酶組織化學(xué)應(yīng)用課件

酶組織化學(xué)---水解酶及氧化還原酶組織化學(xué)原理及方法組織化學(xué)狹義應(yīng)用化學(xué)和物理學(xué)原理在組織切片上，加入某種試劑使其與組織切片中欲檢測(cè)的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，最終形成有色沉淀，在顯微鏡下觀察，以研究組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。1.基本原理細(xì)胞內(nèi)的酶催化分解合適的底物，生成中間產(chǎn)物（即初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物）然后其中之一再與輔助物（或捕捉劑）反應(yīng)，生成有色不溶性的終反應(yīng)產(chǎn)物該反應(yīng)產(chǎn)物沉積在原位，以顯示酶的存在偶氮偶聯(lián)法⑴Gomori萘酚磷酸酯法---AKP在堿性條件下將α-萘基磷酸鈉水解出α-萘酚,隨后α-萘酚與固藍(lán)B鹽在酶活性部位偶聯(lián),形成紫紅至紫黑色的不溶性沉淀【孵育液】α-萘基磷酸鈉,蒸餾水,5%四硼酸鈉,10%硫酸鎂,固藍(lán)B鹽⑵六偶氮對(duì)品紅與α-萘酚偶聯(lián)---以萘酚AS-BI磷酸酯或萘酚AS-TR磷酸酯與六偶氮對(duì)品紅。（偶聯(lián)人工合成的磷酸萘酚鹽經(jīng)堿性磷酸酶水解后釋放出萘酚，后者立即與重氮鹽偶聯(lián)生成不溶性偶氮色素）【孵育液】萘酚AS-BI磷酸鈉,二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亞砜(DMSO),Tris-cl或巴比妥醋酸緩沖液,六偶氮對(duì)品紅

【操作步驟】1.小塊組織液氮驟冷,低溫冰箱切片2.甲醛鈣液(Fca)固定5分鐘,4℃,然后蒸餾水洗,也可不固定3.作用液5~60分鐘,37℃或室溫4.蒸餾水洗5.4%甲醛固定15分鐘~2小時(shí),室溫6.自來(lái)水洗,蒸餾水洗7.1%甲基綠(氯仿洗過(guò))5~10分鐘,蒸餾水洗8.甘油明膠封片,或丙酮-丙酮甲苯-DPX封固【結(jié)果】酶活性處出現(xiàn)紅色無(wú)定形的沉淀,核呈藍(lán)綠色酶的種類(lèi)1.氧化還原酶2.轉(zhuǎn)移酶

3.水解酶

4.裂合酶

5.異構(gòu)酶

6.合成酶（一）堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）又稱堿性磷酸單酯酶（EC3.1.3.1）在堿性環(huán)境下催化多種醇和酚的磷酸酯水解最適PH9.2~9.4

激活劑:如Mg++,Mn++,某些氨基酸等抑制劑:氰化物、砷酸鹽等分布：廣泛存在于機(jī)體組織，常見(jiàn)于具有活躍轉(zhuǎn)運(yùn)功能的細(xì)胞膜內(nèi)，如毛細(xì)血管及毛細(xì)血管動(dòng)脈部分的內(nèi)皮細(xì)胞，腎近曲小管刷狀緣和腸上皮紋狀緣應(yīng)用：1.肝臟病、白血病的研究診斷

2.骨的發(fā)生和代謝疾病的研究中顯示堿性磷酸酶的常用方法:1.鈣鈷法(Gomori-Takamatsu法)【基本原理】甘油磷酸鈉磷酸酯+Ca++磷酸鈣磷酸鈷硫化鈷【孵育液】2%巴比妥鈉,3%β-甘油磷酸鈉,2%無(wú)水氯化鈣,5%硫酸鎂AKP

【操作步驟】

1.新鮮組織低溫冰凍切片2.不固定切片直接進(jìn)作用液,或用1%氯化鈣Formalin(Fca)固定5分鐘~2小時(shí),4℃,蒸餾水洗3.作用液10~60分鐘,37℃4.蒸餾水洗5.2%硝酸鈷1分鐘6.蒸餾水洗7.1~2%硫化銨1分鐘8.蒸餾水洗9.甘油明膠封片,或脫水,透明,中性樹(shù)膠封片【結(jié)果】堿性磷酸酶活性處有黑色的硫化鈷沉淀腎曲管堿性磷酸酶---鈣鈷法X200(二)酸性磷酸酶(acidphosphatase,ACP)

在酸性條件下催化醇和酚類(lèi)磷酸酯的水解最適PH為4.8~5.2

抑制劑因組織差異而不同:酒石酸,氟化物,0.5%甲醛分布:主要位于溶酶體內(nèi)應(yīng)用:前列腺癌和其他臟器的轉(zhuǎn)移性前列腺癌(+++)

Hodgins淋巴,胃癌,肺癌,乳腺癌等(+++)

尤文氏瘤,成骨肉瘤等(-)顯示酸性磷酸酶的常用方法1.酸性磷酸酶硝酸鉛法【基本原理】與堿性磷酸酶鈣鈷法的原理相似甘油磷酸鈉磷酸酯+鉛磷酸鉛硫化鉛（黑色）【孵育液】硝酸鉛，巴比妥-硝酸鹽緩沖液，β-甘油磷酸鈉【結(jié)果】酸性磷酸酶活性處呈棕黑色2.同時(shí)偶聯(lián)法【基本原理】ACP在酸性條件下水解萘酚AS-TR磷酸酯為萘酚AS-TR和磷酸,萘酚AS-TR和六偶氮對(duì)品紅偶聯(lián),在酶活性處形成紅色的不溶性復(fù)合物【孵育液】萘酚AS-TR磷酸酯,六偶氮對(duì)品紅ACP涂片-腹腔巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶X400(三)5′核苷酸酶(5′nucleotidase)

催化核糖核苷和脫氧核糖核苷在C-5′位置水解磷酸酯的水解酶最適PH因組織而異。小鼠腎為7.5,睪丸、腦、肝分別為8.5、7.5~8.5、8.0

激活劑：Mg++，Mn

++

抑制劑：氟化鈉（0.1MNaF），硼酸鈉OHOHHOHOHHOHH堿基(嘌呤、嘧啶）（H）+H2O

Pi5′N(xiāo)aseHO-CH2OHHOHHOH（H）H堿基CH2OPHO5′核苷酸酶存在于胞膜，為胞膜的標(biāo)志酶5′核苷酸酶的顯示----鉛法【基本原理】5′N(xiāo)ase水解底物5′單磷酸腺苷AMP磷酸+鉛磷酸鉛硫化鉛（黑色）【注意】5′核苷酸酶在作用上和堿性磷酸酶相似

5′N(xiāo)aseAKP1.腎組織中分布腎小管刷狀緣(+),所有僅腎小管刷狀緣(+)

基膜也(+)2.β-甘油磷酸鈉(—)(+)5′N(xiāo)ase作為底物(五)腺苷三磷酸酶又稱ATP酶ATPADP+Pi+能量根據(jù)所用激活劑、抑制劑以及酶定位的不同，可分為三類(lèi)ATP酶1.肌球蛋白腺苷三磷酸酶定位于骨骼肌最適PH為9.0~9.4被Ca++激活,而被Mg++抑制常用作區(qū)分二型肌纖維:Ⅰ型(紅肌)----收縮慢,活動(dòng)持久,其酶活性高,染色深

Ⅱ型(白肌)----收縮快,活動(dòng)不持久,其酶活性低,染色淡ATPase2.膜性腺苷三磷酸酶

又稱鈉-鉀離子激活腺苷三磷酸酶最適PH7.2~7.5

激活劑:Mg++,Na+,K+

抑制劑:Ca++,苦毒毛旋花子甙常存在于細(xì)胞膜,特別是分泌功能活躍的細(xì)胞膜。3.線粒體腺苷三磷酸酶

心肌最豐富，肝臟次之心肌的線粒體ATP酶被Mg++激活，而被Ca++抑制肝細(xì)胞線粒體ATP酶可同時(shí)被Mg++、Ca++激活心肌和肝的線粒體ATP酶均可被對(duì)-氯汞苯甲酸（PCMB）抑制種類(lèi)定位最適PH激活劑抑制劑肌球蛋白ATP酶膜性ATP酶線粒體ATP酶（六）非特異性酯酶酯酶可分為三類(lèi)——非特異性酯酶、脂酶、膽堿酯酶非特異性酯酶---水解短鏈脂肪酸的酯脂酶---水解長(zhǎng)鏈脂肪酸的酯膽堿酯酶---水解膽堿的酯酶非特異性酯酶—

最適PH5.0~8.0

定位在溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),在肝、腎、胰和小腸具有較高的酶活性

應(yīng)用----單核巨噬細(xì)胞、T淋巴、中性粒細(xì)胞都有非特異性酯酶反應(yīng)

1.在急性白血病分類(lèi)診斷時(shí)，非特異性酯酶含量多少、有無(wú)顆粒及顆粒大小，都有一定的診斷價(jià)值

2.可作為T(mén)、B淋巴細(xì)胞的鑒別顯示非特異性酯酶法---同時(shí)偶聯(lián)法

用乙酸-α-萘酯或萘酚AS衍生物為底物，在酶作用下，釋出α-萘酚，與固藍(lán)B或六偶氮對(duì)品紅偶聯(lián)，生成紫黑色或紅棕色不溶的偶氮染料（一）脫氫酶

脫氫酶的顯示：底物為脫氫酶氧化，從底物釋放出氫，經(jīng)氫傳遞系統(tǒng)，使受氫體還原而顯色常以四唑鹽和鐵氰化鉀作為受氫體

組化示脫氫酶分為不需輔酶和必需輔酶二種1.瑚珀酸脫氫酶（SDH）

SDH是屬于琥珀酸氧化酶系統(tǒng)的酶。不需輔酶的存在

SDH存在于所有有氧呼吸的細(xì)胞，以心肌、腎曲管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞含量最豐富，和線粒體膜牢固結(jié)合最適PH7.【顯示方法】Pearson二甲亞砜法【基本原理】琥珀酸鹽+受氫體（四唑鹽）富馬酸+還原的受氫體

（無(wú)色）（藍(lán)色沉淀）【作用液】0.1M琥珀酸鈉,0.1M磷酸鹽緩沖液PH7.6NBT(硝基藍(lán)四唑),二甲亞砜(DMSO)【步驟】

1.新鮮組織低溫冰凍切片2.作用液15~35分鐘3.生理鹽水洗4.Fca(氯化鈣Formalin)固定10分鐘5.入80%乙醇5分鐘6.甘油明膠封固或脫水、透明、中性樹(shù)膠封片【結(jié)果】酶活性處為藍(lán)紫色沉淀小鼠心肌冰凍切片-琥珀酸脫氫酶X4002.乳酸脫氫酶（LDH）

需輔酶的脫氫酶廣泛分布的可溶性酶，為糖原分解的酶系最適PH7.4

肝、骨骼肌的酶活性高于心肌【基本原理】催化乳酸和丙酮酸的互變反應(yīng)

乳酸鹽+NAD丙酮酸鹽+（NADH+H+）

LDH（輔酶Ⅰ）（還原型輔酶Ⅰ）（二）過(guò)氧化物酶

催化各種物質(zhì)被過(guò)氧化氫（H2O2）所氧化見(jiàn)于乳腺、甲狀腺、唾液腺、肥大細(xì)胞等髓過(guò)氧化物酶見(jiàn)于