銀杏葉中有效成分的提取工藝進(jìn)展

銀杏葉中有效成分的提取工藝進(jìn)展1引言銀杏葉作為世界上公認(rèn)的具有極高藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物葉，已有幾百年的歷史。研究表明銀杏葉具有活血化瘀，通絡(luò)止痛，斂肺平喘，化濁降脂的功效，其藥理作用十分的廣泛，可用作對心腦血管及中樞神經(jīng)的保護(hù)作用和抗腫瘤的作用等。因此人們對銀杏葉的研究也越來越重視。據(jù)了解銀杏葉中有效成分主要是黃酮類化合物和萜類內(nèi)酯[1]。近年來，許多國家對銀杏葉有效成分的分離提取進(jìn)行了大量的研究，其提取工藝有了很大進(jìn)展。目前銀杏葉中黃酮類化合物提取工藝主要有有機(jī)溶劑法、水浸取法、超臨界CO2萃取法等。萜類內(nèi)酯的提取工藝主要有溶劑浸取法、柱提取法、溶劑萃取—柱提取法等[2]。除此以外，一些新技術(shù)如超聲提取技術(shù)、酶工程技術(shù)和微波技術(shù)等也將不斷發(fā)展投入使用。1.1銀杏葉簡介銀杏葉為銀杏的干燥葉，多為皺狀，上緣呈不規(guī)則的波狀彎曲，有的中間凹入，完整的銀杏葉為扇形，一般為淺棕黃色具二叉狀平行葉脈。銀杏葉一般在秋季葉尚綠之時(shí)采收，然后干燥制得。其性甘苦、氣微、味微苦，歸肺、心經(jīng)，有益心斂肺、化濕止咳、活血化瘀、通絡(luò)止痛等功效[3]。銀杏葉作為藥材使用已有幾百年的歷史，在很多國家都廣泛使用。主要用于治療心腦血管疾病和老年外周循環(huán)障礙等疾病。近年來還發(fā)現(xiàn)其對腫瘤的治療有效果。我國作為銀杏的故鄉(xiāng)，擁有世界上一半以上的銀杏資源。因此我國在對銀杏葉的研究上擁有先天的資源[4]。1.2銀杏葉中的有效成分根據(jù)一直以來人們對銀杏葉的研究表明，銀杏葉中含有黃酮類化合物、萜類內(nèi)酯、生物堿、氨基酸、維生素和微量元素等物質(zhì)[5]。其中最重要的成分是黃酮類化合物和萜類內(nèi)酯。這兩種物質(zhì)是銀杏葉具有藥用價(jià)值最重要的原因。黃酮類化合物能有效地清除體內(nèi)有毒過氧自由基，起抗炎抗組胺的作用，還是治療心腦血管疾病的有效成分；而銀杏內(nèi)酯具有高度的抗血小板活化因子(PFA)的作用，能夠有效地?cái)U(kuò)張血管增加心腦血液流量，同時(shí)也具有消炎鎮(zhèn)痛、抗衰老、抗腫瘤和降血脂等功效。1.2.1黃酮類化合物黃酮類化合物在銀杏葉中所占的比率較高，約為2.5~5.9%。到目前為止，從銀杏葉中提取的黃酮類化合物約有40種。根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同，我們可以將它分為四大類：單黃酮、雙黃酮、黃酮苷和兒茶素類[2]。其中單黃酮作為銀杏制劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)之一，主要用于治療心腦血管疾病；雙黃酮據(jù)研究表明具有抗炎抗組胺等作用；兒茶素類黃酮則具有治療肝中毒和抗腫瘤的作用。黃酮類化合物的一般提取方法有水浸取法、溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法和樹脂吸附法等。1.2.2萜類內(nèi)酯銀杏葉中有效內(nèi)酯主要是銀杏內(nèi)酯A、B、C、J和白果內(nèi)酯[2]。銀杏內(nèi)酯屬于二萜類內(nèi)酯；而白果內(nèi)酯屬于倍半萜類內(nèi)酯，易溶于水，因此這導(dǎo)致了不同生產(chǎn)工藝產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。白果內(nèi)酯是目前銀杏葉中研究最多的一種，因?yàn)樗哂写龠M(jìn)神經(jīng)生長的作用，以及防止腦、脊髓神經(jīng)脫髓鞘作用，近年來科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯對防止老年性癡呆的發(fā)生有著不錯(cuò)的效果。研究表明銀杏葉中萜類內(nèi)酯具有抗血小板活化因子活性、抗炎抗過敏等作用。目前銀杏葉內(nèi)酯提取工藝有溶劑浸取法、柱提取法和兩種方法的結(jié)合處理等。1.3銀杏葉中有效成分的研究現(xiàn)狀銀杏葉作為重要的醫(yī)療保健的原材料，其有效成分的研究一直以來都倍受人們的關(guān)注。人們對銀杏葉的研究已有上百年的歷史，而銀杏葉中有效成分的藥理作用是從上世紀(jì)60年代開始被人們所了解。我國作為銀杏的發(fā)源地，擁有先天的銀杏資源，并且我國的銀杏品種優(yōu)良，銀杏葉中有效成分的含量高，具有很高的利用價(jià)值。但是我國對銀杏葉的開發(fā)起步較晚，于上個(gè)世紀(jì)60年代末才開展對銀杏葉的研究，80年代我國首批以銀杏葉黃酮為主要成分的制劑“天保寧”問世，至此拉開了我國對銀杏葉有效成分研究的序幕[6]。目前世界上對銀杏葉中有效成分在心腦血管系統(tǒng)、腦及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤方面的藥理作用機(jī)制有著重要的研究。2銀杏葉中有效成分的提取工藝研究由于銀杏葉中的有效成分具有極高的藥用保健價(jià)值，國內(nèi)外科學(xué)家都在不斷地探索優(yōu)化其提取工藝。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，德國最開始于上世紀(jì)60年代采用溶劑法提取黃酮類化合物和萜類內(nèi)酯，并且將其加工為生物制劑。隨后逐漸在歐洲、美國、中國等市場建立起加工廠。溶劑法作為一直以來應(yīng)用最為廣泛的方法，在提取銀杏葉中有效成分最開始的年代，有著重要的影響，以至到目前為止都是主流的方法。以下分別列舉了黃酮類化合物和萜類內(nèi)酯的提取工藝。2.1黃酮類化合物提取工藝人們對黃酮類化合物的研究始于上世紀(jì)30年代，日本學(xué)者古川周二首先從銀杏葉中提取到銀杏雙黃酮的混合物，隨后Baker等人應(yīng)用逆流分配色譜法從黃酮混合物中分離出銀杏黃酮、異銀杏黃酮和白果黃酮。直到1966年聯(lián)邦德國科學(xué)家從銀杏葉中提取出具有降低膽固醇和通血脈作用的黃酮類化合物后，其藥理作用才逐漸被人們發(fā)現(xiàn)。從此人們對銀杏葉中黃酮的提取工藝進(jìn)行了大量的研究，總結(jié)如下：2.1.1水浸取法水浸取法[7]的提取工藝為：將干凈的銀杏葉烘干粉碎，放入pH為8的水中浸泡，在固：液為1：40，浸出溫度為90攝氏度時(shí)，浸取4次，每隔3小時(shí)浸取一次。此種工藝幾乎能將銀杏葉中所有黃酮浸取出來。其優(yōu)點(diǎn)是用水作為浸取劑來源廣泛、無污染、成本低。但缺點(diǎn)是浸取液所含雜質(zhì)較多，如無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)等。2.1.2有機(jī)溶劑浸取法有機(jī)溶劑浸取法是一直以來應(yīng)用最為廣泛的一種方法。其中一種提取工藝[8]為：用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑浸泡銀杏葉，然后通過濃縮水析，離心過濾得到浸膏，再通過萃取等方法提取出黃酮。以乙醇為例，一種用55%左右的乙醇浸泡銀杏葉，固液比為1：8，在65攝氏度左右下浸取兩次，每次3個(gè)小時(shí)然后采用A-1和A-2混合樹脂即可提取出黃酮，含量大約為30%。還有一種方法是取粉碎好的銀杏葉，加入一定量的75%乙醇，浸泡過夜，再放入55攝氏度左右的水浴鍋中加熱并不斷攪拌，大約5個(gè)小時(shí)后趁熱過濾，收集濾液。再將濾渣重復(fù)上述操作取兩次濾液，置于分液漏斗中石油醚萃取1~2次每次石油醚用量約為濾液體積的4%，直至水層不含葉綠素；隨后將分液漏斗中分出的水相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)，同時(shí)回收乙醇，當(dāng)蒸至少量液體時(shí)轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，經(jīng)干燥后得到棕紅色粘稠物，這便是主要成分為黃酮類化合物的銀杏葉提取物，其產(chǎn)率大約為17%。馮曉萍等敘述了以丙酮為溶劑的提取工藝，取銀杏葉加入40%~60%的丙酮在60攝氏度左右下浸泡，取浸提液濃縮、過濾，再加1~3倍的水，進(jìn)行水析、離心、過濾，再用CCl4等非極性溶劑等體積萃取3次，調(diào)節(jié)pH8~9，沉降、離心、過濾，再調(diào)節(jié)pH至3~4，取清液加硫酸銨，用C4~C9酮和酯反復(fù)萃取，最后取有機(jī)相濃縮干燥，得到產(chǎn)品。有機(jī)溶劑法是國內(nèi)外使用最廣泛，提取物質(zhì)量高的一種方法，但由于生產(chǎn)成本高，不安全等因素也使得這種方法受到一定限制。2.1.3超臨界流體萃取法近年來，隨著超臨界流體提取技術(shù)的發(fā)展，超臨界流體萃取法在天然產(chǎn)物活性成分提取中的應(yīng)用越來越廣泛，使用該技術(shù)來提取銀杏葉中黃酮化合物也不斷投入使用。劉志敏等首先用超臨界CO2萃取法提取出銀杏葉中的黃酮苷。超臨界CO2萃取工藝[4]是利用超臨界狀態(tài)下的CO2和銀杏葉在不同的蒸汽壓力下所具有不同的親和力和溶解力進(jìn)行分離的操作。這種工藝與傳統(tǒng)的溶劑萃取法相比有很多優(yōu)點(diǎn)：提取效率高，無殘留，無毒性等。此種方法提取黃酮含量高于35%，提取率達(dá)85%。超臨界流體法將成為今后提取銀杏葉中有效成分的重要工藝。2.1.4樹脂吸附法樹脂吸附法[9]的提取工藝為先將銀杏葉加入一定量的70%乙醇溶劑中浸泡加熱回流，加熱過程中要不停攪拌，并且控制溫度在70攝氏度，浸取兩次，每次兩個(gè)小時(shí)，此時(shí)的浸提效果最佳。然后過濾得到提取液，加水?dāng)嚢杈鶆?，離心，取離心液濾過D101或724樹脂洗脫，再用70%的乙醇洗脫洗脫液通過聚酰胺柱，收集洗脫液加入亞硫酸氫鈉作為保護(hù)劑后真空濃縮干燥即可得到銀杏的提取物。此種工藝能使提取的總黃酮苷含量大于24%，銀杏萜類內(nèi)酯含量大于6%，具有成本低、提取率高、有機(jī)殘留少等優(yōu)點(diǎn)。以上幾種工藝都是目前常用的提取銀杏葉中黃酮類化合物的方法。但無論是哪種方法，都有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)，我們需要通過一定的條件優(yōu)化使得這些工藝效果越來越好，使黃酮的提取率與質(zhì)量越來越高。2.1.5其他方法郭國瑞[10]等人利用超聲波技術(shù)，在以水為介質(zhì)的低溫條件下，對銀杏葉進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用超聲提取比正常的水提快3倍，達(dá)到高效省時(shí)的目的。因此超聲波提取法將廣泛地應(yīng)用到生產(chǎn)中。李嶸[11]等對用微波提取銀杏葉中黃酮苷進(jìn)行了一系列的研究，同樣在以水為介質(zhì)的條件下，對銀杏葉進(jìn)行微波處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用微波處理后可以大大提高銀杏葉中黃酮的提取率，并且大大縮短了萃取所需時(shí)間，達(dá)到高效省時(shí)的目的。該工藝將傳統(tǒng)的水提法和微波法高效地結(jié)合在一起，不僅降低了生產(chǎn)成本，而且提高了生產(chǎn)效率，將是一種廣泛應(yīng)用于提取銀杏葉中黃酮化合物的好方法。高速逆流色譜技術(shù)[12]作為一種新技術(shù)，也逐漸引起人們的注意。這是一種無需固定載體的液液分配色譜技術(shù)，具有獨(dú)特的分離方式，使其對黃酮類化合物的分離制備有明顯的優(yōu)勢。以其高效率、高純度、無吸附等優(yōu)點(diǎn)必將成為提取黃酮的最佳工藝。日本專利還提出了用酶來提取銀杏葉中有效成分的方法。其原理是通過將銀杏葉中油溶性或不溶于水的有效成分轉(zhuǎn)移到葡糖苷酶或轉(zhuǎn)糖苷酶中[4]。由于難溶于水的有效成分在體內(nèi)不易吸收，而轉(zhuǎn)變?yōu)樘擒蘸蟊憧梢子谌梭w吸收。并且此方法的提取率極高，也有著不錯(cuò)的前景。為了提高銀杏葉中黃酮的提取率，我們還對一些提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。例如采用正交試驗(yàn)法來對銀杏葉中有效成分的提取進(jìn)行優(yōu)化[9]。該試驗(yàn)選擇乙醇濃度、用量、提取時(shí)間和溫度為主要因素，以銀杏葉總黃酮醇苷提取率為指標(biāo)對提取工藝進(jìn)行了考察。通過試驗(yàn)表明：改工藝為用70%的乙醇在90攝氏度下加熱回流提取3次（第一次8倍量，第二三次為6倍量），每次一個(gè)小時(shí)，再用已處理好的DM-2大孔吸附樹脂，依次用純水、乙醇洗脫，收集洗脫液濃縮至膏狀，再真空干燥即得。此種工藝操作簡單、重復(fù)性好，乙醇還可循環(huán)利用，因此可以大規(guī)模生產(chǎn)。2.2銀杏葉中萜類內(nèi)酯的提取工藝2.2.1溶劑浸取法王成章的溶劑浸取工藝[8]為：先用25%的乙醇浸泡銀杏葉，然后濃縮蒸發(fā)掉乙醇，取濃縮液加入石油醚脫脂，取水層加碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH8~9，離心沉降，再用鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，加入醋酸乙酯進(jìn)行萃取，將萃取液用硫酸鈉干燥，濃縮掉醋酸乙酯即得產(chǎn)品。改工藝獲得銀杏總內(nèi)酯含量約為40%。游松的提取方法為用95%的乙醇浸提，然后濃縮干燥，溶于水，再取水溶液用氯仿萃取，濃縮水層萃取物后得到產(chǎn)品。而李典鵬[11]等則是用5%的甲醇水溶液在150攝氏度油浴中煮沸銀杏葉提取物，大約15分鐘后過濾得濾液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3~4，再用醋酸乙酯萃取，最后取萃取液水洗至中性，減壓干燥后得到產(chǎn)物。浸取溶劑體系的選擇是影響萜內(nèi)酯含量的重要原因，浸取液應(yīng)使萜內(nèi)酯有很大的溶解度。張立國等人研究了萜內(nèi)酯在不同溶劑不同溫度下的溶解性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：萜內(nèi)酯在70攝氏度，溶劑強(qiáng)度為8.5處溶解度最大。2.2.2柱提取法柱提取法[12]用氧化鋁填充柱處理銀杏葉的浸取液，然后用無水乙醇洗脫，再將洗脫液濃縮得到產(chǎn)品。這種方法可將銀杏總內(nèi)酯的含量提高到95%，提取率為4%左右。這是目前單純采用柱提取而在后續(xù)步驟中不采用溶劑萃取的唯一方法。據(jù)了解目前都是采用溶劑萃取和柱提取法聯(lián)合處理的方法，這種方法適合各種內(nèi)酯的提取，且優(yōu)化了它們各自的工藝，提取的內(nèi)酯含量也較高。是一種很好的提取內(nèi)酯的方法。3銀杏葉中有效成分的提取工藝進(jìn)展銀杏葉作為一直以來人們重點(diǎn)研究的天然藥物，其提取工藝也在不斷地得到改革優(yōu)化。單從目前的研究狀況來看，提取銀杏葉中有效成分的方法還是溶劑法占主流地位。隨著科學(xué)技術(shù)水平的提高，科學(xué)家們不斷研究出更多可以提取銀杏葉中有效成分的工藝，如微波萃取法、超聲波提取法、回流提取法和酶提取法等。這些方法都可以應(yīng)用于銀杏葉中黃酮類化合物的提取，但是還沒有用于銀杏內(nèi)酯的提取。隨著這些新技術(shù)的研究與發(fā)展，將不斷地投入到各個(gè)方面使用。除此以外，人們還研究出了各種優(yōu)化工藝，對提取時(shí)間、溫度、提取次數(shù)和提取液濃度等方面展開研究，為銀杏葉中有效成分的提取提供更加便捷的方法。4總結(jié)近年來，銀杏葉中有效成分的提取工藝在不斷地發(fā)展。就目前而言，我國在這方面的提取工藝還不夠完全成熟，因?yàn)槲覈谶@方面的起步較晚。但這并不影響我們對銀杏葉的開發(fā)與發(fā)展。目前最主要的提取工藝還是溶劑法，但其他新技術(shù)如超臨界流體法、微波法、超聲波法、高速逆流色譜法等技術(shù)的發(fā)展，必將將打破這一現(xiàn)狀，并且向著規(guī)模化、綠色化的方向發(fā)展。只要我們抓住機(jī)遇，努力研究創(chuàng)造，必將在今后的發(fā)展創(chuàng)造中取得更好的成績。

致謝本論文是在我的導(dǎo)師沈老師的精心指導(dǎo)和悉心關(guān)懷下完成的，在我的學(xué)業(yè)和論文中無不傾注著導(dǎo)師辛勤的汗水和心血。導(dǎo)師的嚴(yán)謹(jǐn)治學(xué)態(tài)度、淵博的知識、無私的奉獻(xiàn)精神使我深受的啟迪。從尊敬的導(dǎo)師身上，我不僅學(xué)到了扎實(shí)、寬廣的專業(yè)知識，也學(xué)會了很多做人的道理。在此我要向我的導(dǎo)師致以最衷心的感謝和深深的敬意。在我的論文撰寫過程中，韓智業(yè)、胡倩、張文文等同學(xué)提出了寶貴意見和建議，在此向他們表示深深的感謝。我還要感謝三年來一直陪伴我的同窗舍友們和給予我學(xué)習(xí)幫助的同學(xué)，有了他們，我的大學(xué)生活才會如此的充實(shí)，謝謝！在本次畢業(yè)設(shè)計(jì)完成之際，我由衷地感謝學(xué)校老師們對我的關(guān)心和幫助，感謝沈老師對我提出的寶貴意見和建議，衷心祝愿老師們工作順利，萬事如意，祝我親愛的同學(xué)們以后的路會越走越好，祝愿連云港師范高等?？茖W(xué)校在以后取得更大的成績，創(chuàng)造更加輝煌的未來。高爽二〇一七年六月于連云港參考文獻(xiàn)[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[