細(xì)胞工程技術(shù)的應(yīng)用

/細(xì)胞工程技術(shù)的應(yīng)用【摘要】本文先介紹細(xì)胞工程技術(shù)的定義和發(fā)展?fàn)顩r，然后再論述現(xiàn)代細(xì)胞工程技術(shù)的應(yīng)用，主要包括細(xì)胞工程在植物方面和動物方面的應(yīng)用，以及在能源、環(huán)境愛惜等領(lǐng)域的應(yīng)用，詳細(xì)列舉了細(xì)胞工程的技術(shù)應(yīng)用，最終展望細(xì)胞工程飛發(fā)張前景，預(yù)示了細(xì)胞工程講得到更加廣泛深化應(yīng)用的必定趨勢?！娟P(guān)鍵詞】細(xì)胞工程應(yīng)用【Abstract】Thispaperfirstintroducesthedefinitionofcellengineeringtechnologyandthedevelopingcondition,andthendiscussestheapplicationofthemoderncellengineeringtechnology,includingoftheapplicationoftheplantandanimal,aswellasinenergy,environmentalprotectionandotherareas.Detailedthelistsoftheapplicationofthecellengineeringtechnology.Cellengineeringsendsaprospectinthefuture,it’sforwardtofindingthatcellengineeringwillhaveawideranddeeperapplication.【Keywords】cellengineeringapplication細(xì)胞工程是一個特殊年輕且富有活力的學(xué)科，目前它和其他生物技術(shù)結(jié)合，為世界境界發(fā)展、醫(yī)療技術(shù)的研發(fā)等注入了強(qiáng)大活力，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會影響，信任隨著人們對生命科學(xué)相識的不斷深化，細(xì)胞工程技術(shù)會得到更快的發(fā)展，為人類的旺盛進(jìn)步作出更大的貢獻(xiàn)。一、細(xì)胞工程的定義細(xì)胞工程是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等方法，通過類似于工程學(xué)的步驟，在細(xì)胞后細(xì)胞器水平上依據(jù)人們的意愿來變更細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)，以獲得新的生物物種、品種或特種細(xì)胞產(chǎn)品的一門綜合性技術(shù)二、細(xì)胞工程的發(fā)展細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)是細(xì)胞學(xué)說和細(xì)胞全能性學(xué)說。1839年，Schwann和Schleiden建立了細(xì)胞學(xué)說，細(xì)胞學(xué)探討進(jìn)入快速發(fā)展階段。德國學(xué)者Haberlandt（1902年）在發(fā)表的《植物細(xì)胞立體培育試驗》的論文中提出了細(xì)胞全能性的觀點(diǎn)。Hänning（1904年）進(jìn)行了幼胚的立體培育，在含有糖、無機(jī)鹽、氨基酸和植物提取物的培育基上，培育蘿卜和辣根菜的幼胚，發(fā)覺離體幼胚均可充分發(fā)育，并且可以提前萌發(fā)成苗。1925年，Laibach培育亞麻種間雜交幼胚獲得成功，并得到雜交種。從20世紀(jì)20年頭起，幼胚培育被用來挽救遠(yuǎn)緣雜交早期敗育的胚胎，因此可以認(rèn)為，幼胚培育和胚胎挽救（embyrorescue）技術(shù)是最早應(yīng)用的植物細(xì)胞工程技術(shù)。在動物學(xué)界，1907年美國生物學(xué)家哈里森用蓋玻片懸滴培育蛙胚神經(jīng)組織，存活數(shù)周，而且視察到細(xì)胞生長現(xiàn)象，開創(chuàng)了動物細(xì)胞培育的先河。細(xì)胞工程技術(shù)發(fā)展快速，試管植物、試管動物、轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器等相繼問世。以色列用胚胎干細(xì)胞培育出人類心臟組織，可以正常跳動，以及美國培育的造血先驅(qū)細(xì)胞、中國培育的胃和腸粘膜組織等。1977年英國利用胚胎工程技術(shù)成功地培育出世界首例試管嬰兒，1997年英國首次克隆出綿羊“多莉”，2001年英國又培育出首批轉(zhuǎn)基因豬。隨著科學(xué)的發(fā)展和人們對生命科學(xué)的深化探究，細(xì)胞工程技術(shù)必將會在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境愛惜、資源利用等領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。三、細(xì)胞工程的應(yīng)用1．細(xì)胞工程在植物方面的應(yīng)用⑴微繁殖技術(shù)（Micropropagation）的應(yīng)用微繁殖技術(shù)，即以植物的器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體為外植體，在離體培育條件下進(jìn)行植株再生的技術(shù)。應(yīng)用微繁殖技術(shù)既可用于克服高度雜合物種因有性繁殖而引起的后代嚴(yán)峻分別，如澳大利亞的番木瓜；有可用于名優(yōu)或瀕危物種的快速繁殖，如鳳梨、草莓。通過微繁技術(shù)已獲再生植株的樹種主要有番木瓜、柑橘、龍眼、荔枝、蘋果、梨、葡萄等，草莓、香蕉等以實現(xiàn)了商品化生產(chǎn)。通過莖尖培育或微嫁接技術(shù)，可以脫去植物體內(nèi)的病毒，獲得無病毒苗木，如蘋果、草莓等。另外，在組織培育過程中，如愈傷組織培育、細(xì)胞懸浮培育、原生質(zhì)體培育等，通過pH值、溫度、離子濃度等條件的變更，可增加其變異，從中可篩選出優(yōu)良的突變體，從而為新品種的選育開拓一條嶄新的途徑。愈傷組織、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體等是基因轉(zhuǎn)化的良好受體材料，并且在離體培育條件下進(jìn)行植株再生也是實現(xiàn)植物遺傳轉(zhuǎn)化的重要環(huán)節(jié)。此外，微繁技術(shù)為種質(zhì)的保存（germplasmstorage）供應(yīng)了新方法。許多種質(zhì)資源在離體培育條件下，通過減緩生長和低溫處理而達(dá)到長期保存目的，并可進(jìn)行不同國家、地區(qū)間的種質(zhì)資源收集、互換、保存和應(yīng)用，即建立“基因銀行”（genebank），實現(xiàn)種質(zhì)資源的全球共享。例如，在比利時CatholicUniversity的Leuven探討中心有大量離體保存的香蕉種質(zhì)庫。⑵細(xì)胞大量培育和有用次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)細(xì)胞大量培育有用次生代謝產(chǎn)物是植物細(xì)胞工程另一個重要應(yīng)用領(lǐng)域。通過細(xì)胞工程技術(shù)，刺激植物體內(nèi)某些重要次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，然后進(jìn)行分別、提純，如某些珍貴藥物、香精、色素等，實現(xiàn)植物產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。早在1964年我國就起先進(jìn)行人參細(xì)胞培育。1980年以后，我國探討者相繼開展了紫草、三七、紅豆杉、青蒿、紅景天和水母雪蓮等植物的細(xì)胞大量培育和探討，并利用生物反應(yīng)器進(jìn)行藥用植物的細(xì)胞大量培育的小試和中試。其中新疆紫草中試的規(guī)模達(dá)到100L，并小批量生產(chǎn)了紫草素，用于研制化妝品及抗菌、抗病毒和抗腫瘤藥物。紅豆杉細(xì)胞大量培育在我國也獲得初步成功，從細(xì)胞培育物中得到了珍貴的抗癌藥物紫杉醇，但產(chǎn)率還有待提高。⑶單倍體（Haploid）技術(shù)的應(yīng)用單倍體育種和相關(guān)探討在農(nóng)業(yè)和園藝植物中得到了廣泛的應(yīng)用。用Blakeslee等（1922年）和Kostoff（1941年）分別得到了單倍體植株單倍體有利于突變的檢測和抗性細(xì)胞系的篩選，并且大大縮短了育種的時間。此外單倍體在基因圖譜、基因轉(zhuǎn)移探討中具有重要作用。自然形成的單倍體是極少見的，并且僅限于幾種植物?；ㄋ幣嘤菃伪扼w形成的重要途徑。自1964年第一例花藥培育獲得成功以來，花藥培育技術(shù)已取得了顯著的進(jìn)展，尤其在水稻、小麥、玉米等作物中已獲得巨大成功。現(xiàn)已取得成功的果樹樹種主要有番荔枝（Nair等，1983年）、番木瓜（Litz和Conover，1978年）、4個柑橘品種（Chen，1985年）、龍眼（Yang和Wei，1984年）、荔枝（Fu和Tang，1983年）、蘋果（Zhang等，1990年）、梨（Jordan，1975年）、葡萄（Rajasekaran和Mullins，1979年）等。薛光榮等（1980年）對東方草莓（四倍體）的單核期花粉進(jìn)行培育，成功的誘導(dǎo)出單倍體植株?；ㄋ幣嘤饕鞘芑蛐汀⒒ㄋ幍陌l(fā)育階段、預(yù)處理和培育條件的影響，其存在的主要問題是單倍體的誘導(dǎo)頻率低，單倍體自發(fā)加倍形成的二倍體和體細(xì)胞組織形成的二倍體很難區(qū)分。例如，F(xiàn)owler等（1971年）、Nishi等（1974年）和Rosati等（1975年）以八倍體草莓花藥為材料誘導(dǎo)愈傷組織，并分化出植株，發(fā)覺其再生植株仍為八倍體，這些八倍體是由無性器官發(fā)育而來，還是由單倍體自發(fā)加倍而成則難以區(qū)分。除花藥培育外，植物的卵細(xì)胞、助細(xì)胞、反足細(xì)胞等單倍體細(xì)胞通過離體培育可以分化成單倍體胚或愈傷組織。胚珠、子房培育也曾進(jìn)行了大量嘗試，但大多數(shù)狀況下，在愈傷組織階段生長停止。⑷胚培育（Embryoculture）胚的離體培育是干脆應(yīng)用于植物改良最早的組織培育技術(shù)。胚培育可以克服雜交后胚的衰亡，保證種內(nèi)或種間雜交的成功，或用于無性繁殖困難的植物的培育。胚培育還可以克服種子的休眠和敗育。Magdalita等（1996年）和Drew等（1997年）分別進(jìn)行了番木瓜的種內(nèi)雜交，得到合適的胚子后，進(jìn)行了胚培育，以促進(jìn)雜交成功。Jordan（1992年）得到了愈傷組織，但未得到再生植株。澳大利亞國際農(nóng)業(yè)技術(shù)探討中心對番木瓜和其野生種的雜交胚進(jìn)行了培育探討，已獲成功，并得到了雜交后代，野生種的抗性、高含糖量等優(yōu)良性狀得到了遺傳。荔枝是較難進(jìn)行離體培育的果樹樹種之一，Kantharajah等（1992年）培育了長度為3mm的荔枝幼胚。其他通過未成熟胚培育進(jìn)行再生的樹種有鱷梨、番荔枝和番木瓜等。姚強(qiáng)（1990年）對桃、油桃和番桃花后60d的未成熟胚進(jìn)行培育，獲得了再生植株。J.Button等（1975年）利用甜橙種胚愈傷組織離體培育獲得了完整植株。⑸原生質(zhì)體培育（Protoplastculture）和體細(xì)胞雜交（Somatichybridization）原生質(zhì)體是去掉細(xì)胞壁的單細(xì)胞，它是在離體培育條件下能夠再生完整植株的最小單位。每個原生質(zhì)體都含有該個體的全部遺傳信息，在適宜的培育條件下，具有再生成和其親本相像的個體的全能性。原生質(zhì)體培育的主要目的是通過原生質(zhì)體的融合，克服遠(yuǎn)緣雜交障礙，實現(xiàn)體細(xì)胞雜交，從而產(chǎn)生雜交后代。在原生質(zhì)體培育過程中，往往產(chǎn)生大量的變異，可從中選擇優(yōu)良突變體。原生質(zhì)體可以攝取外源細(xì)胞器、病毒、DNA等各種大分子遺傳物質(zhì)，是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的志向工具，此外，在同一時間內(nèi)獲得的大量原生質(zhì)體在遺傳上是同質(zhì)的，可為細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生理學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及其他一些生物學(xué)科建立良好的試驗體系。Lizz（1986年）曾分別得到番木瓜的原生質(zhì)體，Krikorian等（1988年）分別得到了香蕉的原生質(zhì)體，但二者均未得到持續(xù)分裂的細(xì)胞。Nyman等（1987年，1988年）首先報道了草莓栽培品種Sengana和Canaga試管苗葉肉原生質(zhì)體培育及植株再生。1992年，他們獲得了草莓試管苗幼葉和葉柄原生質(zhì)體的再生植株。Infante等以森林草莓用（Fragariavesca）Alpine養(yǎng)分系試管苗葉片和葉柄為材料分別原生質(zhì)體，并獲得了再生植株。愈傷組織和懸浮細(xì)胞是制備原生質(zhì)體的重要材料，但在落葉果樹上，只有少數(shù)樹種利用愈傷組織或懸浮細(xì)胞分別原生質(zhì)體并獲得培育的成功，其中最成功的樹種當(dāng)屬獼猴桃。蔡起貴等（1988年）通過愈傷組織分別出中華獼猴桃的原生質(zhì)體，并獲得了再生植株。Kovalenko等（1990年）和Ochatt等（1988年）分別在Colt櫻桃和歐洲葡萄上利用懸浮細(xì)胞系分別原生質(zhì)體并獲得再生植株。林定波等（1997年）以胚性愈傷組織為材料，分別得到錦橙的原生質(zhì)體，并獲得了再生植株。易干軍等（1997年）也以胚性愈傷組織為材料，分別得到柑橘（紅江橘）的原生質(zhì)體，并獲得再生植株。但以葉肉為材料分別得到的原生質(zhì)體未獲得成功。馬鋒旺等（1998年）對山杏的原生質(zhì)體進(jìn)行了分別和培育，在適宜條件下，山杏原生質(zhì)體4~5d變形，5~6d起先第一次分裂，20d左右可形成15~20個細(xì)胞的小細(xì)胞團(tuán)，60d后可形成肉眼可見的微愈傷組織。微愈傷組織經(jīng)繼代培育后，可誘導(dǎo)不定芽和不定根，形成完整植株。丁愛萍等（1994年）曾對蘋果進(jìn)行了原生質(zhì)體培育和植株再生探討，以胚性愈傷組織建立的懸浮細(xì)胞系為材料，分別得到原生質(zhì)體，并獲得了再生植株。植物細(xì)胞在去除細(xì)胞壁后，能像受精過程那樣相互融合，可實現(xiàn)常規(guī)雜交不親和的親本之間進(jìn)行遺傳物質(zhì)重組，從而開拓了體細(xì)胞雜交的新領(lǐng)域。體細(xì)胞雜交已廣泛用于植物育種，已在胞質(zhì)雄性不育、抗病等方面取得了顯著進(jìn)展。同時，在木本果樹植物上也得到了有經(jīng)濟(jì)價值的體細(xì)胞雜種植株。目前兩種最有效的融合系統(tǒng)PEG——高pH/Ca2+方法和電擊融合方法。第一例體細(xì)胞雜交是通過西紅柿和馬鈴薯的原生質(zhì)體融合實現(xiàn)的。原生質(zhì)體融合技術(shù)在柑橘種間雜交中得到大量應(yīng)用。Ohgawary將甜橙的原生質(zhì)體和飛龍的原生質(zhì)體融合，得到了體細(xì)胞雜種植株。美國學(xué)者Grosser將甜橙的懸浮培育細(xì)胞的原生質(zhì)體和豪殼刺屬的Severiniadisticha愈傷組織的原生質(zhì)體融合，得到了屬間異源四倍體的體細(xì)胞雜種植株。S.distcha具有抗病、耐寒、耐鹽等優(yōu)良性狀，適合作柑橘的砧木。⑹轉(zhuǎn)化（Transformation）分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，導(dǎo)致了植物科學(xué)的一場新革命。經(jīng)過多年的探究，人們從分子水平對生物學(xué)和遺傳學(xué)有了深刻的相識，和組織培育技術(shù)相結(jié)合，分子生物學(xué)技術(shù)已起先應(yīng)用于植物基因組的修飾和變更。由于基因編碼的同一性，任何有機(jī)體內(nèi)（如病毒、菌類、昆蟲）的有用基因都可以轉(zhuǎn)入到植物體。由于基因（如抗蟲或抗病基因）的導(dǎo)入，導(dǎo)致了新的基因型的出現(xiàn)或?qū)崿F(xiàn)基因型的改良，可選育出抗蟲或抗病的基因型。目前已經(jīng)分別或應(yīng)用的目的基因主要有抗植物病蟲害基因、抗非生物脅迫、改良作物產(chǎn)量品質(zhì)的基因、變更植物其他性狀的基因等。有關(guān)外源基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有多種，如農(nóng)桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)法（包括Ti質(zhì)粒的Ri質(zhì)粒）、植物病毒載體介導(dǎo)法、DNA干脆導(dǎo)入法（包括PEG介導(dǎo)、脂質(zhì)體介導(dǎo)等化學(xué)誘導(dǎo)DNA干脆轉(zhuǎn)化法，電激法、超聲波、顯微注射、激光微束、基因槍法等物理誘導(dǎo)DNA干脆轉(zhuǎn)化法等）和種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法（包括花粉管導(dǎo)入法，生殖細(xì)胞浸泡法，囊胚、子房注射法等）。目前最常用且最為有效的方法為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法。自1983年首次用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在煙草和馬鈴薯上取得成功以來，約有120種植物接受此方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對雙子葉植物特殊有效，但在單子葉植物中也已起先應(yīng)用?；驑尫瓤梢杂鷤M織作為受體，又可以懸浮細(xì)胞作為受體，并且對單雙子葉植物都特殊有效。2．細(xì)胞工程在動物方面的應(yīng)用⑴快速繁殖優(yōu)良、瀕危品種及新品種借腹懷胎提高種畜的利用率。20世紀(jì)30年頭胚胎移植在綿羊和山羊中取得成功；1982年美國學(xué)者獲得世界上第一胎試管牛。通過體外受精、細(xì)胞核移植技術(shù)、胚胎分割、胚胎融合等技術(shù)達(dá)到快速繁殖的目的，也有可能創(chuàng)建出高產(chǎn)奶牛、瘦肉型豬等新品種。通過胚胎工程、克隆技術(shù)等進(jìn)行大熊貓、東北虎等珍稀動物的繁殖。⑵利用動殖物細(xì)胞培育生產(chǎn)活性產(chǎn)物、藥品主要各種疫苗、抗體等。1975年英國劍橋高校利用動物細(xì)胞融合技術(shù)首次獲得單克隆抗體。已啟用300L和1000L的培育罐分別用于生產(chǎn)單克隆抗體和灰色脊髓炎等疫苗。20世紀(jì)90年頭國際上興起了一種用活細(xì)胞作為治療劑的“活細(xì)胞療法”，主要是在體外繁殖患者的自體細(xì)胞，使之?dāng)U增或具有療效物質(zhì)，然后再注入到體內(nèi)，該法對癌癥、白血病、糖尿病、燒傷、艾滋病等都有潛在的治療效果。⑶供醫(yī)學(xué)器官修復(fù)或移植的組織工程運(yùn)用細(xì)胞工程技術(shù)使人體殘余器官的少量正常細(xì)胞在體外繁殖，從而獲得患者所須要的、具有相同功能又不存在排斥反應(yīng)的器官，供器官移植只需。例如，一些骨骼、軟骨、血管和皮膚都正在試驗室培育，肝臟、胰臟、心臟、乳房、手指和耳朵等在試驗室生長成形。⑷轉(zhuǎn)基因動物的生物反應(yīng)器和傳統(tǒng)動物細(xì)胞培育相比，轉(zhuǎn)基因動物制藥技術(shù)具有很高的效益，一頭轉(zhuǎn)基因動物就是一座自然的基因藥物制造廠。1992年，上海醫(yī)學(xué)遺傳所培育攜帶人體蛋白基因的中國首例轉(zhuǎn)基因試管牛。2000年，我國培育出轉(zhuǎn)有人α抗胰蛋白酶基因的轉(zhuǎn)基因山羊，可從轉(zhuǎn)基因山羊奶中提取治療慢性肺氣腫、先天性肺纖維化囊腫等疾病的特效藥物。3．細(xì)胞工程在能源、環(huán)境愛惜等領(lǐng)域的應(yīng)用為了獲得能分解利用纖維素水解物，并高效產(chǎn)生乙醇的菌株，將利用纖維二糖實力強(qiáng)的Candidaabtusa和產(chǎn)乙醇率高的發(fā)酵接合糖酵母進(jìn)行融合，獲得的融合子不但以纖維二糖為唯一碳源，而且產(chǎn)乙醇實力高于雙親。綠孢鏈霉菌TTA和西康氏鏈霉菌75viz進(jìn)行融合，得到4株降解玉米桿纖維素實力比親株高出155%~264%。通過電融合法對釀酒酵母和季也蒙假絲酵母進(jìn)行融合，篩選出既能利用木糖又能利用纖維二糖生產(chǎn)乙醇的菌種，對纖維素再生資源的利用和削減環(huán)境污染具有重要意義。四、細(xì)胞工程的前景細(xì)胞工程已經(jīng)滲透到人類生活的許多領(lǐng)域，取得了許多具有開發(fā)性的探討成果，有的在生產(chǎn)中推廣，收到了明顯的經(jīng)濟(jì)和社會效益。隨細(xì)胞工程技術(shù)探討的不斷深化，它的前景和產(chǎn)生的影響將會日益地顯示出來。動物細(xì)胞培育工程發(fā)展的總方向是:大型化、自動化、精致化、低成本、高細(xì)胞密度、高目的產(chǎn)品產(chǎn)量。詳細(xì)地說,就是:(1)開發(fā)能高密度生長、能分泌大量目標(biāo)產(chǎn)品的細(xì)胞系。這些細(xì)胞系應(yīng)具有放大的目的基因或具有選擇性標(biāo)記,從而可以保持對特定產(chǎn)物的表達(dá)。(2)開發(fā)細(xì)胞生長性能優(yōu)良、解離細(xì)胞簡潔,并能重復(fù)運(yùn)用的新型