微生物的實驗室培養(yǎng)(用)

微生物的實驗室培養(yǎng)(用)第1頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四

到目前為止，幾十項Nobel生理學和醫(yī)學獎，化學獎都與微生物學有關(guān)第2頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四你知道微生物可分為哪幾類嗎？第3頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四微生物的類群原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌單細胞的動植物如草履蟲、單細胞藻類等微生物包含了除植物界和動物界以外的所有生物無細胞結(jié)構(gòu)真核細胞細菌、藍藻原核細胞特點：結(jié)構(gòu)都相當簡單,個體多數(shù)十分微小.通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結(jié)構(gòu).第4頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四課題1微生物的實驗室培養(yǎng)專題2:微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用第5頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四一、培養(yǎng)基作用、種類二、無菌技術(shù)三、制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基四、純化大腸桿菌本課題主要內(nèi)容第6頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四一、培養(yǎng)基

人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配置出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)稱培養(yǎng)基1什么是培養(yǎng)基？培養(yǎng)基的基本成分有哪些？第7頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四一、培養(yǎng)基

一般的培養(yǎng)基均需要碳源、氮源、無機鹽和水以及特殊營養(yǎng)（即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶）等。同時培養(yǎng)基要滿足微生物對氧氣及pH值的要求。培養(yǎng)基的基本成分第8頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四

液體培養(yǎng)基：（一般用錐形瓶盛裝）

固體培養(yǎng)基：（一般用試管或培養(yǎng)皿盛裝，在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再添加瓊脂。）

2培養(yǎng)基可分為哪些種類？（1）、按物理狀態(tài)分：（2）、按功能分：選擇培養(yǎng)基：加入某種化學物質(zhì)，從眾多微生物中分離出所需微生物鑒別培養(yǎng)基：加入某種試劑，鑒別不同種類的微生物第9頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長第10頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四部分實驗試劑牛肉膏蛋白胨瓊脂第11頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四固體培養(yǎng)基：菌落第12頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四什么是菌落？

由單個細菌或幾個細菌在適宜固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長繁殖到一定程度，形成肉眼可見的子細胞群落。第13頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四不加氮源的無氮培養(yǎng)基:不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基:

你能舉幾種選擇培養(yǎng)基嗎？分離固氮菌

分離自養(yǎng)型微生物唯一碳源為尿素的培養(yǎng)基分解尿素的細菌第14頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四1什么是無菌技術(shù)？

無菌技術(shù)泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法技術(shù)。

獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵，無菌技術(shù)就是防止雜菌污染的操作技術(shù)。二、無菌技術(shù)第15頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四3、什么是消毒？常用的消毒方法有哪些？

2、你知道無菌技術(shù)有哪些種類？

使用較為溫和的方法（酒精、紫外線）來殺死部分對人體有害的微生物。（不包括芽孢和孢子）消毒和滅菌煮沸消毒、巴氏消毒法、化學藥劑消毒。第16頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四4、什么是滅菌？滅菌的方法有哪些？使用較為強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌第17頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四5、微生物實驗時要對哪些進行消毒？哪些進行滅菌？如何避免雜菌污染？

對實驗操作的空間、操作者的衣著和手進行清潔消毒；將培養(yǎng)皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌。接種的過程要在酒精燈火焰附近進行；避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍物品接觸。第18頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基三、實驗操作1、制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的步驟有哪些？計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板第19頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四1.計算：物質(zhì)牛肉膏蛋白胨NaCl瓊脂水重量5g10g5g20g定溶至1000mL

準確稱取各種成分，注意事項：牛肉膏要放在稱量紙上稱量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后及時蓋上瓶蓋。2.稱量第20頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四3.溶化：先將牛肉膏連同稱量紙一起放入燒杯，加少量水，加熱至牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒取出稱量紙。加入蛋白胨和氯化鈉，用玻璃棒攪拌使之溶解，再加入瓊脂，攪拌，待溶解后，加自來水定溶至100mL。

4.滅菌：將配制好的培養(yǎng)基放到錐形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮紙），連同培養(yǎng)皿（3～5套，用幾層報紙包好）一起放到高壓鍋內(nèi)滅菌。

5.倒平板：待培養(yǎng)基冷卻到50OC左右時倒平板。第21頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四

5.倒平板的具體操作過程是怎樣的？第22頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四6、請思考并回答倒平板操作的討論？

（1）.培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到50OC時倒平板。用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？

用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛剛不燙手時即可開始倒平板。

（2）.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。第23頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。第24頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。第25頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四（二）純化大腸桿菌

微生物接種方法常見的有平板劃線法和稀釋涂布平板法。1、微生物接種方法有哪些？第26頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四

通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。

在數(shù)次劃線后可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體稱菌落。2.什么是平板劃線法？平板劃線法如何操作？第27頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四平板劃線法獲取的微生物經(jīng)恒溫培養(yǎng)后的生長情況第28頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四平板劃線法獲取的微生物經(jīng)恒溫培養(yǎng)后的生長情況第29頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四

（1）、為什么在操作的第一步以及劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)？

第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后仍然要灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。3、平板劃線法的討論第30頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四（2）.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？

以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。（3）.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。第31頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四4.什么是稀釋涂布平板法？

將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進行培養(yǎng)。

在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。

稀釋涂布平板法操作過程分兩個步驟，即系列稀釋操作和涂布平板操作。第32頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四6、系列稀釋操作是怎樣操作的？101102103104105106

(1)將分別盛有9mL水的試管滅菌并編號。

(2)用移液管吸取1mL培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中，輕壓橡皮頭，吹吸三次使之充分混勻。

(3)從101倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入第三支試管中，重復步驟2，直至到第六支試管。第33頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四7、涂布平板操作是怎樣進行的？(1)將涂布器浸在盛有70％的酒精的燒杯中。(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培養(yǎng)基表面。(3)將沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷卻8～10s。(4)用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。第34頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四稀釋涂布平板法獲取的菌落第35頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四固體培養(yǎng)基：菌落菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)第36頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四細菌的菌落有鞭毛細菌：無鞭毛細菌：有莢膜細菌：無莢膜細菌：菌落光滑,S型菌落粗糙,R型大而扁平，邊緣波狀或鋸齒狀。較小較厚，邊緣整齊。第37頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四思考：涂布平板操作討論

涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進行無菌操作？

應(yīng)從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。

將接種后和未接種（作為對照組）的培養(yǎng)基均放到370C的恒溫箱中，培養(yǎng)12～24h后進行觀察并記錄結(jié)果。第38頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？

未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。

2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似嗎？

如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。四、結(jié)果分析與評價第39頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四3.培養(yǎng)12h和24h后，觀察到的實驗結(jié)果相同嗎？如果不同，請分析產(chǎn)生差異的原因？

培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同。隨著時間的延長、菌落的不斷生長，使菌落不斷增大。4.如果在培養(yǎng)基上觀察到不同形態(tài)的菌落，請分析其可能的原因。

無菌操作未達到要求：可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底；可能是接種時發(fā)生了污染；也可能是在培養(yǎng)的過程中受到了污染。第40頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四

1.試管低溫臨時保藏

將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成菌落后，置于4OC的冰箱中保存（每隔3～6個月要重新接種培養(yǎng)后再保存）。

2.甘油管長期保藏

在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高壓滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，充分混合后，置于－20OC的冷凍箱中保存。五、課題延伸---菌種的保藏第41頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四芽孢:

有些細菌（多為桿菌）在一定條件下，細胞質(zhì)高度濃縮脫水所形成的一種抗逆性很強的球形或橢圓形的休眠體。

孢子:

細菌、原生動物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的生殖細胞。能直接發(fā)育成新個體.第42頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四消毒的方法：1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學藥劑消毒法:用75%酒精進行皮膚消毒;氯氣消毒水源第43