檢測(cè)RNA3.Westernblot檢測(cè)蛋白現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四Southernblot,Northernblot和Westernblot比較名稱檢測(cè)對(duì)象探針檢測(cè)原理處理過(guò)程用途SouthernblotDNA標(biāo)記單鏈核酸核酸復(fù)性中堿基配對(duì)專一性瓊脂糖電泳后轉(zhuǎn)膜基因檢測(cè)（拷貝數(shù)）NorthernblotRNA標(biāo)記單鏈核酸核酸復(fù)性中堿基配對(duì)專一性變性瓊脂糖電泳后轉(zhuǎn)膜基因表達(dá)的檢測(cè)（表達(dá)量）Westernblot蛋白抗體抗原－抗體特異性結(jié)合SDS后轉(zhuǎn)膜基因表達(dá)產(chǎn)物――蛋白的檢測(cè)ELISA原理和用途類似于Westernblot,但在酶標(biāo)板中操作，無(wú)需SDS轉(zhuǎn)膜，操作簡(jiǎn)單，可批量檢測(cè)，并可半定量測(cè)定?，F(xiàn)在是20頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四Southernblot現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四Northernblot現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四Westernblot現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四雙脫氧法測(cè)序

(Dudeoxysequenceanalyses)雙脫氧法又稱末端終止法，用于單鏈測(cè)序1.原理：

Atkinson發(fā)現(xiàn)用DNApol合成DNA時(shí)如在反應(yīng)物中加入一定量的2`,3`ddTTP時(shí)，因ddT

的3`碳原子不含－OH,故DNA不能延伸。1982年Sanger利用此原理建立了雙脫氧測(cè)序法。原理和加減法相似，但不再是加一種dNTP或減一種dNTP,而是加入某一種雙脫氧核苷，來(lái)終止聚合反應(yīng)。用此法測(cè)得G4含5577bp.現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四2.1細(xì)菌轉(zhuǎn)化通常情況下，外源基因無(wú)法進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)；當(dāng)用電擊法，或CaCl2，或RuCl等方法處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源基因進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞的活性較低，處理需溫柔。現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四2.2PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)PCR的基本原理變性、復(fù)性、半保留復(fù)制

PCR三步曲變性90～97℃退火45～55℃延伸72℃現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四PCR現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四2.3cDNA文庫(kù)cDNA:

(1)將mRNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA.

(2)特點(diǎn):

A.穩(wěn)定;

B.無(wú)內(nèi)含子.二.cDNA文庫(kù):

(1)

代表了生物體某一器官或者組織mRNA中所含的全部或絕大部分遺傳信息.(2)特點(diǎn):

A.不同的生物,同一生物不同組織,同一組織不同發(fā)育時(shí)間或不同生理狀態(tài)下,cDNA文庫(kù)不同;B.建好的cDNA文庫(kù)的具體的信息未知,僅提供吊取相關(guān)目的基因的材料.C.每個(gè)克隆不一定是全長(zhǎng)基因現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四cDNA文庫(kù)建庫(kù)過(guò)程1.高質(zhì)量mRNA的制備;2.反轉(zhuǎn)錄生成cDNA3.與載體分子連接(噬菌體文庫(kù))4.轉(zhuǎn)染(噬菌體的包裝)現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四說(shuō)明:引物oligodT,隨機(jī)引物R6(得到全長(zhǎng)cDNA)兩端可加上酶切接頭,便于克隆到載體上.合成時(shí),原料用甲基化的dCTP.防止酶切時(shí)損傷內(nèi)部序列.轉(zhuǎn)化效率要高,防止少量表達(dá)的mRNA未得到克隆.現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四2.4SNP技術(shù)及應(yīng)用Singlenucleotidepolymorphism單核苷酸多態(tài)性(標(biāo)記)是指同一物種不同個(gè)體間染色體上遺傳密碼單個(gè)堿基的變化，主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性。用途:(1)遺傳的分子標(biāo)記物種鑒定

(2)生物功能異常的基因標(biāo)記疾病的檢測(cè);現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四Singlenucleotidepolymorphism現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四SNP的特征SNP是人類可遺傳的變異中最常出現(xiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上，在人類基因組中廣泛存在，大約平均1000個(gè)堿基對(duì)就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)SNP，估計(jì)整個(gè)人類基因組30億堿基中至少有300萬(wàn)個(gè)SNP。

SNP大都表現(xiàn)為二等位基因（bialletic)多態(tài)性,即在該位置只存在兩種不同的堿基。SNP作為一種堿基的替換，大多數(shù)為轉(zhuǎn)換（C—T，G—A），也可能是顛換。轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，而且在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，多是發(fā)生C—T的轉(zhuǎn)換，原因是CG中的C是甲基化的，它能自發(fā)的脫氨基而替換為胸腺嘧啶。現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四SNP的檢測(cè)方法單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandconformationalpolymorphism,SSCP)

原理：?jiǎn)捂淒NA的折疊結(jié)構(gòu)是由單核苷酸序列決定的，當(dāng)某一個(gè)堿基發(fā)生突變時(shí)，便會(huì)直接影響該鏈的構(gòu)象，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)遷移率會(huì)發(fā)生改變?，F(xiàn)在是38頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)

原理:當(dāng)雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進(jìn)行到與DNA變性溫度一致的凝膠位置時(shí)，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降，DNA鏈中有一個(gè)堿基改變時(shí)，會(huì)在不同的時(shí)間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離?，F(xiàn)在是39頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四熒光共振能量傳遞

(fluorescentresonanceenergytransfer,FRET)供者受者

探針5‘3‘Taqman法分子信標(biāo)(molecularbeacon)法

現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質(zhì)譜分析法DNA芯片技術(shù)（DNAchip）

現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四SNP數(shù)據(jù)庫(kù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心http://德國(guó)的HGBAS網(wǎng)站

http://日本JST的數(shù)據(jù)庫(kù)

現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四2.5基因打靶(genetargeting)通過(guò)DNA定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究該基因的功能。(反向遺傳學(xué))基因敲除(geneknockout)：定向敲除基因敲入(geneknockin)：定向替代現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四基因打靶的必備條件胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性打靶載體Neo（新霉素）陽(yáng)性篩選標(biāo)志HSV-tk陰性篩選標(biāo)志：?jiǎn)渭儼捳畈《?herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四基因敲除的基本程序打靶載體的構(gòu)建打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：重組置換基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四基因敲除Knockout1.完全基因敲除可能會(huì)致死.2.條件型基因敲除Cre/LoxP,FLP/FRT現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四基因敲除的缺點(diǎn)能將基因與表型(生物功能)聯(lián)系起來(lái),但不能提供具體的作用機(jī)制;對(duì)多基因決定的表型無(wú)法將其聯(lián)系全部找出;操作復(fù)雜,成本高.現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四三.基因克隆技術(shù)(狹義)

獲取目的基因的技術(shù)1.RACE技術(shù)2.cDNA差示顯示法3.基因大規(guī)?？寺〖夹g(shù)4.酵母雙雜交法5.酵母單雜交系統(tǒng)6.基因的圖位克隆法現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四3.1RACE技術(shù)RapidamplificationofcDNAends已知基因一端序列,快速獲取另一端序列.5’RACE(獲取5’序列)3’RACE(獲取3’序列)需要合成引物接頭(單鏈DNA),用RNAligase將基因(RNA)與引物(DNA)連接.現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四5’RACE現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四3’RACE(非mRNA擴(kuò)增)合成兩條互補(bǔ)的引物,序列任意.及一條序列特異的引物互補(bǔ)引物中一條5’標(biāo)記Pi,通過(guò)RNAligase將其與RNA連接.現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四3.2cDNA差示顯示法(cDNA-RDA)僅知道生理功能,性狀,對(duì)基因序列一無(wú)所知.獲得該相關(guān)基因的方法.原理:A.樣本(sample)與對(duì)照(control)mRNAs被轉(zhuǎn)錄成cDNA,酶切加可PCR擴(kuò)增接頭,擴(kuò)增后除去接頭,只有樣本被加上新接頭(可PCR擴(kuò)增).B.樣本(ss)與過(guò)量對(duì)照(cc)雜交后,PCR擴(kuò)增.sc被線形擴(kuò)增;ss被指數(shù)擴(kuò)增;CC不被擴(kuò)增.現(xiàn)在是54頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四3.3基因大規(guī)?？寺〖夹g(shù)(Gateway克隆技術(shù))1.不需要酶切,連接;2.利用TOPO反應(yīng),將PCR產(chǎn)物克隆到Entry載體;再通過(guò)LR反應(yīng),將基因定點(diǎn),定向重組到表達(dá)載體.3.上游引物5’端需要引入CACC序列.現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四3.4酵母雙雜交法

（蛋白－蛋白相互作用）1.篩選與已知蛋白相互作用的蛋白基因2.真核生物的轉(zhuǎn)錄激活子基本結(jié)構(gòu)一般有2個(gè)功能域（functionaldomain）DNA結(jié)合域（DNA-bindingdomain）－－DBD轉(zhuǎn)錄激活域（transcription-activatingdomain）--AD(許多激活子還有二聚體化域,有的還有受體結(jié)合域)現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是61頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四“獵物”為一個(gè)庫(kù)；２．將不同的“誘餌”克隆后，捕獲不同的“獵物”現(xiàn)在是63頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四３.5酵母單雜交

（蛋白核酸相互作用）用于鑒定與特定順式作用元件（DNA序列）作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合域．或反之．現(xiàn)在是64頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是65頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四３.6基因的圖位克隆法

目的：克隆具有某種表型的未知基因的方法．原理：略現(xiàn)在是66頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四四.基因表達(dá)研究技術(shù)１.基因表達(dá)系列分析技術(shù)（SAGE)2.RNA選擇性剪切機(jī)制3.原位雜交技術(shù)４.定點(diǎn)突變技術(shù)５．RNAi技術(shù)現(xiàn)在是67頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四4.１.基因表達(dá)系列分析技術(shù)（SAGE)

以測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的定量分析全基因組表達(dá)模式的技術(shù)，能夠直接讀出任何一種類型細(xì)胞或組織的基因表達(dá)信息；理論依據(jù)：９－１０堿基的核酸片段可代表一種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特異序列（序列標(biāo)簽）某序列標(biāo)簽占總標(biāo)簽數(shù)的比例對(duì)應(yīng)編碼基因的表達(dá)頻率．現(xiàn)在是68頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是69頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四4.2.RNA選擇性剪切機(jī)制RT-PCR擴(kuò)增不同組織特異基因電泳分析片段大小是否一致．現(xiàn)在是70頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四４.3.原位雜交技術(shù)通過(guò)標(biāo)記的核酸探針,在組織,細(xì)胞,間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究的一種手段.(1)RNA原位雜交組織切片中,該基因的表達(dá)產(chǎn)物(mRNA)在細(xì)胞水平上作出定性定量分析.-{區(qū)別免疫組化(蛋白)}(2)染色體原位雜交eg.熒光原位雜交(FISH),確定DNA序列染色體上的位置.

現(xiàn)在是71頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是72頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四4.3定點(diǎn)突變1.研究某個(gè)氨基酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),功能的影響;2.改造DNA調(diào)控序列,修飾表達(dá)載體,引入新的酶切位點(diǎn).現(xiàn)在是73頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四TaKaRamutationkit現(xiàn)在是74頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四4.4RNAi技術(shù)RNAi是指dsRNA誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)同源基因表達(dá)阻斷的生物學(xué)現(xiàn)象。在線蟲、昆蟲、哺乳動(dòng)物、植物和真菌中廣泛存在。是轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）的重要機(jī)制。細(xì)胞利用RNAi抵御病毒和其它外源核酸的侵染，阻斷轉(zhuǎn)座子的作用。現(xiàn)在是75頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四雙鏈RNA先被切割酶Dicer切割成21－23個(gè)堿基對(duì)的siRNA中間體，觸發(fā)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）。在ATP的存在下，復(fù)合物中雙鏈RNA被螺旋酶解旋，形成單鏈RNA（ssRNA）的活化體。一旦單鏈RNA同目的mRNA配對(duì)，核酸酶被活化，在復(fù)合物內(nèi)部降解mRNA。現(xiàn)在是76頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四RNAi的應(yīng)用

基因功能的研究：RNAi作為一種反相遺傳工具，可通過(guò)抑制特定基因的表達(dá)來(lái)研究該基因功能?；蛑委煟嚎捎糜谝种茀⑴c病程的開始或發(fā)展的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，例如參與病毒或寄生蟲與宿主相互作用、病原體的復(fù)制、癌癥的發(fā)生及細(xì)胞毒性的蛋白質(zhì)。現(xiàn)在是77頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四RNAi的缺點(diǎn)

A.在哺乳動(dòng)物中，存在非特異性效應(yīng)的dsRNA觸發(fā)途徑,如（1）dsRNA依賴的蛋白激酶(PKR)和干擾素途徑，該途徑引起對(duì)蛋白合成和凋亡的全身性的抑制；(2)dsRNA誘導(dǎo)的2′–5′多聚腺苷酸的合成，該途徑導(dǎo)致非特異性的RNA酶即RnaseL的活化。但PKR不能被少于30個(gè)核苷的dsRNA活化，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)盡量避免。但非特異性RNAi效應(yīng)有時(shí)還是存在，而且不可預(yù)測(cè)。對(duì)有的高表達(dá)的基因，RNAi可能會(huì)無(wú)效或效果不明顯。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的RNAi效果比較短暫（約1周左右）。對(duì)一個(gè)基因設(shè)計(jì)的不同片段的RNAi可能效果差異很大，篩選的工作量繁重。有時(shí)細(xì)胞導(dǎo)入效率低下，也增加了技術(shù)實(shí)現(xiàn)的難度?，F(xiàn)在是78頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四4.5生物芯片技術(shù)

生物芯片是八十年代末在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù)，它主要是指通過(guò)微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固格體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)?，F(xiàn)在是79頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四主要特點(diǎn)

高通量、微型化和自動(dòng)化。芯片上集成的成千上萬(wàn)的密集排列的分子微陣列，能夠在短時(shí)間內(nèi)分析大量的生物分子，使人們快速準(zhǔn)確地獲取樣品中的生物信息，效率是傳統(tǒng)檢測(cè)手段的成百上千倍。但目前的成本較高，重復(fù)性較差?，F(xiàn)在是80頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四生物芯片分類

(1)用途

1.樣品制備芯片2.生化反應(yīng)芯片（如PCR芯片）3.檢測(cè)芯片（如基因芯片，蛋白芯片）4.芯片實(shí)驗(yàn)室（是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)。它將樣品的制備、生化反應(yīng)到檢測(cè)分析的整個(gè)過(guò)程集約化形成微型分析系統(tǒng)）?，F(xiàn)在是81頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四生物芯片分類

(2)制造技術(shù)微孔板/微陣列芯片DNA微點(diǎn)陣(陣列)芯片此類芯片的共同特點(diǎn)是,將多達(dá)成千上萬(wàn)種ＤＮＡ探針?lè)肿影凑找欢樞蚺帕性诠滔嗷?多數(shù)采用玻片)上組成密集的微點(diǎn)陣(Microarray)或陣列(Array),利用核酸雜交原理對(duì)靶核酸進(jìn)行檢測(cè)分析。蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣(陣列)芯片將大量純化的蛋白分子按一定的排列規(guī)律連接于玻片上,形成密集的微點(diǎn)陣(陣列),進(jìn)行高通量的生物活性檢測(cè)、蛋白質(zhì)靶標(biāo)分子(蛋白質(zhì)、抗體、ＤＮＡ、ＲＮＡ)相互作用研究。微流路芯片流過(guò)式芯片微流路(Microfluidic)芯片的共同特點(diǎn)是采用半導(dǎo)體微加工技術(shù)和(或)微電子工藝在芯片上構(gòu)建微流路系統(tǒng)(由儲(chǔ)液池、微反應(yīng)室、微通道、微電極、微電路中的一種或幾種組成),加載生物樣品和反應(yīng)液后,在壓力泵或電場(chǎng)的作用下形成微流路,于芯片上進(jìn)行一種或連續(xù)多種的反應(yīng),達(dá)到對(duì)樣品的高通量快速分析的目的。微電子芯片PCR芯片毛細(xì)管電泳芯片毛細(xì)管層析芯片多功能集成芯片蛋白質(zhì)分析微流路芯片現(xiàn)在是82頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四六.蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究技術(shù)1.雙向電泳2.質(zhì)譜技術(shù)3.蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)4.EMSA5.噬菌體展示技術(shù)6.免疫共沉淀技術(shù)7.蛋白質(zhì)磷酸化分析現(xiàn)在是83頁(yè)\一共有92頁(yè)\編輯于星期四6.1雙向電泳

雙向電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)中對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究的主要分離方法，同時(shí)能分離成百上千種蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在第一向根據(jù)電荷的不同（等電聚焦），第二