MTT試驗(yàn)跟蹤總結(jié)

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MTT試驗(yàn)第一階段細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞傳代與凍存…（此處略，蘋果你已會?。?/p>

MTT試驗(yàn)其次階段（自己總結(jié)）

細(xì)胞種板：往96孔板中接種適合數(shù)量的細(xì)胞，并保證細(xì)胞在96孔板小孔中均勻分布，正常生長，是MTT試驗(yàn)成功的首要條件。

主要步驟：

（1）.細(xì)胞生長：保證細(xì)胞處于對數(shù)生長期，簡而言之就是將已基本鋪滿培養(yǎng)瓶底的細(xì)胞進(jìn)行消化，但不傳代，就是將舊的培養(yǎng)基換掉，讓貼壁的細(xì)胞懸浮，并培養(yǎng)一天。此時(shí)細(xì)胞處于對數(shù)生長期，細(xì)胞活力最好，有利于MTT試驗(yàn)的結(jié)果。

（2）.細(xì)胞消化：將昨天的細(xì)胞吸去舊的培養(yǎng)基（將死細(xì)胞吸走，可用過濾滅菌的PBS溶液輕輕沖洗細(xì)胞），參與胰酶消化，隨后參與適合培養(yǎng)基（不宜過多，勿將細(xì)胞稀釋的過稀，達(dá)不到種板所需的細(xì)胞濃度要求）。切記利用吹打管將細(xì)胞吹打均勻（大量細(xì)胞會聚集在一起，細(xì)胞分散不均，吹打不勻會影響細(xì)胞計(jì)數(shù)的確鑿性及隨后種板的均一性）；但吹打過猛過多也會影響細(xì)胞活力。

（3）.細(xì)胞計(jì)數(shù)：計(jì)數(shù)之前，應(yīng)用75%酒精將計(jì)數(shù)器其載玻片擦拭清白，以免上面殘留雜質(zhì)影響細(xì)胞計(jì)數(shù)。取一小滴（估計(jì)20ul左右）吹打均勻的細(xì)胞培養(yǎng)液沿細(xì)胞計(jì)數(shù)器上端凹槽輕輕緩慢打出滴下，此時(shí)小液滴會自動（虹吸原理）鋪滿細(xì)胞計(jì)算器的上部小方塊（如圖1）；將細(xì)胞計(jì)算器放置于顯微鏡下觀測計(jì)數(shù)，找到左上、左下、右上、右下各4塊16格的區(qū)域（如圖2），數(shù)下各塊區(qū)域的細(xì)胞數(shù)目，并記錄數(shù)據(jù)（計(jì)數(shù)原則：當(dāng)有細(xì)胞壓16特別線時(shí)，記上不記錄下來，記左不記右）。得到細(xì)胞濃度。

計(jì)算公式為：細(xì)胞濃度=[（A1+A2+A3+A4）/4]*104/ml

（4）.細(xì)胞稀釋：就是將細(xì)胞稀釋到接種于96孔板時(shí)細(xì)胞接種數(shù)目濃度。每孔參與200ul，細(xì)胞數(shù)目（5000左右，個(gè)人認(rèn)為）。在稀釋細(xì)胞是既要考慮接種濃度，也要考慮接種總共所需的細(xì)胞培養(yǎng)液體積（避免細(xì)胞濃度適合，但體積不夠接種于所需加樣的小孔）

（5）.細(xì)胞加樣：每次加樣前需要將細(xì)胞培養(yǎng)液振蕩，加幾孔最好吹打一下細(xì)胞培養(yǎng)液（防止有的細(xì)胞沉降），目的是將細(xì)胞混合均勻，保證種板的均一性。根據(jù)自己設(shè)計(jì)的96孔板加樣方式，一般一種藥物的濃度可配6個(gè)濃度，每個(gè)濃度加5個(gè)重復(fù)孔，另外需設(shè)有對照組，空白組（一般狀況下96孔板外圍的36孔不種細(xì)胞，參與一致體積的PBS溶液，從而減少內(nèi)部的60孔中細(xì)胞培養(yǎng)液的揮發(fā)，稱之為邊緣效應(yīng)）（如圖3）。

（6）.96孔板觀測：當(dāng)將細(xì)胞順利接種到對應(yīng)小孔中后，將96孔板放置于顯微鏡下觀測

各孔中細(xì)胞狀態(tài)及分布是否均勻等（保證為正常存活的細(xì)胞，在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上符合MTT要求，保證MTT結(jié)果的可靠性，也在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上論證MTT細(xì)胞試驗(yàn)的結(jié)果）。（7）.細(xì)胞再培養(yǎng)：將96孔板重新放回孵溫箱中培養(yǎng)（設(shè)定培養(yǎng)時(shí)長為24h及48小時(shí)），但可根據(jù)細(xì)胞的生長狀況重新設(shè)定加藥的時(shí)間。一般在種板的其次天即可加藥。

蘋果，藥物滅菌問題還有MTT配制相關(guān)的問題，我在查查，然后在問問。MTT試驗(yàn)第三階段

（1）.藥物滅菌：目前滅菌方式有煮沸滅菌、高壓滅菌、紫外滅菌、過濾滅菌、輻射滅菌、無菌制備等。（自己看看吧），可以先凍干在再紫外滅菌試試（紫外照射會破換紫杉醇結(jié)構(gòu)嗎？或者會影響納米晶體的物理性質(zhì)嗎？）

（2）.梯度藥物溶液配制：首先查閱文獻(xiàn)找到紫杉醇的IC50值。兩種梯度配制方法（一般5-6個(gè)梯度）：以IC50作為中間梯度，上下各配兩梯度，梯度濃度一般相差10倍；或?qū)C50作為最高濃度梯度，往下配制幾個(gè)梯度濃度（確保無菌操作）。此外配制藥物溶液所用培養(yǎng)基是否參與血清，眾說紛紜，培養(yǎng)基是保證細(xì)胞存活的基本條件，血清參與是保證細(xì)胞增殖的要求，個(gè)人覺得應(yīng)用含血清的培養(yǎng)基來配制溶液。

（3）.96孔板加藥：加藥時(shí)，應(yīng)將舊培養(yǎng)基全部吸掉，將96孔板呈30°角放置，利于將培養(yǎng)基吸盡，且不影響細(xì)胞。具體操作：一個(gè)梯度濃度的5個(gè)孔吸掉培養(yǎng)基，再往5個(gè)孔中參與含藥物的培養(yǎng)基（防止在將全部孔中的舊培養(yǎng)基吸掉的過程中，前面孔中細(xì)胞由于缺少培養(yǎng)基而干死）。加樣量為200ul。MTT溶液配制

MTT，商品名：噻唑藍(lán)，是一種黃顏色的染料，為強(qiáng)致癌物質(zhì)，在稱取過程中需要特別防備，蘋果！MTT濃度為5mg/ml，一般每孔加20ul，因此一塊板最多需要1200ul，即1.2ml?？啥嗯渲疲a箔紙包住避光4℃保存。MTT配制多用生理鹽水或PBS溶液。MTT水溶性不好（雖為季銨鹽類，但結(jié)構(gòu)式周邊苯環(huán)及噻唑無形之中降低其水中的溶解度），50mg溶于10ml水，超聲半天都不能完全溶解（這個(gè)問題我現(xiàn)在還沒找到解決方法，蘋果）。

MTT試驗(yàn)第四階段

（1）.96孔板加MTT：一般都是將加藥后的96孔板培養(yǎng)至24小時(shí)，使藥物充分對細(xì)胞進(jìn)行作用。而實(shí)際狀況下有些藥物會很快抑制細(xì)胞生長，見效時(shí)間短，那么在這種狀況下再將藥物與細(xì)胞放置培養(yǎng)24小時(shí)的話，最終的結(jié)果中梯度濃度的腫瘤抑制率上就不會有梯度效果，無法計(jì)算IC50，更無法知曉哪個(gè)濃度為最有效濃度或最接近有效濃度。判斷上述現(xiàn)象可以通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)來，即將96孔板放置于顯微鏡下進(jìn)行觀測，假使發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大量死亡應(yīng)終止培養(yǎng)，加MTT（狀況不可一概而論）。

具體操作：在適合的時(shí)間點(diǎn)吸掉舊培養(yǎng)基，假使你的藥物與MTT可以反應(yīng)（將MTT還原成甲贊）,用無菌的PBS（200μl-300μl）沖洗加藥孔，沖洗應(yīng)注意勿將活細(xì)胞帶走。清洗完后，每孔在參與100μl完全培養(yǎng)基，隨后每孔參與20-50μlMTT,對照組與空白組也執(zhí)行以上操作。加完MTT將96孔板放入孵溫箱培育4h，拿出后先離心，防止吸掉液體時(shí)也將甲贊沉淀吸走，影響最終的OD值。

腫瘤細(xì)胞抑制率=1-（加藥孔OD-空白孔OD）/（對照孔OD-空白空OD）

一般狀況下，最終96孔板顏色越深，該濃度下該藥物的腫瘤抑制率越低。但也會有其它原因造成紫色加深，例如染菌、藥物自身與MTT發(fā)生反應(yīng)等。前期種板的細(xì)胞數(shù)目的均一性，加樣的確鑿性等也會影響最終的試驗(yàn)結(jié)果。

Eto不同劑型癌細(xì)胞抑制率比較100FreeEtoEtoNPsPEG-EtoNPs80A549抑制率604020232345123451234CAAAA