核酸優(yōu)秀課件

第二章核酸

Nucleicacid

(4個(gè)學(xué)時(shí)）第一節(jié)概述一、核酸1869年，瑞士的一位年青科學(xué)家F.Miescher（1844-1895）從外科繃帶上膿細(xì)胞的細(xì)胞核中分離出一種有機(jī)物，稱為核素，由于它有很強(qiáng)的酸性，就改稱為核酸。1928年，英國GriffithS型肺炎球菌：有莢膜，菌落表面光滑，致病R型肺炎球菌：沒有莢膜，菌落表面粗糙，不致病肺炎球菌實(shí)驗(yàn)

結(jié)果說明：加熱殺死的S型肺炎球菌中一定有某種特殊的生物分子或遺傳物質(zhì)，可以使無害的R型肺炎球菌轉(zhuǎn)化為有害的S型肺炎球菌這種生物分子或遺傳物質(zhì)是什么呢？1944年，美國細(xì)菌學(xué)家Avery（1877－1955）及其同事的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)化因子就是DNA，DNA是生命的遺傳物質(zhì)肺炎球菌實(shí)驗(yàn)結(jié)論

紐約洛克非勒研究所Avery從加熱殺死的S型肺炎球菌將蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂類分離出來，分別加入到無害的R型肺炎球菌中結(jié)果發(fā)現(xiàn)，惟獨(dú)只有核酸可以使無害的R型肺炎球菌轉(zhuǎn)化為有害的S型肺炎球菌1944年結(jié)論：DNA是生命的遺傳物質(zhì)1952年，Hershey和Chase病毒（噬菌體）放射性同位素35S標(biāo)記病毒的蛋白質(zhì)外殼，32P標(biāo)記病毒的DNA內(nèi)核，感染細(xì)菌。新復(fù)制的病毒，檢測到了32P標(biāo)記的DNA，沒有檢測到35S標(biāo)記的蛋白質(zhì)，DNA在病毒和生物體復(fù)制或繁殖中的關(guān)鍵作用。8年的時(shí)間更有說服力的噬菌體實(shí)驗(yàn)

1952年，Chargaff，Markham等應(yīng)用紙層析及分光光度計(jì)大量測定各種生物的DNA堿基組成后，發(fā)現(xiàn)不同生物的DNA堿基組成不同，但總有A=T，G=C。

Chargaff

定則DNA雙螺旋

1953年，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的提出，被認(rèn)為是二十世紀(jì)在自然科學(xué)中的重大突破之一。

WatsonCrickWilkins1958年Crick，提出“中心法則”1970年，Smith和Ｗilcox發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶1973年，Cohen獲得第一個(gè)體外重組體1975年，Sanger發(fā)明酶法DNA快速測序1985年，Millus發(fā)明PCR技術(shù)二、核酸的種類脫氧核糖核酸（DNA）DeoxyribonucleicAcid核糖核酸（RNA）RibonucleicAcid1、脫氧核糖核酸（DNA）DeoxyribonucleicAcid遺傳信息的載體真核生物在細(xì)胞核中高度卷曲雙螺旋，與組蛋白組成染色體線粒體、葉綠體ＤＮＡ不與組蛋白結(jié)合原核生物位于核區(qū)，環(huán)狀分子2、核糖核酸（RNA）

RibonucleicAcid

RNA主要是負(fù)責(zé)DNA遺傳信息的翻譯和表達(dá)，分子量要比DNA小得多。RNA為單鏈分子。

根據(jù)RNA的功能，可以分為mRNA、tRNA和rRNA三種rRNA（ribosomalRNA)

核糖體RNARNA總量的80%是核糖體的骨架，蛋白質(zhì)的合成產(chǎn)所

tRNA：（transferRNA)轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)運(yùn)、受體RNARNA總量的15%氨基酸的受體（識(shí)別）

攜帶活化的氨基酸（轉(zhuǎn)運(yùn)）

種類很多,轉(zhuǎn)移丙氨酸的tRNA叫做丙氨酸t(yī)RNA（或tRNAAla）

三RNA在蛋白質(zhì)合成中的作用3.mRNA信使RNA1.rRNA核糖體RNA2.tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)RNA

RNA作用第二節(jié)核酸的化學(xué)組成核酸（DNA和RNA）是一種線性多聚核苷酸，它的基本結(jié)構(gòu)單元是核苷酸。核苷酸本身由核苷和磷酸組成,而核苷則由戊糖和堿基形成DNA與RNA結(jié)構(gòu)相似，但在組成成份上略有不同。核酸戊糖（DNA－脫氧核糖，RNA－核糖

堿基

磷酸基核苷酸1、戊糖β—D—核糖(inRNA)β—D—

2’－脫氧核糖(inDNA)3、核苷與核苷酸磷酸堿基戊糖H2OH2O堿基磷酸戊糖糖苷鍵（N——C）脂鍵核苷核苷酸核苷酸堿基連接（糖苷鍵）脂鍵（對(duì)DNA為H）1`2`3`4`5`第三節(jié)核酸的結(jié)構(gòu)一、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)二、ＤＮＡ高級(jí)結(jié)構(gòu)三、ＲＮＡ結(jié)構(gòu)一、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)定義：指核酸上的核苷酸排列順序。(核苷酸相當(dāng)于氨基酸、單糖的角色）連接鍵：3’，5’-磷酸二酯鍵骨架：多核苷酸的主鏈?zhǔn)俏焯呛土姿針?gòu)成的走向：5’3’脫H2O脂鍵相連3`，5`-磷酸二酯鍵首尾3`5`TTT核苷酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的簡寫形式線條式縮寫戊糖3`-OH5`-磷酸PA核苷酸5`3`首端末端PPPPPP

TCTAGC

OH

pApCpGpTpAOHpA-C-G-T-AOH

pA·C·G·T·AOH

pACGTAOH二、DNA分子的結(jié)構(gòu)1、DNA的堿基組成

Chargaff定則：A=T，G≡C，即A+G=T+C

堿基組成有種的特異性

不具有組織特異性年齡、環(huán)境、營養(yǎng)狀態(tài)的改變不影響堿基組成2、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)——Watson和Crick的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型

實(shí)驗(yàn)依據(jù)：

電位滴定行為

堿基組成規(guī)律χ光衍射數(shù)據(jù)雙螺旋模型特征結(jié)構(gòu)大部分DNA所具有的雙螺旋結(jié)構(gòu)，亦稱為B型小溝大溝1.反向、平行、右手螺旋5`3`5`3`2.鏈間堿基配對(duì)相連3.每10個(gè)堿基對(duì)螺旋上升一周4.螺距為3.4nm,相鄰堿基對(duì)平面距離0.34nm5.一條鏈為主動(dòng)鏈，另一條為被動(dòng)鏈；堿基成對(duì)規(guī)律→當(dāng)一條鏈的堿基順序確定，則另一條必有相對(duì)應(yīng)的堿基順序，但兩條鏈的堿基組成和排列順序并不相同。5，—ATTGCTA—3，3，—TAACGAT—5，

在真核及原核細(xì)胞皆有證據(jù)顯示短的Z型DNA存在。其他類型的DNA雙螺旋Z型DNA左旋、細(xì)長

雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素提問：起穩(wěn)定作用的有哪些力呢？疏水作用力（主要）

（又稱堿基堆積力）氫鍵離子鍵堿基堆積力將所有堿基堆積起來，使水分子排除在這樣的表面之外，從能量角度看最穩(wěn)定不溶于水的非極性分子在水中相互聯(lián)合，成串結(jié)合的趨勢力成為堿基間的部分堆積力堿基間的氫鍵提問：為什么在雙螺旋中是A—T，G—C形成氫鍵？DNA雙螺旋模型的提出有什么意義？DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)生物學(xué)意義第一次闡述了遺傳信息的儲(chǔ)存方式及DNA復(fù)制的機(jī)理，以準(zhǔn)確的語言回答了DNA是如何成為遺傳物質(zhì)的。大大推動(dòng)了分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，被譽(yù)為20世紀(jì)最偉大的發(fā)現(xiàn)之一。最主要的成就是堿基互補(bǔ)（配對(duì)）。根據(jù)堿基互補(bǔ)，Watson和Crick提出DNA的半保留復(fù)制機(jī)制。半保留復(fù)制保證了親代與子代性狀的相似性，解釋了遺傳性狀的穩(wěn)定性。DNA雙螺旋分子通過扭曲和折疊所形成的特定構(gòu)象原核生物DNA、真核生物細(xì)胞器DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)是超螺旋真核生物染色體DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)是核小體3、DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)固定負(fù)超螺旋反之，則為正超螺旋自然界通常為負(fù)超螺旋。提問：DNA形成三級(jí)結(jié)構(gòu)及染色體的意義何在？答案：壓縮分子空間人體每個(gè)體細(xì)胞DNA長2m,細(xì)胞直徑0.1mm,細(xì)胞核0.05mm環(huán)狀DNA右旋原核生物以及真核生物

細(xì)胞器環(huán)狀DNA的超螺旋

三級(jí)結(jié)構(gòu)葉綠體中含有環(huán)狀DNA線粒體中含有環(huán)狀DNA細(xì)菌等原核生物質(zhì)粒染色體真核細(xì)胞染色體的DNA念珠狀三級(jí)結(jié)構(gòu)

染色體的基本單位是核小體；核小體由DNA和組蛋白構(gòu)成。組蛋白H2A，H2B，H3和H4各兩分子構(gòu)成組蛋白八聚體，DNA雙螺旋分子纏繞其上1.75圈（146bp）核小體的核心顆粒。核小體的核心顆粒之間由DNA和組蛋白H1連接三、RNA分子的結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)中的戊糖是核糖，堿基中有尿嘧啶，而沒有胸腺嘧啶。大多數(shù)RNA分子是一條單鏈。局部的堿基互補(bǔ)配對(duì)（A—U、C—G），

構(gòu)成雙螺旋雙螺旋部分穩(wěn)定因素也是堿基堆積力

1、tRNA的結(jié)構(gòu)

tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)——三葉草型（四臂四環(huán)）

四環(huán)：二氫尿嘧啶環(huán)（D環(huán)）、反密碼環(huán)、ΤψC環(huán)、可變環(huán)

四臂：二氫尿嘧啶臂（D臂）、反密碼臂、

ΤψC臂、氨基酸臂

tRNA的三葉草型二級(jí)結(jié)構(gòu)123葉子反密碼子環(huán)

反密碼子載運(yùn)氨基酸臂4包含有3’-末端和5’-末端3’-末端是CCA攜帶氨基酸與氨基酸接受區(qū)相對(duì)環(huán)：7個(gè)核苷酸殘基臂：5bp環(huán)正中的3個(gè)核苷酸殘基

稱為反密碼子。氨基酸接受區(qū)反密碼區(qū)環(huán)：8-12個(gè)核苷酸臂：3-4bp二氫尿嘧啶區(qū)TC區(qū)可變區(qū)tRNA在此環(huán)中含有TC環(huán)：7個(gè)核苷酸臂：5bp變化較大，3-18個(gè)核苷酸

tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)——倒L型

在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，突環(huán)上未配對(duì)的堿基由于整個(gè)分子的扭曲而配成對(duì)目前已知的tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)均為倒L形。2、mRNA的結(jié)構(gòu)

一級(jí)結(jié)構(gòu)：

mRNA分子大小相差很懸殊，從7s到60s不等。真核細(xì)胞mRNA：

單順反子結(jié)構(gòu)（為一條肽鏈編碼）5′端有帽子結(jié)構(gòu)

3′末端是polyA(多聚腺苷酸)尾巴

原核細(xì)胞mRNA：多順反子結(jié)構(gòu)（為多條肽鏈編碼）5′端無帽子結(jié)構(gòu)，3′末端不含polyA(多聚腺苷酸)尾巴

7-甲基鳥苷帽帽子結(jié)構(gòu)能促進(jìn)核蛋白體與mRNA的結(jié)合,加速翻譯起始速度,同時(shí)可以增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性。3’末端多聚A的尾巴。可能與mRNA從核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位及mRNA的穩(wěn)定有關(guān)。與mRNA的半壽期有關(guān)，新合成的mRNA,polyA鏈較長，而衰老的mRNA，polyA鏈縮短不均一核RNA（heterogeneounuclearRNA，hnRNA）：在細(xì)胞核內(nèi)合成的mRNA的初級(jí)產(chǎn)物，經(jīng)過剪接成為成熟的mRNA并移到細(xì)胞質(zhì)。3、rRNA占RNA總量的80％原核生物真核生物核糖體rRNA核糖體rRNA30s70s50s16s5s、23s40s80s50s18s5s、5.8s、28s動(dòng)物細(xì)胞核糖體rRNA有四類：5SrRNA，5.8SrRNA，18SrRNA，28SRNA。許多rRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)及由一級(jí)結(jié)構(gòu)推導(dǎo)出來的二級(jí)結(jié)構(gòu)都已闡明，但是對(duì)許多rRNA的功能迄今仍不十分清楚。許多rRNA形成發(fā)夾形結(jié)構(gòu)第四節(jié)核酸的性質(zhì)

一、一般性質(zhì)：1、兩性電解質(zhì)：通常偏酸2、性狀3、溶解度4、分子性狀5、粘度：DNA溶液展度極大，RNA溶液展度要小的得多。

6、堿解：RNA稀堿條件下降解，而DNA則不被降解7、含磷量——恒定：RNA為9.4%、DNA為9.9%8、顏色反應(yīng)1)D核糖+濃HCl+苔黑酚（甲基間苯二酚）共熱產(chǎn)生綠色，測定RNA。2)D—2—脫氧核糖+酸+二苯胺共熱產(chǎn)生藍(lán)紫色，測定DNA。二、核酸的紫外吸收

在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨(dú)特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)。天然核酸紫外吸收值小于各成分核苷酸光吸收之和，是在有規(guī)律的雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基緊密地堆積在一起造成的。判斷核酸樣品的樣品的純度純的DNA樣品：OD260/OD280=1.8純的RNA樣品：OD260/OD280=2.0樣品中含有雜蛋白及苯酚,OD260/OD280比值即明顯降低。三、核酸的變性、復(fù)性及雜交

1、變性（denaturation）：高溫、酸、堿及某些變性劑（如尿素）能破壞核酸中的氫鍵，使有規(guī)律的螺旋型結(jié)構(gòu)變成單鏈的、無規(guī)律的“線團(tuán)”，此作用稱為核酸的變性。

蛋白質(zhì)：高級(jí)結(jié)構(gòu)————>松散肽鏈變性————>（變性不涉及肽鍵，）核酸：螺旋結(jié)構(gòu)————>無規(guī)則線團(tuán)變性————>（變性不涉及磷酸二脂鍵的斷裂）2、變性重要特征——判斷變性的標(biāo)志

紫外吸收值急劇增加——增色效應(yīng)或高色效應(yīng)

粘度下降，比旋下降生物活性喪失

能夠引起核酸變性的因素很多。溫度升高、酸堿度改變、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的變性。3、DNA的熱變性

DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將引起DNA變性的溫度稱為“熔點(diǎn)”或“解鏈溫度”，用Tm表示，在此溫度可得到紫外吸收最大變化值的一半。（雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)）。Tm值是DNA的一個(gè)特征常數(shù)

影響Tm值的因素:DNA的Tm值與分子中的G和C的含量有關(guān)。（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44

介質(zhì)的離子強(qiáng)度

溶液的pH值變性劑4、復(fù)性DNA熱變性在一定條件下是可逆的，DNA水溶液加熱變性時(shí)，雙螺旋的兩條鏈分開，如果將溶液緩慢冷卻，則兩條鏈可能發(fā)生特異的重組而恢復(fù)成雙螺旋，這種現(xiàn)象稱“退火”（annealing），這種雙螺旋的重組過程稱復(fù)性。

高溫變性緩慢冷卻熱復(fù)性急速冷卻復(fù)性失敗核酸的復(fù)性紫外吸收值A(chǔ)260降低（減色效應(yīng)）復(fù)性的特征比旋上升，粘度上升生物活性部分恢復(fù)溫度要逐步降低變性DNA濃度高影響復(fù)性因素DNA片斷大則復(fù)性就慢具有很多重復(fù)序列的DNA

復(fù)性也快

5、核酸的分子雜交(hybridization)定義：不同核酸單鏈通過堿基配對(duì)形成雜交分子的過程

分子雜交不僅可以在不同來源的DNA片段中形成，甚至可以在DNA和RNA之間也可以形成DNA—RNA雜交分子。探針（probe）

具有特異順序的單鏈DNA或RNA分子，用放射性同位素或免疫方法進(jìn)行標(biāo)記后,可以用雜交方法測定樣品中與其互補(bǔ)的順序。雜交方式

a）直接用probe與菌落組織細(xì)胞中的核酸雜交，未改變核酸位置——原位雜交技術(shù)。b）將核酸直接粘在膜上，再與探針雜交——狹縫印跡雜交。硝酸纖維素膜作支持物進(jìn)行的雜交。Southern印跡（Southernbiotting）

DNA經(jīng)酶解和電泳分離后，將其片段→硝酸纖維素濾膜或尼龍膜，用同位素標(biāo)記的DNA（或RNN）探針與之雜交，通過放射自顯影，以探測目的片段的存在及片段長度。其它雜交技術(shù)1）

將RNA變性后轉(zhuǎn)移到纖維素膜上再進(jìn)行雜交——Northern印跡法。Northernblotting2）

抗原抗體結(jié)合分析蛋白質(zhì)——Western印跡法（biotting）分子雜交的運(yùn)用：測定基因拷貝數(shù)、基因定位、基因圖譜的構(gòu)建。第五節(jié)核酸研究技術(shù)一、核酸的提取1、DNA的提取1）鹽溶液溶解DNA－核蛋白，苯酚氯仿去除蛋白質(zhì)2）SDS裂解細(xì)胞，蛋白酶除蛋白，RNase除RNA3）氯化銫密度梯度離心要求：低溫、防止污染、防止機(jī)械損傷、雜質(zhì)除盡2、RNA提取玻璃器皿高溫?zé)荆芰掀髅蟾邷販缇?，其余的用DEPC（0.1％焦碳酸二乙酯）處理提取過程加入強(qiáng)RNA變性劑－－－－RNase無處不在RNA常用提取方法異硫氫酸胍/苯酚－氯仿（小量制備）胍鹽/氯化銫密度梯度離心（大量制備）二、瓊脂糖凝膠電泳以瓊脂糖為支持介質(zhì)的電泳染色：EB制備容易，分離范圍廣，尤其適于分子量較大的樣品，但分離率比PAGE低影響遷移速率的因素核酸分子量大?。ǚ幢龋┠z濃度（反比）DNA構(gòu)象：超螺旋>開環(huán)>線型電壓（正比）三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)原理：模擬DNA體內(nèi)復(fù)制，通過熱變性－退火－延伸的不斷循環(huán)，使模板序列得到指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。步驟：變性、退火、延伸體系：引物、模板、DNA聚合酶、dNTP、Mg離子、礦物油、緩沖體系四、核酸序列測定測序目的：獲得未知序列確定重組DNA方向與結(jié)構(gòu)對(duì)突變進(jìn)行定位和鑒定第六節(jié)DNA和基因組織

一、遺傳的信息流（中心法則）

DNA是遺傳信息的載體，通過自我復(fù)制把遺傳信息從親代傳遞到子代。在后代的個(gè)體發(fā)育中，遺傳信息從DNA轉(zhuǎn)錄到RNA分子上，然后翻譯成特定的蛋白質(zhì)。通過蛋白質(zhì)執(zhí)行生物功能，表現(xiàn)出親代相似的遺傳特征。

在RNA病毒中，RNA是遺傳信息的攜帶者，RNA可以復(fù)制，并同時(shí)做為mRNA起作用。指導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)的合成。RNA分子還可以通過反轉(zhuǎn)錄（或逆轉(zhuǎn)錄）將遺傳信息傳遞給DNA分子，這就是所謂的中心法則。二、基因（gene)1、基因是遺傳的最小功能單位，是DNA上的功能片段2、基因包含二類：結(jié)構(gòu)基因：為多肽或RNA編碼的基因調(diào)節(jié)基因：只有調(diào)節(jié)功能的片段。

基因組（genome）：某生物體（完整單倍體）所含全部遺傳物質(zhì)的總和包括：核基因組（擬核/核DNA）及核外（質(zhì)粒/質(zhì)體