(4.7)-第二章酶的生產(chǎn)酶工程教學(xué)

提取分離法生物合成法化學(xué)合成法

酶的生產(chǎn)微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶酶的發(fā)酵生產(chǎn)：經(jīng)過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)，通過(guò)人工操作控制，利用細(xì)胞（動(dòng)物、植物、微生物）的生命活動(dòng)，大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)所需的酶的技術(shù)過(guò)程。大多數(shù)酶的生產(chǎn)采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)，原因？微生物研究充分、種類(lèi)多、繁殖快、易培養(yǎng)、代謝能力強(qiáng)。第二章酶的發(fā)酵工程微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶的微生物合成的調(diào)節(jié)產(chǎn)酶微生物酶發(fā)酵生產(chǎn)的工藝控制酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

第一節(jié)酶的微生物合成的調(diào)節(jié)一、酶生物合成的基本過(guò)程二、酶生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制三、酶生物合成的模式遺傳信息傳遞的中心法則蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA加工、組裝P酶R酶一、酶生物合成的基本過(guò)程（一）RNA的生物合成——轉(zhuǎn)錄(transcription)

以DNA為模板，以三磷酸核苷為底物，在RNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成RNA分子的過(guò)程。TCGAGTACAGCTCATGCGAGUACGCAURNA聚合酶RNAPPi5’5’3’GTPUTPCTPATPUTP3’3’5’編碼鏈（codingstrand)模板鏈（templatestrand）RNA合成過(guò)程起始階段雙鏈DNA局部解開(kāi)磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn)延伸階段53RNA

啟動(dòng)子（promotor)

終止子(terminator)5RNA聚合酶5353553離開(kāi)RNA合成過(guò)程——前體加工以mRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過(guò)各種tRNA、酶和輔助因子的作用，合成多肽鏈的過(guò)程。蛋白質(zhì)的合成過(guò)程：氨基酸的活化、肽鏈合成的起始、肽鏈的延伸、肽鏈合成的終止、肽鏈加工（二）蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯(translation)

1.氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運(yùn)AA+tRNA+ATP氨酰-tRNA合成酶AA-tRNA+AMP+PPi肽鏈合成時(shí)的第一個(gè)氨基酸：真核生物：甲硫氨酸（Met）原核生物：甲酰甲硫氨酸（fMet）AA+ATP+EE-AA-AMP+PPiE-AA-AMP+tRNAAA-tRNA+AMP+E

2.多肽合成

起始階段A位點(diǎn)（aminoacylsite）P位點(diǎn)（peptidylsite）E位點(diǎn)（exitsite）延伸階段肽基轉(zhuǎn)移酶終止階段3.肽鏈的加工N端Met、fMet的切除二硫鍵的形成肽鏈的剪切肽鏈的折疊氨基酸側(cè)鏈修飾轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)翻譯水平的調(diào)節(jié)翻譯產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)酶降解調(diào)節(jié)酶生物合成的調(diào)節(jié)二、酶生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制（一）酶合成調(diào)節(jié)的類(lèi)型

誘導(dǎo)（induction）和阻遏（repression）1.誘導(dǎo)（induction）：酶促分解底物或產(chǎn)物誘使微生物細(xì)胞合成分解代謝途徑中有關(guān)酶的過(guò)程。組成酶（constitutiveenzyme）：DNA酶，RNA酶，糖酵解途徑酶等誘導(dǎo)酶（adaptive/regulatedenzyme）：

β-半乳糖苷酶等酶的類(lèi)型合成是否受環(huán)境因素影響？誘導(dǎo)酶：微生物通過(guò)誘導(dǎo)作用而產(chǎn)生的酶（為適應(yīng)外來(lái)底物或其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或產(chǎn)物而臨時(shí)合成的酶類(lèi)）。誘導(dǎo)物（inducer）：底物或結(jié)構(gòu)類(lèi)似物、產(chǎn)物誘導(dǎo)作用的類(lèi)型：協(xié)同誘導(dǎo)：誘導(dǎo)物加入后，微生物能同時(shí)或幾乎同時(shí)誘導(dǎo)出幾種酶的合成，主要存在于短的代謝途徑中。順序誘導(dǎo)：先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中間代謝物的酶，以達(dá)到對(duì)較復(fù)雜代謝途徑的分段調(diào)節(jié)。誘導(dǎo)的意義：體現(xiàn)菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則——需要時(shí)才合成2.阻遏（repression）：阻礙代謝過(guò)程中包括關(guān)鍵酶在內(nèi)的一系列酶的合成的現(xiàn)象，從而更徹底地控制和減少末端產(chǎn)物的合成。阻遏作用的類(lèi)型：終產(chǎn)物阻遏（end-productrepression）/反饋?zhàn)瓒簦╢eedbackrepression）分解代謝產(chǎn)物阻遏（cataboliterepression）阻遏的意義：體現(xiàn)菌體生長(zhǎng)的經(jīng)濟(jì)原則——不需要就不合成。①終產(chǎn)物阻遏（反饋?zhàn)瓒簦┖铣纱x途徑的終產(chǎn)物過(guò)量積累時(shí)對(duì)參與該途徑反應(yīng)所需的一個(gè)或多個(gè)酶的合成的阻遏。①直線式反應(yīng)途徑（協(xié)同阻遏）：末端產(chǎn)物作用于代謝途徑中的各種酶，使之合成受阻遏。②分支代謝途徑：每種末端產(chǎn)物僅專一地阻遏合成它的那條分支途徑的酶。②分解代謝物阻遏細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時(shí)，利用快的底物會(huì)阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。葡萄糖效應(yīng)1.操縱子學(xué)說(shuō)：Jacob、Monod因1960年提出mRNA及操縱子的理論，獲得1965年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

啟動(dòng)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因操縱子1.RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)2.cAMP及其受體蛋白復(fù)合物（CRP-cAMP）結(jié)合位點(diǎn)（二）酶合成調(diào)節(jié)的機(jī)制——操縱子學(xué)說(shuō)調(diào)節(jié)基因與變構(gòu)蛋白結(jié)合編碼一個(gè)或多個(gè)酶的基因編碼調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)蛋白：兩個(gè)特殊位點(diǎn)：其一可與操縱基因結(jié)合，另一位點(diǎn)則可與效應(yīng)物相結(jié)合。效應(yīng)物：誘導(dǎo)物、輔阻遏物作用原理：當(dāng)調(diào)節(jié)蛋白與效應(yīng)物結(jié)合后，就發(fā)生變構(gòu)作用(變構(gòu)蛋白)，其變構(gòu)后可提高或降低其與操縱基因的結(jié)合能力?；虿倏v子調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意圖

調(diào)節(jié)基因

啟動(dòng)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因

DNA

轉(zhuǎn)錄

（-）

RNA聚合酶（+）轉(zhuǎn)錄

翻譯

mRNA

變構(gòu)蛋白

翻譯

調(diào)節(jié)蛋白

蛋白質(zhì)

效應(yīng)物

控制區(qū)信息區(qū)操縱子誘導(dǎo)型操縱子阻遏型操縱子2.操縱子的分類(lèi)——誘導(dǎo)型、阻遏型①誘導(dǎo)型操縱子（inducibleoperon）：只有當(dāng)存在誘導(dǎo)物時(shí)，其轉(zhuǎn)錄頻率才最高，并隨之轉(zhuǎn)譯出大量誘導(dǎo)酶，出現(xiàn)誘導(dǎo)現(xiàn)象。例：乳糖操縱子（Lacoperon）

分解利用乳糖的酶：

-半乳糖苷酶（lacZ）；-半乳糖苷透過(guò)酶（lacY）；

-半乳糖乙?；福╨acA）

實(shí)驗(yàn)：（1）大腸桿菌生長(zhǎng)在葡萄糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)無(wú)上述三種酶合成（2）大腸桿菌生長(zhǎng)在乳糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有上述三種酶合成

表明乳糖的存在誘導(dǎo)了相關(guān)酶的合成。調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖酶結(jié)構(gòu)基因PLacZLacYLacAmRNA

阻遏蛋白（有活性）基因關(guān)閉啟動(dòng)基因OIPLacZLacYLacA調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖酶結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子OImRNAZmRNAYmRNAA

阻遏蛋白（無(wú)活性）基因表達(dá)mRNA別乳糖

阻遏蛋白（有活性）誘導(dǎo)機(jī)制Lac操縱子乳糖經(jīng)β-半乳糖苷酶催化②阻遏型操縱子（repressibleoperon）：只有當(dāng)缺乏輔阻遏物時(shí)，其轉(zhuǎn)錄頻率才最高。由阻遏型操縱子所編碼的酶的合成，只有通過(guò)去阻遏作用才能啟動(dòng)。輔阻遏物：阻遏酶產(chǎn)生的物質(zhì)，可與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，促進(jìn)其與操縱基因的結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄進(jìn)行。反饋?zhàn)瓒衾荷彼岵倏v子（Trpoperon）

實(shí)驗(yàn)：（1）大腸桿菌生長(zhǎng)在無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時(shí)，檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在（2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成。（1）阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)控（2）衰減子的調(diào)節(jié)作用前導(dǎo)序列轉(zhuǎn)錄出的前導(dǎo)mRNA含有4個(gè)區(qū)域：1、2、3、4區(qū)，兩兩之間可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)酶的誘導(dǎo)和阻遏操縱子模型B.阻遏蛋白加誘導(dǎo)物A.阻遏蛋白C.阻遏蛋白原D.阻遏蛋白原加輔阻遏物操縱基因啟動(dòng)基因調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因

阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白結(jié)合操縱基因，結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白不能起結(jié)合操縱基因,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)酶蛋白mRNA阻遏蛋白原不能跟操縱基因結(jié)合,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)阻遏蛋白原(無(wú)活性)酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白原結(jié)合形成阻遏蛋白，從而結(jié)合操縱基因,結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)代謝產(chǎn)物例：葡萄糖效應(yīng)實(shí)驗(yàn)：E.coli培養(yǎng)在含乳糖和葡萄糖的培養(yǎng)基上，可優(yōu)先利用葡萄糖，并于葡萄糖耗盡后才開(kāi)始利用乳糖，這就產(chǎn)生了在兩個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中間隔開(kāi)一個(gè)生長(zhǎng)延滯期的“二次生長(zhǎng)現(xiàn)象”。原因：葡萄糖的存在阻遏了分解乳糖酶系合成分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏機(jī)制RLacZLacYLacAmRNAmRNAZmRNAYmRNAA基因表達(dá)CRP基因結(jié)構(gòu)基因TCRPOCRP-cAMP結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶TCRP-cAMPP葡萄糖分解代謝產(chǎn)物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物與cAMP的關(guān)系cAMPCRP：分解代謝物活化劑蛋白，環(huán)腺苷酸受體蛋白降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態(tài)如何解除？？小結(jié)酶合成的誘導(dǎo)及作用機(jī)制酶合成的反饋?zhàn)瓒艏白饔脵C(jī)制酶合成的分解代謝物阻遏及作用機(jī)制操縱子學(xué)說(shuō)！問(wèn)題延伸：如何穩(wěn)定地獲得大量調(diào)節(jié)酶？遺傳控制（一勞永逸）1.改良菌種(1)使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型——選育組成型突變株(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?.基因工程育種

如何操作？？微生物生長(zhǎng)曲線：1.延遲期（調(diào)整期）2.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期3.穩(wěn)定期（平衡期）4.衰退期1234三、酶生物合成的模式酶生物合成的模式

根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的關(guān)系，將酶的生物合成分為4種模式：

生長(zhǎng)偶聯(lián)型——同步合成型延續(xù)合成型

部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型中期合成型非生長(zhǎng)偶聯(lián)型——滯后合成型（Ⅰ）同步合成型：酶的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步進(jìn)行，進(jìn)入平衡期后，酶的合成隨之停止（Ⅱ）延續(xù)合成型：酶的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步進(jìn)行，生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶又延續(xù)合成一段時(shí)間（Ⅲ

）中期合成型：酶的合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后才開(kāi)始，進(jìn)入平衡期后，酶的合成隨之停止（Ⅳ）滯后合成型：細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后甚至是進(jìn)入平衡期后，才開(kāi)始并大量積累酶go特點(diǎn)：（1）酶的生物合成不受分解代謝物阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏（2）酶所對(duì)應(yīng)的mRNA不穩(wěn)定。1.同步合成型（生長(zhǎng)偶聯(lián)型）

酶細(xì)胞細(xì)胞或酶濃度時(shí)間大部分組成酶2.中期合成型（部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型）特點(diǎn)：（1）酶的合成受到產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒艋蚍纸獯x物阻遏（2）酶所對(duì)應(yīng)的mRNA不穩(wěn)定。酶細(xì)胞

細(xì)胞或酶濃度時(shí)間特點(diǎn)：（1）酶的合成不受分解代謝物或產(chǎn)物的阻遏（2）酶所對(duì)應(yīng)的mRNA相當(dāng)穩(wěn)定3.延續(xù)合成型（部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型）黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線特點(diǎn)：（1）在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期不合成酶（可能是受到阻遏物的影響）（2）酶所對(duì)應(yīng)的mRNA相當(dāng)穩(wěn)定4.滯后合成型（非生長(zhǎng)偶聯(lián)型）酶細(xì)胞細(xì)胞或酶濃度時(shí)間水解酶（1）mRNA的穩(wěn)定性（2）培養(yǎng)基中阻遏物存在與否影響酶生物合成的模式的主要因素：（1）mRNA穩(wěn)定性好的，可在細(xì)胞停止生長(zhǎng)后繼續(xù)合成其所對(duì)應(yīng)的酶（2）mRNA穩(wěn)定性差的，酶的合成隨著細(xì)胞停止生長(zhǎng)而終止（3）受某些物質(zhì)阻遏的，需在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或在平衡期后（解除阻遏），開(kāi)始合成酶（4）不受某些物質(zhì)阻遏的，酶的合成隨著細(xì)胞生長(zhǎng)而同步增長(zhǎng)規(guī)律：

酶生產(chǎn)中最理想的合成模式？延續(xù)合成型：發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有生長(zhǎng)期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)就有酶的產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時(shí)間。

如何改造非理想模式？同步合成型：提高對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵溫度。滯后合成型：盡量減少甚至解除反饋?zhàn)瓒艉头纸獯x物阻遏，使酶的合成提早開(kāi)始。中期合成型：要在提高mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面努力。小結(jié)酶生物合成的四種模式及特點(diǎn)影響酶生物合成的模式的主要因素最理想的酶生物合成模式及其他模式的改造第二節(jié)產(chǎn)酶微生物一、常用產(chǎn)酶微生物二、產(chǎn)酶微生物的來(lái)源三、菌種的保藏1.產(chǎn)酶微生物的特點(diǎn)產(chǎn)酶量高繁殖快，易培養(yǎng)穩(wěn)定性好，不易變異退化，抗污染能力強(qiáng)原料價(jià)格低廉，生產(chǎn)成本低

易于分離純化（胞外酶）菌株安全，不是病原菌，不產(chǎn)生有害物質(zhì)

基因工程菌株的安全性一、常用產(chǎn)酶微生物細(xì)菌放線菌酵母菌霉菌2.常用的產(chǎn)酶微生物（1）細(xì)菌（Bacterial）球菌桿菌螺旋菌大腸桿菌（E.coli）——胞內(nèi)酶基因工程常用宿主菌枯草芽孢桿菌（B.subtilis）——多為胞外酶用于生產(chǎn)：淀粉酶（amylase）蛋白酶（proteinase）（2）放線菌(Actinomycetes)呈菌絲狀生長(zhǎng)，主要以孢子繁殖和陸生性較強(qiáng)的原核生物。鏈霉菌屬多種酶：纖維素酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶最大經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于能產(chǎn)生多種抗生素（antibiotics）

伊維菌素——2015年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)（3）

酵母菌（yeast）

常用酵母菌有：釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)假絲酵母(Candida)類(lèi)酵母(Saccharomycodes)等用于釀酒、制造面包、制造低凝固點(diǎn)石油、生產(chǎn)脂肪酶、轉(zhuǎn)化酶、尿激酶等。（4）霉菌（mould）工業(yè)上常用的霉菌有：藻狀菌綱的根霉、毛霉，子囊菌綱的紅曲霉，半知菌類(lèi)的曲霉、青霉等產(chǎn)品：酶制劑（enzymepreparation）、抗生素(antibiotic)、有機(jī)酸（organicacid）及甾體激素（steroidhormone）等。二、產(chǎn)酶微生物的來(lái)源

向有關(guān)科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門(mén)索取或購(gòu)買(mǎi)

從自然界中分離篩選

菌種選育1.產(chǎn)酶微生物的購(gòu)買(mǎi)來(lái)源：空氣、水體、土壤、生物體分離思路：

從混雜的各類(lèi)微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來(lái)。2.產(chǎn)酶微生物的分離和篩選

稀釋分離法、平板劃線法含菌樣品采集

富集培養(yǎng)純種分離純培養(yǎng)生產(chǎn)性能測(cè)定新種分離與篩選的步驟相近菌種產(chǎn)酶性質(zhì)相似胞外酶與產(chǎn)生菌的最適條件相近底物含量豐富，菌種富集初篩：以量為主復(fù)篩：以質(zhì)為主提高菌種數(shù)量，利于分離純化提高菌種數(shù)量3.產(chǎn)酶菌種選育

自然選育誘變育種代謝控制育種原生質(zhì)體融合育種基因工程育種基因組改組三、菌種的保藏方法名稱主要措施適宜菌種保藏期評(píng)價(jià)斜面低溫保藏法甘油懸液保藏法石蠟油封藏法砂土管保藏法冷凍干燥保藏法低溫低溫低溫、缺氧干燥、無(wú)營(yíng)養(yǎng)干燥、無(wú)氧、低溫、有保護(hù)劑各大類(lèi)各大類(lèi)各大類(lèi)產(chǎn)孢子微生物各大類(lèi)3~6月6~12月1~2年1~10年5~15年以上簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便有效第三節(jié)酶發(fā)酵生產(chǎn)的工藝控制保藏菌種菌種活化菌種擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵液分離純化酶固定化原生質(zhì)體培養(yǎng)基固定化細(xì)胞工藝條件控制pH溫度溶氧碳源氮源無(wú)機(jī)鹽生長(zhǎng)因素酶發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程

試管菌種培養(yǎng)茄瓶菌種培養(yǎng)搖瓶菌種培養(yǎng)孢子（菌體）懸液制備種子罐菌種培養(yǎng)發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵液預(yù)處理酶的分離純化精制菌種擴(kuò)大培養(yǎng)一、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)與退化1.菌種擴(kuò)大培養(yǎng)：將保藏菌種接入試管斜面活化，再經(jīng)搖瓶或茄子瓶及種子罐，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)達(dá)到一定數(shù)量和質(zhì)量的純種培養(yǎng)物的過(guò)程。純種培養(yǎng)物——種子

2.種子制備過(guò)程3.種子質(zhì)量控制（1）影響種子質(zhì)量的因素：培養(yǎng)基培養(yǎng)條件種齡接種量種齡（inoculumage）定義：種子罐中培養(yǎng)的菌絲轉(zhuǎn)入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐的培養(yǎng)時(shí)間。菌絲體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體量未到最大，活力最強(qiáng)接種量（inoculationquantity）定義：移入的種子液體積和接種后發(fā)酵罐培養(yǎng)液體積之比接種量大：縮短菌絲生長(zhǎng)時(shí)間，縮短延遲期，提早進(jìn)入生產(chǎn)期；菌體生長(zhǎng)過(guò)快，培養(yǎng)液溶氧下降，產(chǎn)量低接種量?。壕z生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)，生產(chǎn)時(shí)間長(zhǎng)有何影響？（2）種子質(zhì)量的控制菌種穩(wěn)定性檢查無(wú)菌篩查二、培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基：人工配制的用于菌種擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。水碳源基本成分氮源無(wú)機(jī)鹽生長(zhǎng)因子生理功能：水是微生物最基本的組成分（70％—90％），直接參與各種代謝活動(dòng)水是微生物體內(nèi)和體外的溶劑（吸收營(yíng)養(yǎng)成分和代謝廢物）調(diào)節(jié)細(xì)胞溫度和保持環(huán)境溫度的穩(wěn)定（比熱高，傳熱快）

水源質(zhì)量的主要參數(shù)包括pH值、溶解氧、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量等。1.水2.碳源生理功能：碳是構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)的主要元素之一，也是所有酶的重要組成元素。碳源可作能源，為生命活動(dòng)提供能量有機(jī)碳源/無(wú)機(jī)碳源：糖類(lèi)、醇類(lèi)、脂類(lèi)、有機(jī)酸、烴類(lèi)、蛋白質(zhì)及其降解物速效碳源/遲效碳源不同微生物對(duì)碳源的利用有所不同，在酶發(fā)酵生產(chǎn)中應(yīng)注意碳源對(duì)酶生物合成的代謝調(diào)節(jié)作用（誘導(dǎo)和阻遏）如何解除分解代謝物阻遏作用？？補(bǔ)加cAMP分批、流加速效碳源，或只使用遲效碳源選擇合適碳源，以適應(yīng)目的酶的合成調(diào)節(jié)機(jī)制生理功能:構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的主要元素之一，也是所有酶的重要組成元素。

有機(jī)氮源/無(wú)機(jī)氮源：蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、豆餅粉、花生餅粉、銨鹽、硝酸鹽

速效氮源/遲效氮源3.氮源4.無(wú)機(jī)鹽生理功能：參與細(xì)胞物質(zhì)和酶的組成調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、氧化還原電位、pH酶的激活劑

大量元素/微量元素：硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物以及含有鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、銅、鉬、鋅等元素的化合物。5.生長(zhǎng)因子微生物細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的微量有機(jī)化合物。分類(lèi)：維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶、生長(zhǎng)激素等來(lái)源：實(shí)驗(yàn)室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等，發(fā)酵生產(chǎn)中常用麥芽浸膏、玉米漿、酵母抽提物等三、培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酶的調(diào)控

1.溫度的調(diào)節(jié)控制不同的微生物有不同的最適生長(zhǎng)溫度：例：枯草芽孢桿菌最適生長(zhǎng)溫度34～37℃黑曲霉最適生長(zhǎng)溫度為28～32℃生長(zhǎng)最適溫度（高）發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度（低）原因：在較低的溫度條件下，可以提高酶所對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，增加酶生物合成的延續(xù)時(shí)間，從而提高酶的產(chǎn)量。變溫發(fā)酵原因？溫度控制：加熱：發(fā)酵產(chǎn)熱，一般不需加熱冷卻：冷卻水（冷凍鹽水）通過(guò)夾層或盤(pán)管（蛇管）循環(huán)冷卻。2.pH的調(diào)節(jié)控制不同的微生物有不同的最適生長(zhǎng)pH例：細(xì)菌和放線菌：中性或堿性（pH6.5～8.0）霉菌和酵母：偏酸性（pH4～6）生長(zhǎng)最適pH：利于菌體生長(zhǎng)產(chǎn)酶最適pH：利于酶合成變pH發(fā)酵有些細(xì)胞可以同時(shí)產(chǎn)生若干種酶，在生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)控制培養(yǎng)基的pH值，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。例：采用米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)基的pH值為堿性時(shí)，主要生產(chǎn)堿性蛋白酶；培養(yǎng)基的pH值為中性時(shí)，主要生產(chǎn)中性蛋白酶；而在酸性的條件下，則以生產(chǎn)酸性蛋白酶為主。發(fā)酵過(guò)程中，pH值控制和調(diào)節(jié)方法？？調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方：調(diào)節(jié)碳氮比（C/N）添加緩沖劑補(bǔ)料控制：直接加酸加堿補(bǔ)加碳源或氮源3.溶解氧的調(diào)節(jié)控制溶解氧（dissolvedoxygen，DO）：溶解在培養(yǎng)基中的氧氣生理功能：使能源物質(zhì)經(jīng)過(guò)有氧降解而生成大量的細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖和酶的生物合成過(guò)程需要的能量ATP。DO影響因素：通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時(shí)間、氣液接觸面積以及培養(yǎng)液的性質(zhì)（黏度、氣泡、溫度等）發(fā)酵前期：微生物大量繁殖，需氧量不斷大幅度增加，溶氧明顯下降。發(fā)酵中后期：溶氧濃度明顯地受工藝控制手段的影響，如補(bǔ)料的數(shù)量、時(shí)機(jī)和方式等。發(fā)酵后期：菌體衰老，呼吸減弱，菌體自溶，溶氧就會(huì)明顯地上升。發(fā)酵過(guò)程的溶氧變化若監(jiān)測(cè)到DO異常變化，有何意義？供氧量>需氧量溶氧濃度供氧量<需氧量溶氧濃度臨界氧濃度：不影響菌體呼吸所允許的最低氧濃度。最適氧濃度：維持菌體的最大比攝氧率，得到最大的菌體合成量的濃度。二者間平衡發(fā)酵過(guò)程中，如何對(duì)體系的溶氧速率進(jìn)行調(diào)節(jié)？？？溶解氧的調(diào)節(jié)控制方法：調(diào)節(jié)通氣量調(diào)節(jié)氧分壓調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間調(diào)節(jié)氣液接觸面積改變培養(yǎng)液的性質(zhì)通氣量↑DO↑氧分壓↑DO↑時(shí)間↑DO↑面積↑DO↑黏度↓DO↑氣泡↓DO↑溫度↓DO↑4.泡沫的調(diào)節(jié)控制選育不易產(chǎn)生泡沫的菌種調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分，減少或緩加易起泡的原料機(jī)械消泡/消泡劑消泡5.濕度的調(diào)節(jié)控制——固體發(fā)酵小結(jié)：微生物發(fā)酵產(chǎn)酶工藝控制培養(yǎng)基成分pH溫度溶解氧泡沫濕度四、發(fā)酵方法固體發(fā)酵——霉菌液體深層發(fā)酵（浸沒(méi)式培養(yǎng)）——最主要液體深層發(fā)酵方式：分批發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵補(bǔ)料分批發(fā)酵1.分批（間歇）發(fā)酵batchfermentation營(yíng)養(yǎng)物和菌種一次加入發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，直至反應(yīng)將發(fā)酵液一次放出發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行到一定階段時(shí)，以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)以相同的速度連續(xù)流出培養(yǎng)液2.連續(xù)發(fā)酵continuousfermentation連續(xù)加入連續(xù)流出3.補(bǔ)料-分批發(fā)酵fed-batchfermentation發(fā)酵過(guò)程中間歇或連續(xù)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，待發(fā)酵液體積達(dá)到發(fā)酵罐最大操作容積后停止補(bǔ)料，待發(fā)酵結(jié)束將發(fā)酵液一次全部放出。間歇、連續(xù)補(bǔ)加五、提高酶產(chǎn)量的策略酶合成調(diào)節(jié)機(jī)制保證了生物體內(nèi)酶合成最經(jīng)濟(jì)、最有效地利用體內(nèi)合成的原料與能量。然而從人類(lèi)利用的目的出發(fā)，要使酶產(chǎn)量提高，就要有針對(duì)性地打破這種調(diào)節(jié)機(jī)制。從內(nèi)外兩方面入手：①條件控制；②遺摶控制，包括基因突變和基因重組。采取相應(yīng)措施后，參與分解代謝的酶產(chǎn)量可能有上千倍的變化，而參加合成代謝的酶類(lèi)則有百余倍的增長(zhǎng)。（一）條件控制（外因）1.添加誘導(dǎo)物誘導(dǎo)酶：在發(fā)酵過(guò)程中的某個(gè)適宜的時(shí)機(jī)，添加適宜的誘導(dǎo)物，可以顯著提高酶的產(chǎn)量。誘導(dǎo)物一般可以分為3類(lèi)：酶的作用底物酶的反應(yīng)產(chǎn)物酶的底物類(lèi)似物（最有效）阻遏作用根據(jù)機(jī)理不同，可分為：

反饋?zhàn)瓒糇饔茫河擅复呋饔玫哪┒水a(chǎn)物引起的阻遏作用。

分解代謝物阻遏作用：由分解代謝物引起的阻遏作用。

控制阻遏物（末端產(chǎn)物、分解代謝物）濃度是解除阻遏、提高酶產(chǎn)量的有效措施。2.降低阻遏物濃度減少或者解除分解代謝物阻遏作用可以通過(guò)控制培養(yǎng)基中葡萄糖等速效碳源或氮源的濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)，以下關(guān)于該方法描述正確的是：采用較難利用的碳源，如淀粉等采用補(bǔ)料、分次流加碳源的方式添加一定量的環(huán)腺苷酸（cAMP）及時(shí)分離產(chǎn)物，降低末端產(chǎn)物的濃度ABCD提交多選題1分減少或者解除分解代謝物阻遏作用：控制培養(yǎng)基中葡萄糖等速效碳源或氮源的濃度。采用較難利用的碳源，如淀粉等采用補(bǔ)料、分次流加碳源的方式添加一定量的環(huán)腺苷酸（cAMP）對(duì)于末端產(chǎn)物阻遏的酶，可以通過(guò)控制末端產(chǎn)物的濃度的方法使阻遏解除。表面活性劑：與細(xì)胞膜相互作用，增加細(xì)胞的透過(guò)性，有利于酶向胞外分泌。非離子型表面活性劑：吐溫（Tween）、曲通（Triton）離子型表面活性劑：對(duì)細(xì)胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性劑，對(duì)細(xì)胞的毒性較大。3.添加表面活性劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑：非微生物生長(zhǎng)所必須，可以促進(jìn)產(chǎn)酶，但作用機(jī)理未闡明的物質(zhì)。4.添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑（二）遺傳控制（內(nèi)因）——突變株組成型突變株：調(diào)節(jié)基因或操縱基因發(fā)生突變，解除誘導(dǎo)酶的生成對(duì)誘導(dǎo)物的依賴的突變株。營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株：突變導(dǎo)致了某酶合成能力的喪失，末端產(chǎn)物不能積累，解除了其反饋?zhàn)瓒糇饔茫尤肽┒水a(chǎn)物即可正常生長(zhǎng)?？狗答?zhàn)瓒敉蛔兙辏赫{(diào)節(jié)基因或操縱基因發(fā)生突變，產(chǎn)生的調(diào)節(jié)蛋白與產(chǎn)物不能結(jié)合，或結(jié)合但不發(fā)生作用

第四節(jié)酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)：研究發(fā)