酶工程期末復(fù)習(xí)2015春

（RCF：差速離心細(xì)胞破碎的方法：兩相性質(zhì)(疏水性等)差別增大，蛋白質(zhì)分子的分配系數(shù)將偏離臨界點(diǎn)處的值(m=1)，即大于11。pH還影響系統(tǒng)緩沖物質(zhì)磷酸鹽的離解程度H2PO4-HPO42-之間的比例，影響相U2-U1，從而影響分系數(shù)。pH微小的變化，有時(shí)會(huì)使蛋白質(zhì)的分配系數(shù)發(fā)生巨大的改變（2~3個(gè)數(shù)量級(jí)3個(gè)對(duì)應(yīng)官能團(tuán)相結(jié)合：靜電作用、氫鍵、疏水相互作用、配、勻漿法。；包括：溫度差破碎法、壓力差破碎法、超聲波破碎法。0.02～0.5mol/L的鹽溶（P酶）和核酸酶類（R酶）pH2～6pH8～12細(xì)菌L—溶劑的選擇（遵循原則lg

KS (g/L)S00（即純?nèi)軇┲械娜芙舛?g/L)；離子半徑小，帶電多，電荷密度高，鹽析效果好(Ks大在一定的溫度和pH值條件下，S0為常數(shù)，上式可寫作lgSlgS0KSlgSKSβ：pH值有關(guān)。pH和溫度值一定時(shí)，β為常數(shù)。溫度影響的值：T，；T，pHpIpH溫度：①與水混合時(shí)，會(huì)放出大量的稀釋熱，使溶液T顯著升高，對(duì)不耐熱的pro影響較大（攪拌、少量多次加入，避免溫度驟然升高）②溫度還會(huì)影響對(duì)pro的沉淀能力，一般溫度越低，沉淀越完全，所以在乙醇沉淀人血漿蛋白時(shí)，溫度控制在-10C、、離心力（RCF：42(rpm)2

FFRCF

c1.1210n 6cm65000rpmRCFRCF

42(65000)2

常速離心機(jī)（低速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速：8000rpm，相對(duì)離心力(RCF1×104g；高速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速：10,000~25,000rpm1×104～1×105g；超速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速：25,000rpm，相對(duì)離心力：5×105g甚至更高。離心時(shí)間與液柱長(zhǎng)短有關(guān)（一般16～18小時(shí)轉(zhuǎn)速較高轉(zhuǎn)速較低凝膠層析介質(zhì)種類大分子透過而不發(fā)大；易受微生物侵蝕混合骨架(天然大分葡聚糖-聚丙烯酰胺pHpH將嚴(yán)重影響親和作用。在親和pH值的選擇非常重要。離液離子：SCN－，IClO4－等離液陰離子可減弱水分子之間相互作用，使分子缺點(diǎn)：①普遍性、通用性不夠；②費(fèi)用高pH一種聚合物分子的周圍將同種分子而排斥異種26.雙水相萃取的優(yōu)點(diǎn)：（70%~90%pH：pH影響蛋白質(zhì)中可解離基團(tuán)的離解度，從而改變蛋白質(zhì)所帶電荷和分配系PEG的上相得到回收，同時(shí)，含有目標(biāo)產(chǎn)物的鹽相通過超濾等操作得到分離目PEG★PEGpHpHpH>pI時(shí)，蛋白質(zhì)不能溶入反膠團(tuán)內(nèi)，但在等電點(diǎn)附近，急速變?yōu)榭扇?；pH<pIpH范圍內(nèi)，它們幾乎完全溶入膠團(tuán)內(nèi)。pHpI，萃取率也會(huì)降低（即立添加KCl等無機(jī)鹽，萃取率一般會(huì)下降（離子強(qiáng)度增加、靜電作用等，導(dǎo)致靜核酸鏈剪切修飾酶分子修飾的條件：pH值與離子強(qiáng)度、修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間、反應(yīng)體系中酶與修飾劑（PEG；含（PEG（DNFB（DNS（TNBS（TNM（NBS（HNBB酶分子修飾的常用方法：絲、半胱、、賴、組氨酸等；親電性側(cè)鏈基團(tuán)：芳香環(huán)、吲哚環(huán)；親電性取代的氨基1①pH-NH2-NH2-NH2pKa10①羧基在酶蛋白中主要是氨酸和谷氨酸的側(cè)鏈—COOH，以及肽鏈的末端羧-①③N-C-①PEGFDA—OH————⑤酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)：絕大多數(shù)酶經(jīng)修飾后最大反應(yīng)速度Vmax沒有變化；有些酶在修飾后，常數(shù)Km通常會(huì)增大（AwpH印記pH環(huán)境與酶在凍干或吸附到載體上之前所使用的緩沖液pH相同的現(xiàn)象，或稱pH。分配系數(shù)的對(duì)數(shù)(lgP)與酶間具有最好的相關(guān)性：lgP越大，溶劑的疏水性越強(qiáng)；lgPpH、醇的消旋化和?；D(zhuǎn)移。，通過表面活性劑的極性端朝外與水結(jié)合，非極性端朝內(nèi)包在液滴內(nèi)部，形成一個(gè)，Aw而改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)，當(dāng)體系達(dá)到平衡態(tài)時(shí)，體Aw值相等。）大，溶劑的疏水性越強(qiáng)；lgP越小，溶劑的親水性越強(qiáng)），DNA重排技術(shù)（DNA改組技術(shù)從兩種以上的同源正突變出發(fā)，用酶切成隨機(jī)片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起突變的技術(shù)易錯(cuò)PCR技術(shù)：是從酶的單一出發(fā)，在改變反應(yīng)條件下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，使擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)DNADNA擴(kuò)增的一種分子生物學(xué)技PCR技術(shù)。PCRDNA的堿基序列發(fā)生重新排布而引起基DNADNA的重組方法：現(xiàn)物工程對(duì)酶的要求PCR①M(fèi)n2+③酶構(gòu)建突構(gòu)建突 文PCRPCRDNA重組裝原理：①DNaseI③隨機(jī)片段復(fù)性；重復(fù)2-4步，獲得全長(zhǎng)DNADNA②在獲得全長(zhǎng)之前要除去DNaseIDNA改組相比，隨機(jī)引物體外重組技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)以單鏈DNAmRNAcDNA隨機(jī)片段不是由親本切割獲得，大大降低親本DNA的量省去DnaseI隨機(jī)合成的DNA片段大小不受DNA模板長(zhǎng)度的限制DNA重排與重排的比較DNA源序列進(jìn)行DNA的多樣化于易錯(cuò)PCR等反應(yīng)中產(chǎn)的進(jìn)化,并且之間存在比較顯著的差DNA雙鏈DNA免除了將外緣DNADNADNAT4DNA1516.枯草桿