第一章蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能

高級生物化學(xué)黃劍現(xiàn)在是1頁\一共有66頁\編輯于星期四第一章蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能

蛋白質(zhì)譯自Albuminoid，該詞來自拉丁文Albumina（蛋白）。1838年，德國化學(xué)家Mulder建議采用Protein一詞，立即得到瑞典著名化學(xué)家Berzelius的支持，逐漸被學(xué)術(shù)界普遍采用，該詞源自希臘文προτο（proteios），意為最原始、最基本、最重要的?？梢?，蛋白質(zhì)自發(fā)現(xiàn)后一直受到化學(xué)家和生物學(xué)家的重視。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是活細(xì)胞中含量最豐富、功能最復(fù)雜的生物大分子，是各種生物功能主要的體現(xiàn)者。近代生物化學(xué)及分子生物學(xué)研究表明，蛋白質(zhì)是由20種左右的α-氨基酸通過肽鍵相互連接而成的一類具有特定的空間構(gòu)象和生物學(xué)活性的高分子有機(jī)化合物。它廣泛存在于生物界，是塑造一切組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)必不可少的組成成分，是生命的支柱；每種蛋白質(zhì)在實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)協(xié)調(diào)一致的活動中扮演著各自特定的角色，如參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的建造，起支持和保護(hù)作用。生命的最基本特征是能夠進(jìn)行新陳代謝，新陳代謝所包括的一切化學(xué)反應(yīng)都是在生物催化劑——酶的作用下完成的；幾乎所有的酶都是蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在是2頁\一共有66頁\編輯于星期四

蛋白質(zhì)是以核酸為模板合成的，是基因表達(dá)的主要產(chǎn)物，因此人們將核酸稱為“遺傳大分子”，而把蛋白質(zhì)稱為“功能大分子”。近50年來，以核酸-蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系為中心，逐漸形成了分子生物學(xué)，成為帶領(lǐng)生命科學(xué)進(jìn)入新時代的龍頭。蛋白質(zhì)是20種天然氨基酸縮合成的大分子，分子量從10kDa至數(shù)百kDa，有著極其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。1952年丹麥生物化學(xué)家Linderstrom-Lang提出蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)概念，把蛋白質(zhì)研究納入正軌。

現(xiàn)在是3頁\一共有66頁\編輯于星期四

越來越多的證據(jù)雄辯地表明：蛋白質(zhì)的功能與其特殊的結(jié)構(gòu)有著十分密切的內(nèi)在聯(lián)系，結(jié)構(gòu)是特定功能的內(nèi)在依據(jù)，功能則是特定結(jié)構(gòu)的外在表現(xiàn)。

因此，闡明蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系是現(xiàn)代生物化學(xué)的基本命題，是揭示生命運(yùn)動規(guī)律的必由之路，應(yīng)當(dāng)受到所有生命科學(xué)工作者的關(guān)注?，F(xiàn)在是4頁\一共有66頁\編輯于星期四1蛋白質(zhì)的基本組成單位——氨基酸

氨基酸(aminoacid)是一類分子中含有氨基的羧酸，廣泛分布于生物界。目前從各種不同的生物體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸已有250多種，其中有20種是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的基本成分，可稱為蛋白質(zhì)氨基酸；更多的氨基酸則以游離形式存在，不參與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成，稱為非蛋白質(zhì)氨基酸。本節(jié)將以蛋白質(zhì)氨基酸為中心，對它們的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行分析和討論。

1819年，法國化學(xué)家布拉孔諾(H·Braconnot)把纖維素放在酸里加熱，成功地把纖維素水解為葡萄糖，從而知道纖維素是由許許多多的葡萄糖“手拉手”組成的，因此他想，能不能像研究纖維素那樣來研究蛋白質(zhì)的組成呢?首先他把明膠放在酸里加熱，結(jié)果從酸水解液中分離到一種分子量比蛋白質(zhì)小得多的含氮化合物，后來取名為甘氨酸；他又用同樣方法從肌肉水解液中提取出另一種含氮化合物，因它的結(jié)構(gòu)中含氨基和羧基，故取名為氨基酸?，F(xiàn)在是5頁\一共有66頁\編輯于星期四1.1氨基酸的分子結(jié)構(gòu)

1.1.1蛋白質(zhì)氨基酸

在蛋白質(zhì)水解液中分離出來的氨基酸有20種，它們都屬α-氨基酸，除脯氨酸外，在與羧基相連的α-碳原子上都有1個氨基。其分子結(jié)構(gòu)的通式表示如下現(xiàn)在是6頁\一共有66頁\編輯于星期四現(xiàn)在是7頁\一共有66頁\編輯于星期四現(xiàn)在是8頁\一共有66頁\編輯于星期四

脯氨酸與一般的α-氨基酸不同，它沒有自由的α-氨基，是一種α-亞氨基酸，可以看作是α-氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)(-CH2CH2CH3)取代了自身氨基上的一個氫原子而形成的雜環(huán)結(jié)構(gòu)。脯氨酸的分子結(jié)構(gòu)表示如下：α-氨基酸脯氨酸現(xiàn)在是9頁\一共有66頁\編輯于星期四

天然的α-氨基酸除甘氨酸外，α-碳原子均為不對稱碳原子。有的α-氨基酸可能含有兩個或兩個以上的不對稱碳原子，因此它們都有旋光性，分為D-型和L-型兩種異構(gòu)體。對這一類氨基酸的立體化學(xué)研究證明，所有帶α-氨基的碳原子都具有相同的構(gòu)型，而且這些構(gòu)型和L-(-)甘油醛相同(見下圖)。因此，這些氨基酸均屬L-α-氨基酸，這是蛋白質(zhì)氨基酸分子結(jié)構(gòu)的共同特征。現(xiàn)在是10頁\一共有66頁\編輯于星期四

根據(jù)20種蛋白質(zhì)氨基酸分子結(jié)構(gòu)的這種特點(diǎn)，可按R基團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，將其分為脂肪族、芳香族和雜環(huán)族氨基酸三類。脂肪族氨基酸:有甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨、谷氨酸、賴氨酸及精氨酸；芳香族氨基酸:有苯丙氨酸及酪氨酸；雜環(huán)族氨基酸:有色氨酸、組氨酸及脯氨酸?，F(xiàn)在是11頁\一共有66頁\編輯于星期四脂肪族氨基酸雜環(huán)氨基酸芳香族氨基酸現(xiàn)在是12頁\一共有66頁\編輯于星期四

氨基酸的R基團(tuán)的結(jié)構(gòu)不同，使各種氨基酸具有不同的性質(zhì)。實(shí)際上，蛋白質(zhì)的許多性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能等在很大程度上與氨基酸的R基團(tuán)密切相關(guān)。根據(jù)20種氨基酸R基團(tuán)的極性和解離性質(zhì)，可將它們分為以下4組：

(1)非極性R基團(tuán)氨基酸：該組氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸及脯氨酸等8種。它們的側(cè)鏈均為非極性基團(tuán)，呈現(xiàn)疏水性現(xiàn)在是13頁\一共有66頁\編輯于星期四非極性R基團(tuán)氨基酸：側(cè)鏈基團(tuán)均為非極性基團(tuán)，呈現(xiàn)疏水性?，F(xiàn)在是14頁\一共有66頁\編輯于星期四（2）不解離的極性R基團(tuán)氨基酸這一組包括絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺及甘氨酸等7種。它們的側(cè)鏈中含有不解離的極性基團(tuán)，能與水形成氫鍵。因此比非極性R基團(tuán)氨基酸易溶于水。

現(xiàn)在是15頁\一共有66頁\編輯于星期四

(3)荷正電R基團(tuán)氨基酸共有3種。其中賴氨酸除α-氨基外，在烴鏈ε位上還有一個氨基；精氨酸含有一個胍基；組氨酸有一個弱堿性的咪唑基。這一組氨基酸的R基團(tuán)在pH7溶液中，可質(zhì)子化而使分子帶正電荷。因此，通常將這3種氨基酸稱為堿性氨基酸?，F(xiàn)在是16頁\一共有66頁\編輯于星期四(4)荷負(fù)電R基團(tuán)氨基酸該組氨基酸有2種，即谷氨酸和天冬氨酸。它們都含有兩個羧基，即除α-羧基外，在側(cè)鏈上還有一個非α-羧基。在pH7環(huán)境中，側(cè)鏈羧基可完全解離，使分子帶負(fù)電荷。因此，這一組氨基酸也稱作酸性氨基酸。

現(xiàn)在是17頁\一共有66頁\編輯于星期四1.1.2非標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸

在蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析時，發(fā)現(xiàn)某些蛋白質(zhì)除了上述20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸外，還含有其他結(jié)構(gòu)形式的氨基酸。這些特殊的氨基酸不具有獨(dú)立的遺傳密碼，它們是在蛋白質(zhì)多肽鏈翻譯過程中，通過相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸殘基的化學(xué)修飾而形成的。它們的存在與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能有著密切的關(guān)系?，F(xiàn)在是18頁\一共有66頁\編輯于星期四

蛋白質(zhì)中所含的非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸最突出的例子是4-羥脯氨酸(4-hydroxyproline)及5-羥賴氨酸(5-hydroxylysine)，它們是纖維狀蛋白質(zhì)——膠原的重要結(jié)構(gòu)成分?，F(xiàn)在是19頁\一共有66頁\編輯于星期四一些與核酸結(jié)合形成復(fù)合物的蛋白質(zhì)，它們的某些氨基酸殘基往往被化學(xué)修飾。例如核糖體蛋白質(zhì)及染色體蛋白質(zhì)(組蛋白)中的氨基酸常被甲基化、乙?；蛄姿峄?，形成相應(yīng)的氨基酸衍生物，如3-甲基組氨酸、O-磷酸絲氨酸、ε-N-乙酰賴氨酸、ω-N-甲基精氨酸、N-乙酰絲氨酸、ω-N,N,N-三甲基賴氨酸、N,N,N一三甲基丙氨酸等。所有原核生物的蛋白質(zhì)在生物合成之初，其N-末端殘基均為N-甲酰甲硫氨酸(N-formylmethionine)，隨后在蛋白質(zhì)修飾成熟過程中被去除。現(xiàn)在是20頁\一共有66頁\編輯于星期四在凝血酶原及某些具有結(jié)合Ca2+功能的蛋白質(zhì)中，含有γ-羧基谷氨酸(γ-carboxyglutamicacid)?，F(xiàn)在是21頁\一共有66頁\編輯于星期四在彈性蛋白中，發(fā)現(xiàn)含有一個結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的氨基酸——鎖鏈素(desmcosine)，它是賴氨酸的衍生物，由4個賴氨酸分子組成吡啶環(huán)，位于分子中央?，F(xiàn)在是22頁\一共有66頁\編輯于星期四在甲狀腺球蛋白中，存在有碘化的酪氨酸殘基，它們可進(jìn)一步修飾轉(zhuǎn)變，并經(jīng)蛋白質(zhì)降解生成甲狀腺素(thyroxine)和三碘甲腺原氨酸(triiodothyryronine)。

現(xiàn)在是23頁\一共有66頁\編輯于星期四1.1.3非蛋白質(zhì)氨基酸（天然氨基酸）

在生物界還存在許多其他的氨基酸，其中多數(shù)以游離形式存在于生物的組織和細(xì)胞中，少數(shù)則與其他有機(jī)化合物結(jié)合，形成具有特定生物學(xué)活性的復(fù)合物。盡管當(dāng)前對這一類氨基酸的生物學(xué)功能尚未完全了解，但對其中部分氨基酸的功能正在被闡明?，F(xiàn)在是24頁\一共有66頁\編輯于星期四

據(jù)目前所知，非蛋白質(zhì)氨基酸的生物學(xué)功能主要表現(xiàn)在以下幾方面：

(1)作為細(xì)胞與細(xì)胞之間信息傳遞的介質(zhì)或參于物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。如γ

-氨基丁酸(-Aminobutyricacid)、甲狀腺素等。

(2)它們是物質(zhì)代謝過程的中間產(chǎn)物或重要代謝物的前體，活潑地參與體內(nèi)各種代謝反應(yīng)。如鳥氨酸(ornithine)、瓜氨酸(citrullirne)、同型半胱氨酸(高半胱氨酸，homocysteine)、S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylnlethionine)、β-丙氨酸等?，F(xiàn)在是25頁\一共有66頁\編輯于星期四(3)具有特異的生理活性，是醫(yī)學(xué)上常用的抗生素或抗代謝藥物。如重氮乙酰絲氨酸(Azaserine)，它由一種鏈絲菌產(chǎn)生或合成，能抑制嘌呤的生物合成，導(dǎo)致染色體畸變。

(4)在不少生物體如細(xì)菌中，廣泛存在一類D型氨基酸，它們是微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分。實(shí)驗(yàn)證明，D型氨基酸的存在，可降低細(xì)菌細(xì)胞壁對肽酶作用的敏感性，保護(hù)菌體不受酶作用的損害?，F(xiàn)在是26頁\一共有66頁\編輯于星期四1.2氨基酸的理化性質(zhì)

1.2.1氨基酸的兩性解離

氨基酸均為無色晶體或粉末狀，每種氨基酸都有自己特有的晶體形狀，可用于鑒定。與相應(yīng)的有機(jī)酸相比，氨基酸的熔點(diǎn)較高，通常大于200oC，如甘氨酸為232oC，而相應(yīng)的乙酸的熔點(diǎn)僅為16.5oC。氨基酸至少含有兩個可解離基團(tuán)，具有可解離的側(cè)鏈基團(tuán)者，則有3個解離基團(tuán)。在某種pH環(huán)境中，氨基酸的羧基可解離釋放出質(zhì)子，具有酸的性質(zhì)；而它的氨基可以接受質(zhì)子，具有堿的性質(zhì)。因此，氨基酸既能與酸也能與堿反應(yīng)，形成鹽，呈現(xiàn)兩性電解質(zhì)的特性?，F(xiàn)在是27頁\一共有66頁\編輯于星期四氨基酸與酸或堿反應(yīng)的過程表示如下：由此可見，在水溶液中，一種氨基酸處在相對酸的條件下，帶正電荷；在相對堿的條件下，帶負(fù)電荷；當(dāng)溶液的pH達(dá)到某一特定值時，該氨基酸則帶有相等的正電荷及負(fù)電荷，形成分子內(nèi)鹽。此時的氨基酸凈電荷等于零，呈現(xiàn)電中性。處于電中性時的氨基酸稱偶極離子(dipolarion)或兼性離子(zwitterion)，此時溶液的pH值稱為等電點(diǎn)(isoelectricpoint，pI)?，F(xiàn)在是28頁\一共有66頁\編輯于星期四pI值是氨基酸的一個特性參數(shù)。氨基酸在溶液中所帶電荷的性質(zhì)決定于該氨基酸的pI值與溶液pH值的關(guān)系。當(dāng)溶液的pH<pI時，氨基酸帶正電荷；當(dāng)溶液的pH>pI時，氨基酸帶負(fù)電荷；當(dāng)溶液的pH=pI時，氨基酸以兼性離子狀態(tài)存在。不同氨基酸因所含可解離基團(tuán)，如氨基和羧基數(shù)目不同及各種基團(tuán)相對解離程度(即解離常數(shù)K值，pK值)不一，其pI值也不相同。如果將不同pI值的各種氨基酸置于同一pH值的溶液中，它們呈現(xiàn)不同的帶電狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)研究中，可借這一性質(zhì)，應(yīng)用離子交換層析或電泳法將不同氨基酸進(jìn)行分離?，F(xiàn)在是29頁\一共有66頁\編輯于星期四1.2.2氨基酸的化學(xué)反應(yīng)

氨基酸分子中的氨基和羧基分別具有胺和羧酸的基本反應(yīng)性質(zhì)。氨基如同伯胺一樣，可以與酰鹵、酸酐、甲醛、亞硝酸等反應(yīng)，形成相應(yīng)的酰胺、亞胺結(jié)構(gòu)或產(chǎn)生氮?dú)?；羧基可以酯化和脫羧等；由于氨基與羧基同在一個分子上，它們相互影響，又呈現(xiàn)一些特殊的反應(yīng)。此外，氨基酸側(cè)鏈的某些功能基團(tuán)，如羧基、酚基、巰基、吲哚基、咪唑基、胍基以及硫甲基等，都可以和多種試劑發(fā)生反應(yīng)。所有這些氨基酸反應(yīng)是人工合成多肽和蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)化學(xué)修飾或是蛋白質(zhì)和氨基酸分析定量的基礎(chǔ)，具有十分重要的實(shí)際應(yīng)用價值。

現(xiàn)在是30頁\一共有66頁\編輯于星期四(1)?；磻?yīng)氨基酸的氨基與酰氯或酸酐在弱堿溶液中發(fā)生反應(yīng)，氨基即被?；?。例如與芐氧甲酰氯(carbobenzyloxychloride，cbz-Cl)反應(yīng)，反應(yīng)式如下：氨基酸氨基中的一個氫原子被芐氧甲?；?cbz)取代，生成cbz-氨基酸。這是化學(xué)合成多肽時一個重要的氨基保護(hù)反應(yīng)。氨基酸的α-氨基被保護(hù)后，其羧基可與二氯亞砜或五氯化磷作用生成酰氯，反應(yīng)式如下：此反應(yīng)可使氨基酸的羧基活化，使之容易與另一氨基酸的氨基結(jié)合，因此常用于多肽化學(xué)合成?，F(xiàn)在是31頁\一共有66頁\編輯于星期四

另一酰化試劑是丹磺酰氯(dansylchloride，DNS-Cl)，它與氨基酸的氨基反應(yīng)生成DNS-氨基酸，反應(yīng)式如下：

反應(yīng)生成的DNS-氨基酸在紫外光下產(chǎn)生強(qiáng)烈的黃色熒光，有很高的靈敏度。因此該反應(yīng)被用于多肽鏈氨基末端氨基酸的標(biāo)記和微量氨基酸的定量測定?，F(xiàn)在是32頁\一共有66頁\編輯于星期四(2)烴基化反應(yīng)

氨基酸氨基的一個氫原子被烴基取代。例如與2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB)反應(yīng)。該反應(yīng)是氨基酸的α-氨基與DNFB在堿性溶液中反應(yīng)，生成黃色的二硝基苯基氨基酸(DNP-氨基酸)。常用于鑒定多肽或蛋白質(zhì)的氨基末端氨基酸（N-端）。反應(yīng)式如下：弱堿性(pH8～9)、暗處、室溫或40℃條件下

現(xiàn)在是33頁\一共有66頁\編輯于星期四

另一個烴基化反應(yīng)是氨基酸的α-氨基與苯異硫氰酸酯(phenylisothiocyanate，PITC)在弱堿性條件下反應(yīng)，形成相應(yīng)的苯氨基硫甲酰(phenylthiocarbamyl，PTC)衍生物。后者在硝基甲烷中與酸作用，環(huán)化生成相應(yīng)的苯乙內(nèi)酰硫脲(phenylthiohydantoin，PTH)衍生物。該反應(yīng)多用于鑒定多肽及蛋白質(zhì)的氨基末端氨基酸，在蛋白質(zhì)及多肽氨基酸序列分析中占有重要地位?，F(xiàn)在是34頁\一共有66頁\編輯于星期四(3)甲醛反應(yīng)

氨基酸與甲醛反應(yīng)生成二羥甲基氨基酸。反應(yīng)中使氨基酸的氨基被封閉，使羧基的酸性增強(qiáng)，可用強(qiáng)堿滴定之。此反應(yīng)是用中和法測定氨基酸含量的依據(jù)，稱甲酸滴定法。

氨基酸既是酸又是堿，但不能直接用酸堿滴定法來測定其含量，因?yàn)樗乃釅A滴定的等當(dāng)點(diǎn)pH過高或過低，沒有適當(dāng)?shù)闹甘緞┛捎?。如氨基酸的?氨基的pK值為9.7左右，完全解離時，pH可達(dá)11或更高。在室溫和pH中性條件下，甲醛與氨基酸的α-氨基結(jié)合，生成羥甲基衍生物(H+一次放出)，從而降低了氨基的堿性。可選擇酚酞指示劑(變色范圍8.2～10)，用氫氧化鈉滴定放出的H+，因?yàn)槊糠懦鲆粋€H+，就相當(dāng)于有一個氨基氮，從氨基氮量可算出氨基酸的量?，F(xiàn)在是35頁\一共有66頁\編輯于星期四(4)茚三酮反應(yīng)茚三酮(ninhyrin)在弱酸性溶液(pH5~7)中與α-氨基酸共熱(80~100oC)，水合茚三酮與氨基酸縮合，經(jīng)脫羧脫水產(chǎn)生亞胺

，再經(jīng)水解得到醛和氨基茚三酮，最后另一分子水合茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物——氨基茚三酮縮合，生成紫紅色產(chǎn)物。

茚三酮反應(yīng)可用來鑒定與定量測定氨基酸，所有的α-氨基酸除脯氨酸外，都可顯紫紅色反應(yīng)。谷氨酰胺和天門冬酰胺與茚三酮的反應(yīng)產(chǎn)生棕紅色化合物?，F(xiàn)在是36頁\一共有66頁\編輯于星期四1.2.3氨基酸的紫外吸收

組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸因?yàn)樗鼈兊膫?cè)鏈基團(tuán)含有苯環(huán)共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，因此在紫外光區(qū)域(220～300nm)均有光吸收。酪氨酸的最大光吸收波長(λmax)在275nm，其摩爾消光系數(shù)ε275=1.4×103；苯丙氨酸的λmax為257nm，ε275=2.0×102；色氨酸的λmax為280nm，ε280=5.6×103。蛋白質(zhì)多數(shù)含有這一類芳香族氨基酸，因此也具有紫外吸收能力，其最大吸收峰位于280nm。利用特定波長的紫外吸收性質(zhì)，可用于蛋白質(zhì)的定量分析。但不同蛋白質(zhì)由于芳香族氨基酸含量不同，它們的摩爾消光系數(shù)不完全相同。因此，根據(jù)蛋白質(zhì)溶液在280nm的吸光度(A280)換算溶液中蛋白質(zhì)濃度，只是一個近似值?，F(xiàn)在是37頁\一共有66頁\編輯于星期四2蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

2.1肽與肽鍵

2.1.1肽鍵與肽單元

許多實(shí)驗(yàn)研究早已證明，蛋白質(zhì)中氨基酸之間連接的基本方式是肽鍵(peptidebond)。肽鍵是由一分子氨基酸的α-羧基與另一分子氨基酸的α-氨基脫去1個分子水，縮合形成的共價鍵，屬一種酰胺鍵。許多α-氨基酸借助肽鍵彼此連接形成的化合物稱為肽(peptide)或肽鏈(peptidechain)。

肽鍵側(cè)鏈肽單元現(xiàn)在是38頁\一共有66頁\編輯于星期四

肽主鏈骨架實(shí)際上是由許多重復(fù)單位，即肽單元借助α-碳原子互相連接而成的。

現(xiàn)在是39頁\一共有66頁\編輯于星期四

肽鍵如同一般的酰胺鍵一樣，由于酰胺氮上的孤對電子與相鄰羰基之間的共振作用，呈現(xiàn)高度穩(wěn)定性。共振發(fā)生在以下兩種形式的肽鍵結(jié)構(gòu)之間：

在肽鍵1中，C-N鍵是單鍵，氮原子上的孤對電子與羰基碳之間沒有電子云重疊，羰基碳是sp2雜化，而酰胺氮是sp3雜化。在肽鍵2中，羰基碳和酰胺氮之間是雙鍵，氮原子帶一正電荷，羰基氧帶一負(fù)電荷，羰基碳和酰胺氮都是sp2雜化，兩者都呈平面，即所有6個原子都處在同一平面上。肽鍵的實(shí)際結(jié)構(gòu)是一個共振雜化體，是介于肽鍵結(jié)構(gòu)1與2之間的平均中間態(tài)?，F(xiàn)在是40頁\一共有66頁\編輯于星期四

由于肽鍵是一個共振雜化體，其C=N的鍵長為0.132nm，介于單鍵(C-N鍵長0.148nm)和雙鍵(C=N鍵長0.127nm)之問。因此C-N鍵具有雙鍵性質(zhì)，C-N鍵中的C及N不易繞鍵旋轉(zhuǎn)，于是使肽單元處于剛性平面簡稱肽鍵平面結(jié)構(gòu)狀態(tài)。肽鍵的平面性質(zhì)在肽鍵折疊成三維構(gòu)象的過程中起著極為重要的作用。

現(xiàn)在是41頁\一共有66頁\編輯于星期四2.1.2肽鏈

肽鏈中的氨基酸，因?yàn)榕c前后相連的氨基酸形成肽鍵，它們每一個分子均少2個氫原子和1個氧原子，故稱為氨基酸殘基(aminoacidresidue)?，F(xiàn)在是42頁\一共有66頁\編輯于星期四

最簡單的肽由兩個氨基酸組成，稱為二肽。含有3個、4個、5個氨基酸的肽，分別稱為三肽、四肽、五肽等。一般把小于10個氨基酸組成的肽稱為寡肽，而大于10個或10個以上氨基酸組成的肽稱為聚肽或多肽。肽的命名是根據(jù)參與其組成的氨基酸殘基來確定的，規(guī)定從肽鏈的－NH2末端氨基酸殘基開始，稱為某氨基酰、某氨基?！嘲被?。例如由丙氨酸殘基、酪氨酸殘基和谷氨酸殘基組成的三肽(Ala—Tyr—Glu)，稱為丙氨酰酪氨酰谷氨酸。在書寫肽鏈結(jié)構(gòu)時，通常把－NH2末端的氨基酸殘基寫在左邊，－COOH末端氨基酸殘基寫在右邊?，F(xiàn)在是43頁\一共有66頁\編輯于星期四

肽鏈結(jié)構(gòu)所首先具有最重要的一個特點(diǎn)是不對稱性，或稱方向性。首先這種不對稱性主要表現(xiàn)在兩方面：一是任何開鏈肽，只有一個游離的α-NH2端，稱氨基末端或N端，位于肽鏈的左端；一個游離的α-COOH端，稱為羧基末端或C端，位于肽鏈的右端；二是肽鏈中氨基酸殘基的排列順序，不同的肽具有不同的氨基酸組成和序列，這是構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)多樣性的基礎(chǔ)。其次，由于組成肽鏈的氨基酸不同，不同的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)具有不同的解離性質(zhì)，故不同的肽也呈現(xiàn)不同的解離行為，在溶液中表現(xiàn)出不同的荷電性質(zhì)。再次是不同的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可直接影響肽鏈在三維空間上的構(gòu)象?，F(xiàn)在是44頁\一共有66頁\編輯于星期四2.1.2天然活性肽

肽鏈?zhǔn)菢?gòu)成蛋白質(zhì)分子的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)肽全是無分支的開鏈多肽。在生物體內(nèi)還有一些游離存在的肽，它們各具有不同的生物學(xué)活性，通常稱為活性肽。如一些肽類激素(催產(chǎn)素、加壓素、抗利尿激素等)、抗生素(短桿菌肽S、放線菌素D、粘菌素E等)、肽類毒素以及其他具有重要生理作用的活性小肽等。現(xiàn)在是45頁\一共有66頁\編輯于星期四

自然界中存在的肽有開鏈?zhǔn)胶铜h(huán)狀結(jié)構(gòu)。在游離存在的活性肽中，有的在結(jié)構(gòu)上與蛋白質(zhì)肽有著顯著區(qū)別。如某些蕈類產(chǎn)生的肽類毒素——α-鵝膏蕈堿(α-amanitill)，是一個環(huán)狀八肽，能抑制真核生物RNA聚合酶活性，從而抑制核糖核酸（RNA）的合成，導(dǎo)致機(jī)體死亡。再如在微生物中常見的環(huán)狀肽短桿菌肽S，對革蘭式陽性細(xì)菌有強(qiáng)大的抑制作用?，F(xiàn)在是46頁\一共有66頁\編輯于星期四

人和其他動物細(xì)胞內(nèi)存在的谷胱甘肽(glutathione)，即γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，分子中的谷氨酸以其γ-羧基與半胱氨酸的α-氨基形成肽鍵，它在細(xì)胞中可參與可逆的氧化還原反應(yīng)?，F(xiàn)在是47頁\一共有66頁\編輯于星期四2.2蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)

由氨基酸首尾共價相連而生成的肽鏈?zhǔn)堑鞍踪|(zhì)分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，所有的蛋白質(zhì)都是在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)造而成的?？梢韵胂螅杀姸鄶?shù)目的氨基酸組成，由各種不同排列的氨基酸順序，而且還將在三維空間上進(jìn)行構(gòu)造，最終形成的蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)是非常復(fù)雜的。要研究和剖析這類大分子化合物的結(jié)構(gòu)

，必須在方法學(xué)和策略上加以合理的設(shè)計(jì)。

長期以來，生物化學(xué)家們一直采用4個不同的結(jié)構(gòu)層次來分析和描述蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，即一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及四級結(jié)構(gòu)。

所謂蛋白質(zhì)分子是指具有完整生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)的最小單位。有的蛋白質(zhì)分子，如肌紅蛋白、溶菌酶、細(xì)胞色素C、核糖核酸酶、羧肽酶A、木瓜蛋白酶等，僅由1條具有三級結(jié)構(gòu)的肽鏈所構(gòu)成；有的蛋白質(zhì)分于，如血紅蛋白、乳酸脫氫酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、磷酸甘油醛脫氫酶等，是由多條具三級結(jié)構(gòu)的肽鏈相互聚合而成，這些蛋白質(zhì)就是屬于四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子?，F(xiàn)在是48頁\一共有66頁\編輯于星期四1952年，丹麥生物化學(xué)家Linderstrom-Lang把蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)劃分為三個不同的組織層次（level,hierarchy）：一級結(jié)構(gòu)（primarystructure）：指多肽鏈中氨基酸殘基的數(shù)目、組成及其排列順序（N-端→C-端），即由共價鍵維系的多肽鏈的二維（線性）結(jié)構(gòu)，不涉及空間排列。二級結(jié)構(gòu)（secondarystructure）：是多肽鏈主鏈（backbone）在氫鍵等次級鍵作用下折疊成的構(gòu)象單元或局部空間結(jié)構(gòu)，未考慮側(cè)鏈的構(gòu)象和整個肽鏈的空間排布。三級結(jié)構(gòu)（tertiarystructure）：則指整個肽鏈的氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)互相作用以及與環(huán)境間的相互作用下形成的三維結(jié)構(gòu)。1958年英國晶體學(xué)家Bernal發(fā)現(xiàn)寡聚蛋白由具有三級結(jié)構(gòu)的亞基在次級鍵作用下結(jié)合而成，遂把寡聚體內(nèi)亞基的空間排列稱為四級結(jié)構(gòu)（quaternarystructure）?，F(xiàn)在是49頁\一共有66頁\編輯于星期四

上述蛋白質(zhì)分子一、二、三、四級結(jié)構(gòu)的概念已被國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會命名委員會正式采納和定義。60年代以后，隨著對蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)知識的積累，又增加了不少新的內(nèi)容。如在三級結(jié)構(gòu)以上又增加了四級結(jié)構(gòu)，在二級和三級結(jié)構(gòu)之間又增加了超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域這兩個結(jié)構(gòu)層次。

1973年Rossman發(fā)現(xiàn)相鄰的二級結(jié)構(gòu)往往形成某種有規(guī)律的、空間上可辯認(rèn)的、更高層次的折疊單元，稱為超二級結(jié)構(gòu)（super-secondarystructure）或折疊單元（foldingunit），主要涉及這些構(gòu)象元件在空間上如何聚集。與此同時，Wetlaufer觀察到蛋白質(zhì)分子中存在相對穩(wěn)定的球狀亞結(jié)構(gòu)，其間由單肽鏈相互連接，命名為結(jié)構(gòu)域（structuraldomain）?，F(xiàn)在是50頁\一共有66頁\編輯于星期四蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)層次：A、一級結(jié)構(gòu)，B、二級結(jié)構(gòu)，C、結(jié)構(gòu)域，D、三級結(jié)構(gòu)，E、四級結(jié)構(gòu)，F(xiàn)、大分子子組合體現(xiàn)在是51頁\一共有66頁\編輯于星期四球狀蛋白分子結(jié)構(gòu)的不同水平圖中A代表組成一級結(jié)構(gòu)的各種氨基酸；S和sS分別代表蛋白質(zhì)中的二級結(jié)構(gòu)和由它們組合成的超二級結(jié)構(gòu)；D/T表示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，如果是單結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，此結(jié)構(gòu)域即蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；同樣，T/α表示由結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)或亞基；Q代表蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)，可以是n個相同亞基α裝配成的同源聚集體，也可以是n個α亞基和m個β亞基（甚至更多種亞基）形成的異源聚集體。現(xiàn)在是52頁\一共有66頁\編輯于星期四

天然蛋白質(zhì)都具有獨(dú)特而穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，即構(gòu)象(conformation)。構(gòu)象是指分子內(nèi)各原子或基團(tuán)之間的相互立體關(guān)系。構(gòu)象的改變是由于單鍵的旋轉(zhuǎn)而產(chǎn)生的，不需有共價鍵的變化(斷裂或形成)，但涉及到氫鍵等次級鍵的改變。1969年國際純化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)規(guī)定在描述蛋白質(zhì)等生物大分子的空間結(jié)構(gòu)時應(yīng)使用構(gòu)象一詞。按照這種劃分，二級結(jié)構(gòu)以上的結(jié)構(gòu)都屬于構(gòu)象的范疇。

構(gòu)型(configturation)，是指在立體異構(gòu)體中，取代基團(tuán)或原子因受某種因素的限制，在空間取不同位置所形成的不同立體結(jié)構(gòu)。構(gòu)型的改變必須有共價鍵的斷裂。如幾何(順反)異構(gòu)體中，取代基團(tuán)因受雙鍵的限制，而有順式和反式兩種構(gòu)型；在光學(xué)異構(gòu)體中，a碳原子上的四個基團(tuán)不同，只可能取兩種不同的空間排布，這兩種不同的空間排布稱為不同的構(gòu)型?，F(xiàn)在是53頁\一共有66頁\編輯于星期四2.2.1蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)(primarystructure)又稱為共價結(jié)構(gòu)、化學(xué)結(jié)構(gòu)。不同的蛋白質(zhì)都具有特定的構(gòu)象，但從一級結(jié)構(gòu)來看，蛋白質(zhì)是由許多的氨基酸按照一定的排列順序，通過肽鍵相互連接起來的多肽鏈結(jié)構(gòu)。1969年，IUPAC曾規(guī)定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是指肽鏈中的氨基酸排列順序和連接方式。它是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，包含了決定蛋白質(zhì)分子所有結(jié)構(gòu)層次構(gòu)象的全部信息。如果蛋白質(zhì)分子中存在二硫鍵，一級結(jié)構(gòu)也包括形成二硫鍵的半胱氨酸殘基的位置。一級結(jié)構(gòu)即氨基酸序列是區(qū)別不同蛋白質(zhì)最基本、最重要的標(biāo)志。一級結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的三維空間構(gòu)象。現(xiàn)在是54頁\一共有66頁\編輯于星期四

胰島素(insulin)是由人和其他哺乳動物胰島β-細(xì)胞合成釋放的蛋白質(zhì)激素，具有促進(jìn)葡萄糖氧化利用和轉(zhuǎn)變成糖原儲存，降低血葡萄糖濃度的作用，是調(diào)節(jié)糖、脂類和蛋白質(zhì)代謝的重要激素。胰島素分子的一級結(jié)構(gòu)由A鏈和B鏈兩條肽鏈組成，其中A鏈含21個氨基酸，N端為甘氨酸、C端為天冬酰胺；B鏈含30個氨基酸，N端為苯丙氨酸，C端為丙氨酸。整個分子含有3個二硫鍵，其中1個位于A鏈內(nèi)，2個位于A、B鏈之間。現(xiàn)在是55頁\一共有66頁\編輯于星期四

多肽鏈可取3種不同的一級結(jié)構(gòu)形式，即無支鏈開鏈多肽、分支開鏈多肽和環(huán)狀多肽。某些天然多肽種含有蛋白質(zhì)中不常見的或不存在的氨基酸，如β-氨基酸、D型氨基酸等，這些結(jié)構(gòu)上的變化可能起保護(hù)這些多肽免受蛋白水解酶降解的作用。

現(xiàn)在是56頁\一共有66頁\編輯于星期四2.2.2蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)即多肽鏈中氨基酸殘基的排列順序（N-端→C-端）是由基因編碼的，是蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，因此一級結(jié)構(gòu)的測定成為十分重要的基礎(chǔ)研究。

1945～1955年，英國生物化學(xué)家Sanger率先完成了人胰島素的序列測定，從而揭開了蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)研究的序幕。

1950年，瑞典科學(xué)家Edman發(fā)明了以他的名字命名的N-端測定法，并與Begg在1967年發(fā)明了序列儀，極大地推動了蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定工作。盡管如此，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定仍是一項(xiàng)相當(dāng)耗費(fèi)時間和資金的工作。因而測序方法和技術(shù)的改進(jìn)與創(chuàng)新勢在必行?！，F(xiàn)在是57頁\一共有66頁\編輯于星期四一級結(jié)構(gòu)測定的基本方法有如下幾種：1、獲取一定量純的蛋白質(zhì)樣品，且分子量已知：將一部分樣品完全水解，確定該蛋白中的氨基酸種類、數(shù)目和每種氨基酸的含量。

2、進(jìn)行末端分析確定該種蛋白質(zhì)的肽鏈數(shù)目，N-端和C-端各是什么氨基酸。

(1)N-末端分析①2,4-二硝基氟苯（FDNB）法②Edman降解法③5-二甲氨基萘-1-磺酰氯法（丹磺酰氯法，DNS）

(2)C-末端分析

①肼解法（NH2NH2）②羧肽酶法(Carboxypeptidasemethod，CPE法)

現(xiàn)在是58頁\一共有66頁\編輯于星期四

3、肽鏈的拆分經(jīng)末端分析，若該種蛋白質(zhì)有兩條以上的肽鏈組成時應(yīng)將其拆分開。如果肽鏈之間通過非共價鍵連接，可使用一切使蛋白質(zhì)變性的試劑。如果肽鏈之間通過共價鍵相連(主要是二硫鍵)，可采用過甲酸氧化或巰基乙醇還原的方法。

4、肽鏈中氨基酸排列順序的確定一般使用片段重疊法。一些專一性的蛋白水解酶或化學(xué)試劑，能使蛋白質(zhì)的多肽鏈在特定的部位斷裂，產(chǎn)生一些大小不同的重疊片段，分離純化這些肽段，測定每一個肽段的氨基酸順序，根據(jù)這些重疊的片段，推斷出完整肽鏈的氨基酸排列順序。

現(xiàn)在是59頁\一共有66頁\編輯于星期四常用的斷裂多肽鏈的方法有以下幾個：①溴化氰(CNBr)裂解法：它專一性水解甲硫氨酸的羧基形成的肽鍵。溴化氰水解的結(jié)果產(chǎn)生以高絲氨酸內(nèi)酯結(jié)尾的肽，高絲氨酸內(nèi)酯是甲硫氨酸轉(zhuǎn)變來的。②胰蛋白酶水解法：胰蛋白酶專一性水解賴氨酸和精氨酸的羧基形成的肽鍵。但是，如果賴氨酸和精氨酸的羧基與脯氨酸相連，則該酶不能作用?，F(xiàn)在是60頁\一共有66頁\編輯于星期四常用的斷裂多肽鏈的方法有以下幾個：③胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶)水解法：它專一性水解疏水性氨基酸，主要是酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的羧基形成的肽鍵。若與它們的羧基相連的氨基酸為脯氨酸，該酶不能水解。④胃蛋白酶水解法：它要求斷裂鍵兩側(cè)的氨基酸都是疏水性的氨基酸。⑤金黃色葡萄球菌蛋白酶(谷氨酸蛋白酶)水解法：它專一性水解谷氨酸和天門冬氨酸的羧基形成的肽鍵。⑥梭狀芽孢桿菌蛋白酶(精氨酸蛋白酶)水解法：它能水解精氨酸的羧基形成的肽鍵。現(xiàn)在是61頁\一共有66頁\編輯于星期四

5、分離純化部分降解的肽片段分析每一片段的氨基酸組成和排列順序。

6、確定二硫鍵的位置。

7、根據(jù)重疊肽的氨基酸順序