植物轉基因技術優(yōu)秀課件

第十八章植物轉基因技術

植物轉基因技術：又稱基因重組技術或DNA重組，即將人工分離和修飾過的基因導入植物基因組中，通過導入基因的表達從而引起植物體性狀的可遺傳的修飾。凡是外源DNA導入細胞的過程都可以泛稱為轉化，包含以下內容：

直接轉化；

介導轉化；

直接轉化

是將裸露的DNA直接導入植物細胞的轉化方法。這種裸露的DNA可以是全部或部分染色體，分離的DNA，也可以是基因工程質粒；直接轉化與介導轉化都涉及以下三方面:1、遺傳物質導入植物細胞；2、外源DNA在植物基因組中的穩(wěn)定整合；3、轉基因植株的再生。一、直接轉化一)目的基因的獲得：(1)直接從目的生物(即供體生物)的基因組中用機械(如超聲波)或限制性內切酶切斷后分離出來。(2)通過反轉錄酶作用,以mRNA為模板,經反轉錄成為互補DNA(即cDNA)。二）目的基因的修飾，構成嵌合基因：嵌合基因中必有啟動子（如花椰菜病毒的35s亞基啟動子、19s亞基啟動子），目的基因及終止子。三）嵌入標記基因或報告基因：應用較廣的是GUS基因；綠色熒光蛋白基因?；驑尫ǎ何棡?.2-2.0um的鎢粉或者金粉，用超聲波使外源

DNA液均勻的包裹鎢粉微粒手槍原理射擊。四）直接轉化的方法：電穿孔轉化法：用短時高脈沖電處理可導致細胞膜出現(xiàn)可恢復性孔隙，從而發(fā)生的滲透點3－4nm為外源DNA進入細胞提供通路。

PEG轉化法：

PEG轉化法和PEG誘導原生質體融合方法相似，同樣需要高鈣、高pH條件從而將外源DNA插入原生質體并整合。五）、轉化基因材料的分析與鑒定（1）GUS測定：GUS基因的表達產物是葡糖苷酸酶，它可分解葡糖苷酸，葡糖苷酸被分解后形成藍色產物使植物組織成為藍色。（3）蛋白質雜交技術：蛋白質抗原與其相應的特異抗體相結合。（4）PCR反應：根據已知轉化基因或標記基因順序設計引物，（5）遺傳分析：觀察基因是否可以穩(wěn)定遺傳給下一代。（6）鑒定轉化基因的功能。實例小麥的基因槍轉化1、試驗材料：小麥幼胚（開花后10～12天）2、質粒的制備：轉化所用質粒為pABH9，該質粒插入BADH基因（表達產物是甜菜堿醛脫氫酶，提高植物細胞的調滲能力和耐鹽性）和BAR基因（表達產物是PPT已酰轉移酶，抗除草劑PPT，因此可利用PPT作為轉化物的選擇劑），由玉米啟動子控制，并含有nos中止子。3、幼胚的高滲預培養(yǎng)：4、微彈的制備與基因槍的轟擊（無菌）：5、抗PPT愈傷組織的選擇：白色生長快的為外源質粒轉化的愈傷（見圖）。6、抗PPT再生植株的獲得：（見圖）實例小麥的基因槍轉化7、抗PPT轉化植株的耐鹽性：含鹽0.7％NaCl條件下轉化植株表現(xiàn)較強的耐鹽性。8、轉化植株的壯苗、生根、移栽、傳代。9、轉BADH基因植株的分子檢測：根據已知的BADH結構基因設計引物用PCR法鑒定外源BADH基因是否整合到小麥基因組中。也可以進一步用Southern雜交驗證。實例小麥的基因槍轉化農桿菌是普遍存在于土壤中的抑制革蘭氏陰性菌，能在自然條件下趨化性的感染大多數的雙子葉植物的受傷部位，并誘導產生冠癭瘤（根瘤農桿菌）和發(fā)狀根（發(fā)根農桿菌）。分別含有Ti質粒和Ri質粒。二、農桿菌介導轉化（二）、Ti質粒：

Ti質粒的大小約200kb左右，為雙鏈環(huán)狀DNA分子。含有T-DNA區(qū)、毒性區(qū)、質粒復制起點、質粒結合轉移位點和冠癭堿分解位點.

其中以T-DNA區(qū)和毒性區(qū)（vir-region）在植物轉化中最為重要。T-DNA區(qū)：能夠轉移整合入植物受體基因組，并能在植物細胞中表達，從而導致冠癭瘤發(fā)生。Vir區(qū)：由多個毒性基因組成，其編碼蛋白對T-DNA的轉移和整合必不可少。T-DNA從農桿菌的Ti質粒轉移到植物細胞中，接著T-DNA整合到細胞核基因組中進行表達，對宿主細胞進行遺傳轉化。在Ti質粒的兩端，T-DNA有兩個幾乎完全相同的25bp的重復。右端重復對于T-DNA的轉移和整合是必需的。T-DNA與植物基因組中的右接口拼接相當精確，右邊接口保留有1-2bp的右端重復，但左邊接口處序列變化較大，有大約100bp以內的序列來自左邊界。2.Ti質粒適用于植物基因轉化的重要特性（或轉化原理）：第一,保留T-DNA兩端的末端序列,然后用一段外源DNA插人或直接取代野生型T-DNA的部分基因組,這段外源DNA仍然可以進入植物細胞,整合到植物的染色體組上（卸甲載體：disarmedvector）。其次，T-DNA的末端序列由25個核苷酸序列組成，它們的左右端序列都具有高度的同源性，并且末端序列對T-DNA轉移到植物細胞內具有重要意義。第三,毒性區(qū)是控制T-DNA轉移的，而且毒性區(qū)對T-DNA的作用既可以以順式(incis)方式進行,又可以以反式(intrans)方式進行。3、Ti質粒上的毒性區(qū)：

Ti質粒的毒性區(qū)約有30kb大小,由7個互補群組成,分別命名為VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirF和VirH。

毒性區(qū)的大多數基因產物都控制T-DNA的轉移。在這個區(qū)域內的突變往往導致土壤農桿菌感染植物的能力下降。Ti質粒衍生的載體系統(tǒng)刪除生長素基因，細胞分裂素基因和冠癭堿基因，使質粒大大減小。插入E.coli復制原點，使Ti質粒能在大腸桿菌中繁殖。3具有選擇型標記基因，便于轉化體的篩選。4含有多克隆位點，便于目的基因的克隆。二）、轉化載體系統(tǒng)：Ti質粒載體系統(tǒng)一般分為兩類：一類叫共整合載體系統(tǒng)；一類叫雙元載體系統(tǒng)。（一）、共整合載體質粒：

X：目的基因BL：左端重復序列BR：左端重復序列vir：毒性區(qū)1.pGV3850系統(tǒng):

這是第一個非致癌的Ti質粒衍生載體,來自胭脂堿型質粒pTiC58Trac,包括25bp末端序列和胭脂堿合成酶基因,T-DNA上的其它基因則為pBR322序列取代。

2.pGV2260系統(tǒng):

來自章魚堿型Ti質粒pTiB63,整個T-DNA序列連同25bp未端序列均被一段pBR322所取代。

X：目的基因BL：左端重復序列BR：左端重復序列vir：毒性區(qū)大腸桿菌pBR衍生物

這種系統(tǒng)需要兩個彼此分離的質粒：

一個是多功能克隆載體質粒，在大腸桿菌和土壤農桿菌中都能夠復制；

另一個是Ti衍生質粒,如pGV2260,可以提供反式的毒性區(qū)功能,以便T－DNA轉移到植物中去。

（二）、雙元載體系統(tǒng)：

X：目的基因BL：左端重復序列BR：左端重復序列vir：毒性區(qū)大腸桿菌pBR衍生物農桿菌轉化過程：對植物表面部位的識別和附著：植物傷口分泌的酚類小分子物質可以誘導Vir基因活化并表達。T-DNA進行復制和轉移：Vir產物能誘導Ti質粒復制產生一新的單鏈T-DNA分子，并使其轉移到植物細胞中。T-DNA的整合：在Vir產物作用下，T-DNA轉入細胞核，并整合到植物染色體上。1原生質體或懸浮細胞與農桿菌共培養(yǎng)2葉盤轉化法其它外植體轉化法：如桃的莖斷胚胎愈傷組織、核桃的體細胞胚、草莓的下胚軸等。4整株感染法。實例：農桿菌介導的水稻基因轉化1、水稻愈傷組織誘導：以水稻成熟胚的盾片愈傷組織為轉基因受體。2、菌株和質粒。3、轉化程序。轉化后的GUS的瞬間表達轉化后3周產生的抗性愈傷組織抗性愈傷的GUS反應再生的轉化植株轉化植株葉片的GUS表達抗性植株后代的抗性檢測第二節(jié)轉基因植物

自1983年人類首次獲得轉基因植物后，已有大量的抗病、抗逆及品質改良的轉基因植物獲得成功，在農業(yè)生產上已經發(fā)揮了重要的作用。在轉基因技術基礎上發(fā)展起來的植物生物反應器展現(xiàn)了誘人的發(fā)展前景。1.植物抗蟲基因工程

我國科學家成功地人工合成和改造的Bt基因轉入花，獲得了高抗棉鈴蟲的轉基因棉花品種和品系。2.植物抗病基因工程中國農業(yè)科學院生物技術研究所成功將抗菌肽基因導入馬鈴薯，獲得抗青枯病的轉基因株系；北京大學克隆了煙草花葉病毒TMV，黃瓜花葉病毒CMV等基因。3.植物抗逆基因工程我國在抗鹽基因工程上已取得了一些進展，先后克隆了脯氨酸合成酶、山菠菜堿脫氫酶、磷酸甘露醇脫氫酶等耐鹽相關基因，并獲得了抗鹽的轉基因植物。4.植物品質改良的基因工程將編碼必需氨基酸的基因轉入馬鈴薯，獲得含高必需氨基酸的馬鈴薯品系；將高賴氨酸基因導入玉米獲得含高賴氨酸的轉基因玉米；獲得儲存時間延長的轉基因番茄。5.植物葉綠體基因工程進行葉綠體遺傳轉化研究，建立了煙草葉綠體遺傳轉化體系。并將一些基因轉入煙草葉綠體。6.