第三章動(dòng)物細(xì)胞工程制藥

第一節(jié)概述

細(xì)胞工程：以細(xì)胞為單位，按人們的意志，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)，有目的的進(jìn)行精心設(shè)計(jì)、精心操作，使細(xì)胞的某些遺傳特性發(fā)生改變，從而達(dá)到改良或產(chǎn)生新品種的目的，以及使細(xì)胞增加或重新獲得產(chǎn)生某種特定產(chǎn)物的能力，從而在離體條件下進(jìn)行大量培養(yǎng)、增殖，并提取對(duì)人類有用的產(chǎn)品的一門科學(xué)?，F(xiàn)在是1頁\一共有99頁\編輯于星期四細(xì)胞工程是一門應(yīng)用科學(xué)和工程技術(shù)，具體包括：

真核細(xì)胞的基因重組、導(dǎo)入、擴(kuò)增和表達(dá)的理論和技術(shù)

細(xì)胞融合的理論和技術(shù)

細(xì)胞器特別是細(xì)胞核抑制的理論和技術(shù)

染色體改造的理論和技術(shù)

轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的理論和技術(shù)

細(xì)胞大量培養(yǎng)的理論和技術(shù)

有關(guān)產(chǎn)物提取純化的理論和技術(shù)現(xiàn)在是2頁\一共有99頁\編輯于星期四第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特性

離體培養(yǎng)的細(xì)胞可分為兩類：貼壁依賴型細(xì)胞和貼壁非依賴型細(xì)胞，前者可簡(jiǎn)稱為貼壁細(xì)胞，后者簡(jiǎn)稱為懸浮細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞高度分化。一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)現(xiàn)在是3頁\一共有99頁\編輯于星期四1.貼壁細(xì)胞

貼壁細(xì)胞必須有可以貼附的支持物表面，細(xì)胞依靠自身分泌的或者培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長(zhǎng)、增殖?，F(xiàn)在是4頁\一共有99頁\編輯于星期四貼壁細(xì)胞在表面生長(zhǎng)后一般形成兩種形態(tài)——纖維樣細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞。纖維樣細(xì)胞：主要來自中胚層組織的細(xì)胞（成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞）上皮樣細(xì)胞主要外胚層和內(nèi)胚層的組織細(xì)胞（皮膚細(xì)胞、腸管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞等）現(xiàn)在是5頁\一共有99頁\編輯于星期四2.懸浮細(xì)胞

懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)不依賴支持物表面，可以在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)（血液中的淋巴細(xì)胞、Namalwacell）3.兼性貼壁細(xì)胞

既可以貼附于支持物表面生長(zhǎng)，在一定的條件下，也可以在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)良好地生長(zhǎng)?，F(xiàn)在是6頁\一共有99頁\編輯于星期四二、動(dòng)物細(xì)胞的分化組成和代謝1.動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成

水、無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)、糖、脂類和核酸組成。

細(xì)胞中水占絕大多數(shù)，占細(xì)胞鮮重的85%-95%，無機(jī)鹽占1.5%，蛋白質(zhì)占7%-10%，脂類占1%-2%，其他物質(zhì)占1.5%?，F(xiàn)在是7頁\一共有99頁\編輯于星期四2.動(dòng)物細(xì)胞的代謝

糖、脂、蛋白質(zhì)等有機(jī)物大分子的代謝一般都可以分成三個(gè)降解階段：①生物大分子降解為小分子；②小分子物質(zhì)進(jìn)一步代謝轉(zhuǎn)化為三個(gè)主要的中間產(chǎn)物——乙酰輔酶A、α-酮戊二酸和草酰乙酸；③三種中間產(chǎn)物進(jìn)入TCA循環(huán)，為動(dòng)物的生命活動(dòng)供能?，F(xiàn)在是8頁\一共有99頁\編輯于星期四

在氧氣供應(yīng)不足或者劇烈運(yùn)動(dòng)造成的局部缺氧時(shí)，動(dòng)物細(xì)胞可以進(jìn)行無氧呼吸——糖酵解供能。

在動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，供能物質(zhì)主要是葡萄糖和谷氨酰胺?，F(xiàn)在是9頁\一共有99頁\編輯于星期四三、動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)1.細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng)同細(xì)菌、酵母比較不同種屬、同種屬不同組織比較2.細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象（密度依賴抑制）二倍體特有?，F(xiàn)在是10頁\一共有99頁\編輯于星期四3.正常細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的細(xì)胞從離體培養(yǎng)開始，我們稱之為原代培養(yǎng)，隨后細(xì)胞經(jīng)過傳代后，即成為有限細(xì)胞系。

細(xì)胞經(jīng)過一些人為的或自然的因素轉(zhuǎn)化為異倍體后，細(xì)胞就可轉(zhuǎn)變?yōu)闊o限細(xì)胞系，或稱連續(xù)細(xì)胞系。這種細(xì)胞的壽命是無限的，適合工業(yè)化生產(chǎn)的需要。有癌變的特點(diǎn)，但并不是癌細(xì)胞；癌細(xì)胞可以通過無限增殖成為無限細(xì)胞系?，F(xiàn)在是11頁\一共有99頁\編輯于星期四4.動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境敏感動(dòng)物細(xì)胞有膜無壁。5.動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求高

至少12種必需的氨基酸、8種以上的維生素、必要的無機(jī)鹽和微量元素、作為碳源的葡萄糖，還需要多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子和貼壁因子才能生長(zhǎng)。

不同的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求也會(huì)有所不同?，F(xiàn)在是12頁\一共有99頁\編輯于星期四6.動(dòng)物細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同動(dòng)物蛋白合成場(chǎng)所：游離核糖體和糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的核糖體。游離核糖體：細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)蛋白；糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合核糖體：分泌蛋白和膜中整合蛋白，修飾后成為糖蛋白。細(xì)菌：無糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)?，F(xiàn)在是13頁\一共有99頁\編輯于星期四利用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞生產(chǎn)藥品優(yōu)勢(shì)：①蛋白多分泌到細(xì)胞外，易于收集和純化；②具有完善的翻譯后修飾系統(tǒng)，產(chǎn)物更接近天然，適用于臨床。利用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞生產(chǎn)藥品缺點(diǎn)：

培養(yǎng)條件苛刻，成本高，產(chǎn)量低?，F(xiàn)在是14頁\一共有99頁\編輯于星期四第三節(jié)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求

不是所有的動(dòng)物細(xì)胞都可以用于生產(chǎn)人用的藥品。原代細(xì)胞→二倍體細(xì)胞→異倍體細(xì)胞

現(xiàn)在基本上已經(jīng)取消了生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞必須用傳代細(xì)胞的限制，但是對(duì)最終產(chǎn)品中的DNA含量做了嚴(yán)格的要求?，F(xiàn)在是15頁\一共有99頁\編輯于星期四二、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得

生產(chǎn)中的動(dòng)物細(xì)胞有：原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞系、無限傳代細(xì)胞系和利用上述3種細(xì)胞進(jìn)行融合和重組的工程細(xì)胞系。1.原代細(xì)胞直接取自動(dòng)物組織、器官?，F(xiàn)在是16頁\一共有99頁\編輯于星期四2.二倍體細(xì)胞系

原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆，從多種細(xì)胞成分的組織中挑選并純化出具有某些特征的細(xì)胞株，這類細(xì)胞仍然是二倍體核型，具有貼壁依賴和接觸抑制特性，無致瘤性，一般從動(dòng)物胚胎組織中獲取?，F(xiàn)在是17頁\一共有99頁\編輯于星期四3.轉(zhuǎn)化細(xì)胞系異倍體細(xì)胞，沒有正常細(xì)胞的特點(diǎn)，可以無限增殖。自發(fā)形成：嚙齒動(dòng)物。人工轉(zhuǎn)化：病毒或化學(xué)試劑?，F(xiàn)在是18頁\一共有99頁\編輯于星期四4.融合細(xì)胞系

細(xì)胞融合是指兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞合并成一個(gè)細(xì)胞的過程。誘導(dǎo)仙臺(tái)病毒和聚乙二醇（PEG）高壓電場(chǎng)的電融合現(xiàn)在是19頁\一共有99頁\編輯于星期四（1）仙臺(tái)病毒融合法①病毒加入兩種細(xì)胞后，4℃條件下，病毒附著在兩種細(xì)胞的細(xì)胞膜上，使兩種細(xì)胞互相凝聚。②在37℃條件下，病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)，細(xì)胞膜受到破壞；③兩個(gè)細(xì)胞的連接部位穿通，周邊連接部修復(fù)。④細(xì)胞融合。少用（感染困難、融合慢、去病毒困難）現(xiàn)在是20頁\一共有99頁\編輯于星期四（2）聚乙二醇融合法產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的制備。（3）電融合法

利用電場(chǎng)進(jìn)行人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合，是利用細(xì)胞在短時(shí)間的電場(chǎng)作用下，細(xì)胞膜發(fā)生可逆性的電擊穿，而使相鄰的細(xì)胞的細(xì)胞膜相互發(fā)生繼發(fā)性融合。操作簡(jiǎn)便、無化學(xué)毒性、對(duì)細(xì)胞損傷小、融合同步和融合率高，可在顯微鏡下直接觀察融合情況?，F(xiàn)在是21頁\一共有99頁\編輯于星期四5.重組工程細(xì)胞系利用基因工程技術(shù)手段重組的各種細(xì)胞系。三、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選1.真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建載體病毒載體質(zhì)粒載體腺病毒桿狀病毒現(xiàn)在是22頁\一共有99頁\編輯于星期四桿狀病毒作為載體的優(yōu)點(diǎn)：（1）桿狀病毒基因組是雙鏈DNA，容易進(jìn)行重組；（2）可插入較大片段的外源表達(dá)基因，插入7-8kb外源基因而不影響正常病毒粒子的形成；（3）多角體蛋白和病毒粒子的形成無直接關(guān)系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染能力的病毒粒子；（4）多角體蛋白基因有強(qiáng)啟動(dòng)子，蛋白表達(dá)量較高；（5）多角體是一個(gè)明顯的標(biāo)記物，可以直接用顯微鏡觀察，易于篩選陽性克??；（6）如果是家蠶桿狀病毒作載體，可以直接在家蠶體內(nèi)進(jìn)行外源基因表達(dá)?，F(xiàn)在是23頁\一共有99頁\編輯于星期四2.基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選磷酸鈣沉淀法和電穿孔法。

磷酸鈣沉淀法是將溶解的DNA加在Na2HPO4溶液內(nèi)，再逐漸加入CaCl2溶液，當(dāng)二者形成磷酸鈣沉淀時(shí)，DNA被包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀物，當(dāng)該沉淀與細(xì)胞表面接觸時(shí)，則通過細(xì)胞吞噬作用而將DNA導(dǎo)入其中?，F(xiàn)在是24頁\一共有99頁\編輯于星期四

篩選已經(jīng)整合外源基因的工程細(xì)胞主要依靠構(gòu)建的載體內(nèi)的選擇標(biāo)記來進(jìn)行，篩選出的細(xì)胞要進(jìn)行克隆和亞克隆使其純化，并利用其自身的擴(kuò)增系統(tǒng)，不斷增加拷貝數(shù)，從而獲得高效表達(dá)的穩(wěn)定的工程細(xì)胞株?，F(xiàn)在是25頁\一共有99頁\編輯于星期四四、常用生產(chǎn)用的細(xì)胞特性BHK-21細(xì)胞：從生長(zhǎng)1天的幼鼠腎臟分離的經(jīng)13次克隆的成纖維樣細(xì)胞，核型2n=44，DMEM培養(yǎng)基添加7%牛血清培養(yǎng)，常被用于增殖病毒和制備疫苗，現(xiàn)也被用于工程細(xì)胞的構(gòu)建。C127細(xì)胞：來自RⅢ小鼠腫瘤細(xì)胞，適用于攜帶有牛乳頭瘤病毒的載體的轉(zhuǎn)染。現(xiàn)在是26頁\一共有99頁\編輯于星期四CHO-K1細(xì)胞：從鼠卵巢中分離的上皮樣細(xì)胞，核型2n=20~22，用DMEM培養(yǎng)基加0.1mmol/L次黃嘌呤和0.01mmol/L胸苷、10%小牛血清，并需額外添加脯氨酸。COS細(xì)胞：通過利用復(fù)制起點(diǎn)缺失的SV40病毒基因組DNA轉(zhuǎn)化非洲猴腎細(xì)胞CV-1獲得，是廣泛應(yīng)用的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)?，F(xiàn)在是27頁\一共有99頁\編輯于星期四MDCK細(xì)胞：從成年西班牙狗的腎臟分離的貼壁依賴型上皮樣細(xì)胞，能進(jìn)行多種病毒的增殖，常被用來生產(chǎn)獸用疫苗。MRC-5細(xì)胞：從14周男胎肺組織獲得的成纖維樣二倍體細(xì)胞，核型2n=46，BME培養(yǎng)基加10%小牛血清培養(yǎng)。現(xiàn)在是28頁\一共有99頁\編輯于星期四Namalwa細(xì)胞：從肯尼亞患有Burkitt淋巴瘤的患者體內(nèi)獲取后構(gòu)建的一株人的類淋巴母細(xì)胞，該細(xì)胞是完全分化的B淋巴細(xì)胞，有2.8%的高倍體率，常用培養(yǎng)基為RPMI1640，需添加7%胎牛血清培養(yǎng)，外源蛋白表達(dá)水平很高。Sf-9細(xì)胞：從秋黏蟲的蛹卵組織中分離出親代細(xì)胞后克隆形成，對(duì)苜蓿尺蠖核型多角體蛋白病毒和其他的桿狀病毒高度敏感，利用Grace培養(yǎng)基添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液及10%胎牛血清培養(yǎng)?，F(xiàn)在是29頁\一共有99頁\編輯于星期四Vero細(xì)胞：從正常的成年非洲猴腎中分離的貼壁依賴性成纖維細(xì)胞，核型2n=60，高倍體率1.7%，利用199培養(yǎng)基添加5%太牛血清培養(yǎng)，可支持多種病毒的增殖并制成疫苗。WI-38細(xì)胞：從女性高加索人的正常胚肺組織中獲得成纖維樣二倍體細(xì)胞，核型2n=46，利用BME培養(yǎng)基添加10%小牛血清培養(yǎng)?，F(xiàn)在是30頁\一共有99頁\編輯于星期四鼠骨髓瘤細(xì)胞：具有很輕增殖能力的可以無限培養(yǎng)的細(xì)胞。分泌量大、容易轉(zhuǎn)染、易生長(zhǎng)、可以在無血清培養(yǎng)基中高密度懸浮培養(yǎng)，而且能對(duì)蛋白進(jìn)行糖基化修飾，表達(dá)機(jī)制明確。SP2/0-Ag14細(xì)胞：從有抗羊紅細(xì)胞活性的BALB/c小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8融合后形成的SP2/HL-Ag再亞克隆后分離獲得，常用DMEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清培養(yǎng)，廣泛的用于單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的制備和抗體的生產(chǎn)?，F(xiàn)在是31頁\一共有99頁\編輯于星期四五、細(xì)胞庫的建立

用于生產(chǎn)的工程細(xì)胞必需建立兩個(gè)細(xì)胞庫：原始細(xì)胞庫（MCB)和生產(chǎn)用細(xì)胞庫（MWCB）（工作細(xì)胞庫,WCB）。

MCB的細(xì)胞應(yīng)該是單一來源的均質(zhì)的細(xì)胞，二倍體細(xì)胞要盡量是群體倍增水平低的細(xì)胞?，F(xiàn)在是32頁\一共有99頁\編輯于星期四MCB細(xì)胞檔案：

（1）該細(xì)胞的歷史——來源、動(dòng)物年齡、性別、細(xì)胞分離的方法和所用的培養(yǎng)材料等。

（2）細(xì)胞的特性——形態(tài)、生長(zhǎng)的特性、種源特性、重組細(xì)胞的載體構(gòu)建資料、基因拷貝數(shù)、表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)和產(chǎn)量及穩(wěn)定性等。

（3）對(duì)各種有害因子檢查的結(jié)果——細(xì)菌、真菌、支原體和各種病毒，包括發(fā)轉(zhuǎn)錄病毒?，F(xiàn)在是33頁\一共有99頁\編輯于星期四

WCB中的細(xì)胞應(yīng)該是從某個(gè)MCB的單一來源或者多個(gè)多個(gè)安瓿瓶融合在一起的，然后培養(yǎng)擴(kuò)增到一定數(shù)量后，再分裝貯存形成細(xì)胞庫。

WCB中的細(xì)胞也要建檔案，并且要進(jìn)行無菌性和無細(xì)胞交叉污染的檢查?，F(xiàn)在是34頁\一共有99頁\編輯于星期四第四節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基保證細(xì)胞體外培養(yǎng)成功的基本條件：1.所有和細(xì)胞接觸的設(shè)備、器材和溶液，必須保證無菌，避免細(xì)胞外微生物的污染；2.營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)必須充足，絕對(duì)不能有有害物質(zhì)，避免即使是極其微量的有害物質(zhì)的滲入；3.保證適量的氧氣供應(yīng)；4.在培養(yǎng)過程中，隨時(shí)除去細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害產(chǎn)物；5.保證適宜細(xì)胞生長(zhǎng)的良好的外界環(huán)境；6.及時(shí)分種，保持適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度。現(xiàn)在是35頁\一共有99頁\編輯于星期四細(xì)胞培養(yǎng)的無菌操作二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱

現(xiàn)在是36頁\一共有99頁\編輯于星期四一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件1.器材的清洗和消毒

細(xì)胞培養(yǎng)成功與否的重要因素之一就是培養(yǎng)細(xì)胞所用的器材和用具是否能做到徹底清洗和消毒。通過清洗和消毒去除影響細(xì)胞生長(zhǎng)的有害物質(zhì)，防止外來微生物的污染?，F(xiàn)在是37頁\一共有99頁\編輯于星期四（1）器材的清洗

一般來說，器材的清洗主要有浸泡、刷洗、泡酸和沖洗四個(gè)步驟，確保器材上沒有油跡和其他殘留物質(zhì)。

浸泡有利于蛋白質(zhì)和殘留細(xì)胞等污垢的清除，常用3%磷酸三鈉溶液，也可用一些常見的洗液；現(xiàn)在是38頁\一共有99頁\編輯于星期四

泡酸所用的酸有強(qiáng)酸和弱酸。

新的玻璃儀器第一次使用前一定要用弱酸（稀鹽酸）泡過，去除玻璃中的游離堿；

強(qiáng)酸常用重鉻酸鉀和硫酸配制，利用其強(qiáng)氧化性去除儀器上不易洗脫的污漬。

清洗干凈的玻璃儀器要用清水反復(fù)沖洗干凈，后分別用蒸餾水和去離子水沖洗?，F(xiàn)在是39頁\一共有99頁\編輯于星期四（2）器材的消毒滅菌

常用的滅菌方式有物理消毒和化學(xué)消毒。物理方法有紫外線、干熱、濕熱和過濾等；化學(xué)方法即使用抗生素和各種化學(xué)消毒劑?，F(xiàn)在是40頁\一共有99頁\編輯于星期四

抗生素的使用要慎重，長(zhǎng)期對(duì)同細(xì)菌、病毒使用同一種抗生素，很容易產(chǎn)生抗藥性，而且抗藥性很難消除，另外，抗生素的使用會(huì)影響到所培養(yǎng)細(xì)胞的生理代謝和形態(tài)。在實(shí)際生產(chǎn)中，為了避免污染、提高效益，抗生素經(jīng)常使用，但是規(guī)定不得使用青霉素和β-內(nèi)酰胺類抗生素（革蘭氏陽性細(xì)菌）。實(shí)驗(yàn)室中常加的是青霉素和鏈霉素，簡(jiǎn)稱雙抗，防細(xì)胞污染。污染最多的是霉菌和真菌?，F(xiàn)在是41頁\一共有99頁\編輯于星期四培養(yǎng)器皿多孔板細(xì)胞培養(yǎng)瓶現(xiàn)在是42頁\一共有99頁\編輯于星期四2.細(xì)胞培養(yǎng)的水質(zhì)

水質(zhì)的好壞直接影響細(xì)胞培養(yǎng)的成功與否。細(xì)胞培養(yǎng)的水必須進(jìn)行特殊的處理，保證水中沒有有毒元素、過量的金屬離子和微生物污染。

蒸餾、離子交換、電滲析、反滲透、中空纖維過濾等單獨(dú)使用或配合使用，制備純水，一般要求金屬離子含量很低，電阻值在18M以上。動(dòng)物細(xì)胞制藥用水，要求去熱源?，F(xiàn)在是43頁\一共有99頁\編輯于星期四3.pH細(xì)胞量大時(shí)比細(xì)胞量小時(shí)對(duì)pH的耐受性強(qiáng)。

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最適pH為7.2-7.4，低于6.8或者高于7.6都會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生明顯的不利影響。緩沖液系統(tǒng)，減少乳酸的影響。緩沖液：當(dāng)往某些溶液中加入一定量的酸和堿時(shí)，有阻礙溶液pH變化的作用，稱為緩沖作用，這樣的溶液叫做緩沖溶液。弱酸及其鹽的混合溶液（如HAc與NaAc），弱堿及其鹽的混合溶液（如NH3·H2O與NH4Cl）等都是緩沖溶液?，F(xiàn)在是44頁\一共有99頁\編輯于星期四4.滲透壓

動(dòng)物細(xì)胞有膜無壁，對(duì)外界環(huán)境滲透壓的高低波動(dòng)更敏感。原代細(xì)胞對(duì)滲透壓的耐受性要比傳代細(xì)胞差。

細(xì)胞培養(yǎng)理想的滲透壓為290-300

mOsm/kg。mOsm：毫滲摩爾，1升溶液中所含的非電解質(zhì)或電解質(zhì)的毫摩爾數(shù)。調(diào)整溶液的滲透壓常采用添加或減少NaCl的辦法?，F(xiàn)在是45頁\一共有99頁\編輯于星期四5.溫度

溫度過高導(dǎo)致細(xì)胞退變甚至死亡，

溫度過低會(huì)降低細(xì)胞的代謝和生長(zhǎng)速度，影響產(chǎn)物的含量。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最佳培養(yǎng)溫度是37±0.5℃

昆蟲細(xì)胞的最佳培養(yǎng)溫度為25-28℃退變：因理化或生物作用而逐步老化變質(zhì)直至損毀的過程?，F(xiàn)在是46頁\一共有99頁\編輯于星期四6.空氣

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中必須供給足量的氧氣，保證細(xì)胞進(jìn)行能量代謝，減少培養(yǎng)過程中因?yàn)榧?xì)胞糖酵解產(chǎn)生的乳酸積累，避免細(xì)胞的退變和死亡。

在利用方瓶或者轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)時(shí)，只要保證培養(yǎng)液的體積不超過培養(yǎng)瓶溶劑的30%，就可以利用瓶?jī)?nèi)空氣保證培養(yǎng)所需而不需要額外通氣；在采用生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)時(shí)，則必須專門通氣，補(bǔ)充氧量?，F(xiàn)在是47頁\一共有99頁\編輯于星期四微生物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法的比較性質(zhì)微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞大小1-10μm10-100μm代謝調(diào)節(jié)方式內(nèi)部?jī)?nèi)部和激素營(yíng)養(yǎng)要求寬松，可利用多種底物苛刻生長(zhǎng)速率倍增時(shí)間一般為0.5-2h倍增時(shí)間一般為12-60h機(jī)械強(qiáng)度較好很差，缺乏保護(hù)性細(xì)胞壁環(huán)境適應(yīng)好差現(xiàn)在是48頁\一共有99頁\編輯于星期四微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞PH控制添加酸、堿CO2-HCO3緩沖液攪拌速度速度快、范圍廣較慢溶氧控制改變攪拌速度、通氣量、進(jìn)氣氧濃度改變進(jìn)入氣體的氧濃度培養(yǎng)基滅菌方法高溫蒸煮過濾培養(yǎng)時(shí)間幾小時(shí)—幾天幾天—3、4周對(duì)水純度的要求較低很高現(xiàn)在是49頁\一共有99頁\編輯于星期四二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類和組成

培養(yǎng)基成分復(fù)雜而且昂貴是動(dòng)物細(xì)胞工程制藥成本較高的一個(gè)主要原因。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基主要分為三類：

天然培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基?，F(xiàn)在是50頁\一共有99頁\編輯于星期四1、天然培養(yǎng)基

在細(xì)胞培養(yǎng)的早期階段使用的培養(yǎng)基，主要為來自天然的材料如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。

天然培養(yǎng)基材料成分復(fù)雜、組分不穩(wěn)定，來源有限，不適于大量培養(yǎng)和生產(chǎn)的需要?，F(xiàn)在是51頁\一共有99頁\編輯于星期四2.合成培養(yǎng)基

采用明確的化學(xué)試劑配制成的培養(yǎng)基。第一個(gè)合成培養(yǎng)基：199培養(yǎng)基。

合成培養(yǎng)基成分明確、組分穩(wěn)定，可以大量生產(chǎn)。

現(xiàn)階段合成培養(yǎng)基種類繁多，在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中被普遍使用?，F(xiàn)在是52頁\一共有99頁\編輯于星期四合成培養(yǎng)基組分：（1）氨基酸。

不同培養(yǎng)基中氨基酸的種類和含量各不相同，至少含有細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中所必需的而又不能依靠自身合成的12種必須氨基酸，另外多有谷氨酰胺作為細(xì)胞生長(zhǎng)的碳源和能源物質(zhì)。動(dòng)物細(xì)胞只能利用L型氨基酸，在配制時(shí)必須采用L型同分異構(gòu)體。（2） 維生素

用于維持細(xì)胞生命活動(dòng)的低分子活性物質(zhì)，常作為輔酶或輔基。細(xì)胞自身基本不能合成維生素，必須從培養(yǎng)基中攝取?，F(xiàn)在是53頁\一共有99頁\編輯于星期四（3）糖類，細(xì)胞生長(zhǎng)的碳源和能源物質(zhì)。（4） 無機(jī)鹽保持細(xì)胞的滲透壓，緩沖pH的變化，并積極參與細(xì)胞的代謝（NaCl、KCl等），CuSO4、ZnSO4等可以促進(jìn)細(xì)胞的代謝。（5）其他成分，在培養(yǎng)基中加入一些核酸的前體及氧化還原劑?，F(xiàn)在是54頁\一共有99頁\編輯于星期四市售動(dòng)物細(xì)胞合成培養(yǎng)基現(xiàn)在是55頁\一共有99頁\編輯于星期四

為了給細(xì)胞培養(yǎng)以更大的方便，以便于其增殖或貼附生長(zhǎng)，常在培養(yǎng)基中加入一定量的動(dòng)物血清，常用的是添加5%~10%的小牛血清，雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)中，對(duì)血清的要求更高，常用10~20%的胎牛血清。培養(yǎng)用血清現(xiàn)在是56頁\一共有99頁\編輯于星期四

添加血清培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的作用：①為細(xì)胞生長(zhǎng)提供有利其增殖的各種生長(zhǎng)因子和激素。②提供有利于細(xì)胞貼壁所需要的貼附因子和伸展因子。③提供細(xì)胞識(shí)別金屬、激素、維生素和脂質(zhì)的結(jié)合蛋白。④提供細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的脂肪酸和微量元素。⑤提供良好的pH緩沖系統(tǒng)?，F(xiàn)在是57頁\一共有99頁\編輯于星期四3.無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)：

①提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了由于血清批之間差異的影響；

②減少了由血清帶來的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險(xiǎn)；

③供應(yīng)充足、穩(wěn)定；

④細(xì)胞產(chǎn)品容易純化；

⑤避免了血清中某些因素對(duì)有些細(xì)胞的毒性；

⑥減少了血清中蛋白對(duì)某些生物測(cè)定的干擾，便于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析?，F(xiàn)在是58頁\一共有99頁\編輯于星期四

無血清培養(yǎng)基是在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入一些添加劑，添加的物質(zhì)主要有：①激素和生長(zhǎng)因子；②結(jié)合蛋白；③貼附和伸展因子；④其他有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的因子和元素。德國(guó)PAN牌CHO細(xì)胞無血清培養(yǎng)液PANSERIN604S，培養(yǎng)基不含不明確的溶解產(chǎn)物和任何植物水解產(chǎn)物,不含任何蛋白質(zhì)。沒有任何動(dòng)物、人類蛋白或多肽，為表達(dá)產(chǎn)品的下游處理工作提供極大方便。現(xiàn)在是59頁\一共有99頁\編輯于星期四第五節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法一、細(xì)胞培養(yǎng)的分類培養(yǎng)細(xì)胞的種類：原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)培養(yǎng)基的不同：液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)培養(yǎng)容器的方式：靜止培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、中空纖維培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)現(xiàn)在是60頁\一共有99頁\編輯于星期四二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)1細(xì)胞分離①離心分離法：主要用于從含有細(xì)胞體液如血液、羊水、胸腹水中分離細(xì)胞，一般用800-1000r/min離心5~10min②消化分離：用消化液消化取自生物體的組織塊，使組織松散成細(xì)胞懸液，再經(jīng)洗滌、分離得到所需細(xì)胞。

常用的消化液有胰蛋白酶、EDTA、或胰酶-EDTA聯(lián)用及胰酶-檸檬酸鹽?，F(xiàn)在是61頁\一共有99頁\編輯于星期四2.

細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞分離制備成懸液準(zhǔn)備接種時(shí)需進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：①自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)：電子細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)器，計(jì)數(shù)速度快，但無法分辨死、活細(xì)胞。全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀現(xiàn)在是62頁\一共有99頁\編輯于星期四②血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)：計(jì)數(shù)時(shí)細(xì)胞染色，可分辨死、活細(xì)胞。

將細(xì)胞懸液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專缓笪∩倭康南♂尯髴乙旱斡谟?jì)數(shù)板上蓋玻片一端，讓液體填滿蓋玻片下方間隙，不要產(chǎn)生氣泡，稍靜置幾分鐘在顯微鏡下觀察并計(jì)算四角大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞壓線只計(jì)算壓上線和右線的，然后利用公式：

每毫升細(xì)胞數(shù)=4大格中細(xì)胞總數(shù)/（4×10000×稀釋倍數(shù)）

上面公式中分母乘以10000是因?yàn)樗慕敲恳粋€(gè)大格面積為1mm2，蓋玻片和計(jì)數(shù)板之間的間隙為0.1mm，所以每一個(gè)大格內(nèi)容積為0.1mm3，要計(jì)算1ml懸液的細(xì)胞數(shù)就要擴(kuò)大10000倍。

可以通過染色的方法區(qū)別細(xì)胞的死活。常用的染色劑有：①臺(tái)盼藍(lán)，是一種細(xì)胞活性染料，常用于檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性。還常用于檢測(cè)細(xì)胞是否存活?；罴?xì)胞不會(huì)被染成藍(lán)色，而死細(xì)胞會(huì)被染成淡藍(lán)色。②苯胺黑，色較臺(tái)盼藍(lán)深，有毒?，F(xiàn)在是63頁\一共有99頁\編輯于星期四血細(xì)胞計(jì)數(shù)板現(xiàn)在是64頁\一共有99頁\編輯于星期四③結(jié)晶紫染色細(xì)胞核計(jì)數(shù)

結(jié)晶紫染色液具有低滲作用，使細(xì)胞分散解離和破碎，將細(xì)胞核染成藍(lán)色，鏡下對(duì)細(xì)胞核計(jì)數(shù)。

微載體細(xì)胞培養(yǎng)中使用。④MTT染色計(jì)數(shù)

細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶將MTT（四甲基偶唑鹽，藍(lán)色）轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙Y(jié)晶（甲臜）?，F(xiàn)在是65頁\一共有99頁\編輯于星期四3細(xì)胞傳代

細(xì)胞生長(zhǎng)至一定時(shí)期時(shí)會(huì)產(chǎn)生接觸抑制現(xiàn)象，不能無限生長(zhǎng)，若細(xì)胞不及時(shí)分種，細(xì)胞就會(huì)死亡、脫落。懸浮細(xì)胞的傳代：加入1倍或幾倍的生長(zhǎng)液，然后分種兩只或多個(gè)培養(yǎng)瓶。貼壁細(xì)胞的傳代：需經(jīng)消化液消化后再分種。現(xiàn)在是66頁\一共有99頁\編輯于星期四（1）要確保需消化的細(xì)胞無污染；（2）加入消化液適量，以搖動(dòng)時(shí)能蓋滿單層細(xì)胞為宜；（3）消化時(shí)間要適量，一般室溫2-5分鐘，細(xì)胞層出現(xiàn)網(wǎng)孔時(shí)即可停止；（4）終止消化要先去掉消化液，再加入含血清的培養(yǎng)基；（5）分種數(shù)取決于細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞特性，一般20萬-30萬個(gè)/ml，每次1傳2或1傳3為宜；（6）已培養(yǎng)過的瓶子可再次使用，但不要超過2-3次；（7）傳代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)必須標(biāo)明傳代次數(shù)；（8）傳代后1-2天更換培養(yǎng)液，3-5天傳代一次。貼壁細(xì)胞分種的主意事項(xiàng)：現(xiàn)在是67頁\一共有99頁\編輯于星期四4.細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇（1）細(xì)胞的凍存

細(xì)胞的凍存常采用液氮低溫凍存，在凍存過程中需加入適量甘油或二甲基亞砜作為保護(hù)劑。

如采用冷凍方法凍存要注意冷凍速度的把握，溫度下降以1℃/min為宜?，F(xiàn)在是68頁\一共有99頁\編輯于星期四細(xì)胞凍存過程中需注意：①凍存的細(xì)胞需處于良好的狀態(tài)；②細(xì)胞密度以1×106~2×106/ml為好；③配置凍存用的培養(yǎng)基要與實(shí)際使用的一致。④凍存管或瓶要注意密封；⑤凍存管標(biāo)簽上標(biāo)明細(xì)胞名稱、編號(hào)、凍存日期，最好在外面再貼一層透明膠布。（2）細(xì)胞的復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇總得要求是快融?，F(xiàn)在是69頁\一共有99頁\編輯于星期四復(fù)蘇細(xì)胞、接種細(xì)胞、保存細(xì)胞現(xiàn)在是70頁\一共有99頁\編輯于星期四第六節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的大量培養(yǎng)的方法和操作一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法1.懸浮培養(yǎng)

讓細(xì)胞自由的懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)增殖，適用于一切種類的非貼壁依賴性細(xì)胞，也適用于兼性貼壁細(xì)胞。

操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)方法均一，傳質(zhì)和傳氧好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，培養(yǎng)出的細(xì)胞密度較低?，F(xiàn)在是71頁\一共有99頁\編輯于星期四2.貼壁培養(yǎng)

讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)方法，適用于一切貼壁依賴性細(xì)胞，也適用于兼性貼壁細(xì)胞。

這種培養(yǎng)方法的優(yōu)缺、點(diǎn)同懸浮培養(yǎng)正好相反?，F(xiàn)在是72頁\一共有99頁\編輯于星期四3.貼壁-懸浮培養(yǎng)（假懸浮培養(yǎng)）

將懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合在一起而成貼壁-懸浮培養(yǎng)。（1） 微載體培養(yǎng)，利用小顆粒載體使貼壁細(xì)胞附著其上培養(yǎng)增殖，而載體體積小、比重輕，在輕度攪拌下就可攜帶附著其上的細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)，充分發(fā)揮懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點(diǎn)，又能提高細(xì)胞密度?，F(xiàn)在是73頁\一共有99頁\編輯于星期四理想的微載體要有如下特征：①載體表面性質(zhì)同細(xì)胞有良好的相容性，適于細(xì)胞的附著、伸展和增殖；②微載體材料無毒性；③微載體材料不與培養(yǎng)基成分發(fā)生化學(xué)變化，也不吸收培養(yǎng)基中養(yǎng)分；④微載體比重要適中；⑤微載體體積勻稱、均一，利于細(xì)胞均勻分布；⑥具有良好的光學(xué)透明性，易于鏡下觀察；⑦微載體基質(zhì)最好為軟性的；⑧可耐120℃高溫；⑨處理后可反復(fù)使用；⑩原料充分，制作簡(jiǎn)便，價(jià)廉?，F(xiàn)在是74頁\一共有99頁\編輯于星期四（2） 包埋和微囊培養(yǎng)，將細(xì)胞包埋或包裹在凝膠載體或微囊內(nèi)培養(yǎng)，包埋的凝膠載體較大，此法又稱為巨載體培養(yǎng)。（3）結(jié)團(tuán)培養(yǎng)，以細(xì)胞本身作為基質(zhì)，使其相互貼附后再用懸浮的方法進(jìn)行培養(yǎng)?，F(xiàn)在是75頁\一共有99頁\編輯于星期四二、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)的操作方式1.分批式培養(yǎng)操作兩種操作方法：

①將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷增長(zhǎng)、產(chǎn)物不斷形成、積累，最后將細(xì)胞和培養(yǎng)基一并取出，結(jié)束培養(yǎng)；

②先將細(xì)胞和培養(yǎng)基加入反應(yīng)器，待細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度后，在反應(yīng)器中加入誘導(dǎo)劑或病毒等，作用一段時(shí)間后，將反應(yīng)物取出?，F(xiàn)在是76頁\一共有99頁\編輯于星期四2.半連續(xù)性培養(yǎng)操作

當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成過程中，每間隔一段時(shí)間，取出部分培養(yǎng)物（條件培養(yǎng)基或附著在載體上），然后補(bǔ)充同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基或載體，繼續(xù)培養(yǎng)?，F(xiàn)在是77頁\一共有99頁\編輯于星期四3.灌流式培養(yǎng)操作

當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將一部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)不斷地補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。優(yōu)點(diǎn)：（1）培養(yǎng)條件穩(wěn)定、營(yíng)養(yǎng)條件好、有害代謝廢物濃度低；（2）極大的提高細(xì)胞密度；（3）產(chǎn)品在培養(yǎng)罐內(nèi)時(shí)間縮短，可及時(shí)低溫保存，提高產(chǎn)品質(zhì)量；（4）培養(yǎng)基比消耗率降低，降低成本?，F(xiàn)在是78頁\一共有99頁\編輯于星期四第七節(jié)動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器

動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器是給動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝提供一個(gè)最優(yōu)化的環(huán)境，從而使其在生長(zhǎng)代謝過程中產(chǎn)生出最大量、最優(yōu)質(zhì)的所需物質(zhì)。理想的動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器應(yīng)該具有如下特征：（1）制造生物反應(yīng)器所需要的一切材料，尤其是與培養(yǎng)基、細(xì)胞直接接觸的材料，對(duì)細(xì)胞必須是無毒性的；（2）生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)必須使之具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能；現(xiàn)在是79頁\一共有99頁\編輯于星期四（3）密封性能良好，可避免一切外來的不需要的微生物的污染；（4）對(duì)培養(yǎng)環(huán)境中多種物理化學(xué)參數(shù)能自動(dòng)檢測(cè)和調(diào)解控制，控制的精確度高，而且能保持環(huán)境質(zhì)量的均一；（5）可長(zhǎng)期連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)，這對(duì)于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器顯得尤為重要（6）容器加工制造時(shí)要求內(nèi)面光滑，無死角，以減少細(xì)胞或微生物的沉積；（7）拆裝、連接和清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修；（8）設(shè)備成本盡可能低。

實(shí)驗(yàn)室規(guī)?！?0L

中試規(guī)?！?0-100L

生產(chǎn)規(guī)?！?00L?，F(xiàn)在是80頁\一共有99頁\編輯于星期四一、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型及基本結(jié)構(gòu)生產(chǎn)中常用的細(xì)胞生物反應(yīng)器有：

攪拌罐式生物反應(yīng)器

氣升式生物反應(yīng)器

中空纖維式生物反應(yīng)器

透析袋或膜式生物反應(yīng)器

固定床或流化床式生物反應(yīng)器等?，F(xiàn)在是81頁\一共有99頁\編輯于星期四1.攪拌罐式生物反應(yīng)器

攪拌罐式生物反應(yīng)器是通過借鑒細(xì)菌發(fā)酵罐得到的動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器，是目前大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的主要生產(chǎn)設(shè)備。

（1）罐體的高徑比一般采用1~1.5：1，利于增大與空氣的接觸面；培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的罐底為圓形，以避免細(xì)胞和載體沉積在周邊；

（2）為防止攪拌產(chǎn)生的切力損傷細(xì)胞，攪拌速度慢，一般在20~100r/min，故多數(shù)傾向于采用較大的傾斜式槳葉攪拌器或船舶推進(jìn)式槳葉攪拌器；

（3）一般采用無氣泡通氣系統(tǒng)，以解決由于氣泡破裂時(shí)產(chǎn)生的作用力力對(duì)細(xì)胞的損傷；

（4）從高密度、長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)以及提高反應(yīng)器的生產(chǎn)效率考慮，反應(yīng)器需要配備有進(jìn)出液體系統(tǒng)，以便進(jìn)行灌流培養(yǎng)，并有使細(xì)胞與培養(yǎng)基分離使細(xì)胞保留在反應(yīng)器內(nèi)的裝置。特點(diǎn)：現(xiàn)在是82頁\一共有99頁\編輯于星期四2.氣升式生物反應(yīng)器

利用氣體通過裝在罐底的噴管進(jìn)入反應(yīng)器的導(dǎo)流管，致使該部液體的密度小于導(dǎo)流管外部的液體密度，而使液體形成循環(huán)流，循環(huán)方式有內(nèi)循環(huán)式和外循環(huán)式?，F(xiàn)在是83頁\一共有99頁\編輯于星期四

溶氧:通過自動(dòng)調(diào)節(jié)進(jìn)入空氣的速率來控制；pH值：可通過在進(jìn)氣中加入二氧化碳或加入氫氧化鈉來控制。

同攪拌式生物反應(yīng)器相比，氣升式生物反應(yīng)器具有剪切力小，混合均一，氧和營(yíng)養(yǎng)的傳遞好，而且由于沒有了機(jī)械攪拌的結(jié)構(gòu)，有利于設(shè)備的密封，降低了造價(jià)，其高徑比一般在10：1左右?，F(xiàn)在是84頁\一共有99頁\編輯于星期四3.中空纖維式生物反應(yīng)器

途較廣，既可培養(yǎng)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞，細(xì)胞的密度最高可達(dá)109/ml數(shù)量級(jí)。如果控制系統(tǒng)不受污染，能長(zhǎng)期運(yùn)轉(zhuǎn)。中空纖維反應(yīng)器示意圖細(xì)胞培養(yǎng)基入口培養(yǎng)基出口空氣與CO2出口空氣與CO2入口

中空纖維式生物反應(yīng)器占地空間小，產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量高，生產(chǎn)成本低；其不足之處在于：①不能重復(fù)使用；②不能耐受高壓滅菌，需用環(huán)氧乙烷或其它消毒劑滅菌；③難以取樣檢測(cè)現(xiàn)在是85頁\一共有99頁\編輯于星期四4.透析袋或膜式生物反應(yīng)器

在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，會(huì)產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，如乳酸和氨等，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的產(chǎn)生會(huì)產(chǎn)生抑制作用，透析袋或膜式反應(yīng)器可將這些有害代謝產(chǎn)物透析或過濾掉，從而使細(xì)胞生長(zhǎng)至更高密度，同時(shí)可根據(jù)需要選用不同相對(duì)分子質(zhì)量的膜，使產(chǎn)物保留在膜內(nèi)或與細(xì)胞分離開?，F(xiàn)在是86頁\一共有99頁\編輯于星期四5.固定床或流化床式生物反應(yīng)器固定床結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、裝填的材料多樣且相對(duì)固定，只要是對(duì)細(xì)胞無毒又有利于細(xì)胞貼附的材料（不銹鋼、玻璃杯、玻璃珠、光面陶瓷、塑料等實(shí)心載體或有孔的陶瓷、玻璃和聚氨基塑料等）皆可利用。

固定床生物反應(yīng)器通常填裝材料體積較大，導(dǎo)致反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧的交換不夠充分而影響生長(zhǎng)和代謝，所以漸減小填充載體，演化為流化床生物反應(yīng)器?，F(xiàn)在是87頁\一共有99頁\編輯于星期四氣體交換氧氣回流收獲營(yíng)養(yǎng)液泵反應(yīng)塔加熱器PH傳感器TDOCO2生產(chǎn)用CF-IMMOTM流化床生物反應(yīng)器示意圖①傳質(zhì)性能很好，并在循環(huán)系統(tǒng)中采用膜氣體交換器，能快速提供給高密度細(xì)胞所需的氧，同時(shí)排除代謝產(chǎn)物；

②反應(yīng)器中的液體流速足以使細(xì)胞微粒懸浮卻不會(huì)損壞脆弱的細(xì)胞，既可用于貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)。③可實(shí)現(xiàn)高密度細(xì)胞培養(yǎng)、使高產(chǎn)量細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間停留在反應(yīng)器中、優(yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成的環(huán)境等細(xì)胞培養(yǎng)的要求?，F(xiàn)在是88頁\一共有99頁\編輯于星期四二、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的檢測(cè)控制系統(tǒng)1、培養(yǎng)過程中需檢測(cè)的物化參數(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)可選擇不同的反應(yīng)器，但培養(yǎng)過程中需檢測(cè)的參數(shù)大致相同。

在線檢測(cè)的參數(shù)：溫度、pH、攪拌速度、溶氧等；

取樣離線檢測(cè)的參數(shù)：如活細(xì)胞數(shù)、氨基酸濃度分析、葡萄糖、乳酸和銨離子的檢測(cè)等；

檢測(cè)后計(jì)算獲得的參數(shù)：如細(xì)胞的群體倍增時(shí)間、細(xì)胞的比增長(zhǎng)率、葡萄糖消耗率、乳酸產(chǎn)率、生物反應(yīng)器生產(chǎn)率等?，F(xiàn)在是89頁\一共有99頁\編輯于星期四2.主要參數(shù)的檢測(cè)和控制方法

在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，溫度、pH、溶氧、轉(zhuǎn)速和進(jìn)出液流量等幾個(gè)參數(shù)最為重要。（1）溫度，常用于檢測(cè)反應(yīng)器溫度的是電阻溫度計(jì)。（2）pH，復(fù)合式參比電極。（3）溶氧，極譜式或電流式覆膜電極。（4）攪拌，人工設(shè)定和調(diào)解控制及電磁感應(yīng)技術(shù)。（5）進(jìn)出液流量，通過對(duì)培養(yǎng)液泵進(jìn)出的速度控制。（6）其他，罐壓、液位、O2和CO2濃度等。

計(jì)算機(jī)控制更加精確和方便?，F(xiàn)在是90頁\一共有99頁\編輯于星期四第八