NK殺傷實(shí)驗(yàn)課件

實(shí)驗(yàn)一

腫瘤細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞活力分析儀）原理Vi-CELLXR活力分析儀是視頻成像系統(tǒng)，用于分析培養(yǎng)基或懸浮液中的酵母、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該分析儀可自動(dòng)執(zhí)行目前已被廣泛接受的臺盼藍(lán)染色排除法，適用于多種細(xì)胞類型的分析。當(dāng)細(xì)胞死亡，細(xì)胞膜破裂，從而使臺盼藍(lán)染料能夠透過。結(jié)果，死細(xì)胞或已失去活力的細(xì)胞顏色比活細(xì)胞要深一些。通過對這種色調(diào)的對比測量，從而能夠測量到細(xì)胞活力。臺盼藍(lán)染色排除法示意圖

活細(xì)胞排除染料

染料透過死細(xì)胞

與MTT法之間的比較Vi-CELL細(xì)胞活力計(jì)數(shù)可對一個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)組的總細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)進(jìn)行絕對計(jì)數(shù)，而MTT則通過測定活細(xì)胞所形成的甲臜溶解后的光密度值間接反映活細(xì)胞數(shù)量，二者的原理不同。由MTT還原所產(chǎn)生的甲臜產(chǎn)物不溶于水，需被DMSO溶解后才能檢測,會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生一定影響；而且MTT從加入到進(jìn)行檢測需要4個(gè)小時(shí)，方法煩瑣，耗時(shí)較長。Vi-CELL細(xì)胞活力計(jì)數(shù)法可即時(shí)檢測，相對簡單。在進(jìn)行貼壁細(xì)胞的檢測時(shí)，MTT法可直接加入MTT，進(jìn)行檢測；而采用細(xì)胞活力計(jì)數(shù)法則必須將培養(yǎng)板中的細(xì)胞消化下來，再進(jìn)行計(jì)數(shù)。Vi-cell操作步驟

一、登陸樣品將至少為0.5mL（最多為2.0mL）的樣品放入樣品杯內(nèi)。1.將樣品杯置于下一個(gè)可用的樣品架位置。2.單擊Loginsample（登錄樣品）按鈕，以登錄樣品。在樣品架上選擇樣品杯位置（適用時(shí)）。輸入SampleID（樣品ID）。注意不要使用特殊字符如[]、=、:、/等。選擇Celltype（細(xì)胞類型）。如果樣品已預(yù)先經(jīng)過稀釋，選擇Dilutionfactor（稀釋因子）。單擊OK（確定）。按下Startqueue（開始排列），即可開始進(jìn)行分析。細(xì)胞類型屏幕

操作人員應(yīng)對每種細(xì)胞類型預(yù)先設(shè)置儀器和測量參數(shù)，以確保分析結(jié)果準(zhǔn)確。三、記錄數(shù)據(jù)如圖所示：活細(xì)胞為白色，周圍有綠色線包圍，死細(xì)胞為黑色，周圍有紅線包圍。注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞活力以百分比、濃度和細(xì)胞數(shù)表示。2.濃度檢測范圍在50,000-10,000,000個(gè)細(xì)胞/毫升。3.細(xì)胞直徑在3-70μm。容許的最小直徑為3μm。利用最小直徑可排除碎片和/或不需要的細(xì)胞。細(xì)胞類型容許的最大直徑為70μm。4.樣品杯中樣品至少0.5ml，最多2ml。5.試劑盒類型：綠色-緩沖液；紅色-消毒劑；黃色-洗滌劑；藍(lán)色-臺盼藍(lán)試劑6.注意試劑盒試劑含量，更換備用試劑盒。7.處理廢液注意安全

原理四甲基偶氮唑鹽(MTT)是一種黃色的染料?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時(shí)在細(xì)胞色素C的作用下，將淡黃色的MTT還原成藍(lán)紫色、不溶于水的甲臜（Formazan）顆粒。該顆粒溶解后，其液體的吸光度值（A）與活細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞代謝活性呈正相關(guān)。因此可根據(jù)光密度A值推測出活細(xì)胞的數(shù)目。由于死細(xì)胞中不含琥珀酸脫氫酶，因此加入MTT不會產(chǎn)生甲臜。實(shí)驗(yàn)方法:取對數(shù)生長期的U937細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性。調(diào)細(xì)胞濃度為5104/ml,接種于96孔板,每孔100μl,將不同濃度藥物經(jīng)倍比稀釋后分別加入各孔中，分別設(shè)200ug/ml,100ug/ml,50ug/ml三組,每種濃度3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)細(xì)胞對照組。對照組：100μl細(xì)胞＋100μl培養(yǎng)液各實(shí)驗(yàn)組：100μl細(xì)胞＋100μl抗腫瘤藥物溶液將培養(yǎng)板置于37℃,5%CO2孵箱孵育48h.

5.培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)加入MTT（5mg/ml），10ul/孔。6.酶標(biāo)儀檢測各組A值，570nm為檢測波長，630nm為參考波長。7．計(jì)算不同濃度藥物對U937細(xì)胞的增殖抑制率。抑制百分率=(對照組A570-630－實(shí)驗(yàn)組A570-630)/對照組A570-630

100%。8．繪制增殖抑制曲線。實(shí)驗(yàn)二

NK細(xì)胞殺傷功能測定（MTT法）淋巴細(xì)胞分離技術(shù)

分離液密度梯度離心分離法

原理淋巴細(xì)胞分離液是由聚蔗糖（Ficoll）和泛影葡胺（Hypzue）按一定比例混合制成，其分子量大又無化學(xué)活性，20°C時(shí)比重為1.077+0.002，淋巴細(xì)胞比重為1.070與之相似，而粒細(xì)胞和紅細(xì)胞比重為1.092左右。分離時(shí)，血液或其他細(xì)胞液層加于分離液上，形成清楚界面，通過離心，使一定比例的細(xì)胞按一定密度梯度分布：粒細(xì)胞和紅細(xì)胞沉于分離液以下，淋巴細(xì)胞在清楚界面上形成純細(xì)胞層，從而把淋巴細(xì)胞分離出來。GravityFicoll-Hypaque1.077±0.001g/LLymophocytes,Monocytes1.070g/LGranulocytes,Erythrocytes1.092g/LFicoll-Hypaque----Dilutedblood--------Plasma----Lymphocyte,Monocyte----Ficoll-HypaqueCentrifugationFicoll-Hypaquedensitygradientcentrifugation方法1．肝素防凝人外周血加入1-4倍量Hanks液稀釋混勻。2、取2ml淋巴細(xì)胞分離液加入10ml離心管中，將稀釋的血液用滴管沿離心管壁層加于分離液上（血：分離液=1-4：1），保持兩者的清楚界面。3、水平離心2000rpm/15分，小心取出。4、用平口滴管小心吸出界面上白色霧狀的淋巴細(xì)胞層，用Hanks液洗二次，離心分別為第一次2000rpm/10分；第二次1500rpm/10分。5、加1640培液0.5-1ml懸起、混勻細(xì)胞。6、細(xì)胞活力測定：取少許混勻細(xì)胞加入苔盼藍(lán)染液（細(xì)胞:染液=1:1），低倍鏡下觀察，不著色者為活細(xì)胞，著色者為死細(xì)胞。計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞百分率。7、細(xì)胞計(jì)數(shù)：混勻細(xì)胞，用白細(xì)胞稀釋液做一定稀釋后，灌于細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)算池內(nèi)，低倍鏡下計(jì)數(shù)，按下式計(jì)算每ml細(xì)胞數(shù)：細(xì)胞數(shù)/ml=4個(gè)大方格細(xì)胞數(shù)÷4×稀釋倍數(shù)×1048、用1640培液將細(xì)胞調(diào)至所需濃度備用。注意事項(xiàng)1、分離細(xì)胞時(shí)嚴(yán)格保持血液/細(xì)胞懸液與分離液兩者的清楚界面，切勿形成氣泡。2、細(xì)胞活力測定時(shí)，活細(xì)胞應(yīng)達(dá)95%以上。材料儀器1、肝素防凝外周血（肝素500U/ml）、NK靶細(xì)胞：K562細(xì)胞（人紅白血病細(xì)胞株）2、淋巴細(xì)胞分離液、無Ca2+、Mg2+Hanks液（Hanks液）、5mg/mlMTT、RPMI1640培養(yǎng)液、白細(xì)胞稀釋液、苔盼藍(lán)染液、生理鹽水3、96孔圓底、平底培養(yǎng)板、可調(diào)式移液器、吸頭、離心管、滴管、吸管、細(xì)胞計(jì)數(shù)板等4、生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、普通顯微鏡、倒置顯微鏡等方法

1、K562細(xì)胞傳代培養(yǎng)，取生長旺盛的細(xì)胞備用。2、肝素防凝外周血常規(guī)分離淋巴細(xì)胞（見附：淋巴細(xì)胞分離技術(shù)），Hanks液洗三次，計(jì)數(shù)及活力測定后，用1640培液調(diào)細(xì)胞數(shù)為5、2.5×106/ml。3、取預(yù)先培養(yǎng)好、生長旺盛的K562細(xì)胞，Hanks液1500rpm/10分洗三次，生理鹽水稀釋計(jì)數(shù)及活力測定后，用1640培液調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×105/ml。4、將效靶比=50:1、25:1的淋巴細(xì)胞（效）、K562細(xì)胞（靶）加入96孔圓底板：實(shí)驗(yàn)組分別加入各效靶比的效、靶細(xì)胞各100μl/孔；同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞孔及效應(yīng)細(xì)胞孔作為對照孔。上述各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。另加儀器調(diào)零孔1640培液200μl/孔，1孔。

結(jié)果判定1、實(shí)驗(yàn)孔的A值應(yīng)高于效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞對照孔。2、人外周血NK細(xì)胞殺傷活性正常參考值：效靶比=50:1，男性48.65+17.29%；女性50.10+15.33%注意事項(xiàng)

效靶細(xì)胞的計(jì)數(shù)及加樣要準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)三

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）

ELISA是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。（一）基本原理

1、基本原理先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性，將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原進(jìn)行反應(yīng)，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離成分，然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行抗原或抗體的定性或定量檢測。2、常用方法（1）間接法此法常用于測抗體。將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標(biāo)本（含相應(yīng)抗體）與之結(jié)合，溫育洗滌后，加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體（酶標(biāo)抗抗體）和底物顯色進(jìn)行測定（圖1）。圖1間接法測抗體示意圖

（2）雙抗體夾心法此法常用于測抗原。將已知抗體吸附于固相載體，加入待檢標(biāo)本（含相應(yīng)抗原）與之結(jié)合，溫育洗滌后，加入酶標(biāo)抗體和底物顯色進(jìn)行測定（圖2）。

圖2雙抗體夾心法測抗原示意圖（3）競爭法此法常用于測抗原和半抗原，也用于測抗體。以測抗原為例，將特異抗體吸附于固相載體，加入待測抗原和酶標(biāo)已知抗原，使兩者競爭與固相抗體結(jié)合，經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測抗原含量呈負(fù)相關(guān)，即待測抗原和酶標(biāo)抗原顏色反應(yīng)的差數(shù)是待測抗原的含量（圖3）。圖3競爭法測抗原示意圖試驗(yàn)管對照管3、ELISA方法新的改進(jìn)和發(fā)展

ELISA方法由于靈敏、特異，操作簡便、快速，實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較為簡單，應(yīng)用范圍廣泛，無放射性污染等優(yōu)點(diǎn)，成為目前普及應(yīng)用最廣，發(fā)展最快的免疫學(xué)技術(shù)之一。生物素-親合素系統(tǒng)（BAS）是在ELISA中應(yīng)用的常見技術(shù)（BAS-ELISA），其中ABS-ELISA法更為常用，其基本原理為，固相抗體+待測抗原+生物素化抗體+親合素-酶標(biāo)生物素復(fù)合物+底物顯色。ABS-ELISA法

ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60,000，每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學(xué)方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質(zhì)和糖等多種類型的大小分子形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物，標(biāo)記方法頗為簡便。生物素與親和素的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性，其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于一個(gè)親和素可與4個(gè)生物素分子結(jié)合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素（LAB）法和橋聯(lián)親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標(biāo)記的親和素反應(yīng)，然后再加酶標(biāo)記的生物素以進(jìn)一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為堿性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強(qiáng)，用于ELISA中可使本底增高。從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點(diǎn)，在ELISA應(yīng)用中有替代前者的趨勢?？蒲许?xiàng)目中檢測血清或培養(yǎng)上清中的微量成分,如細(xì)胞因子常采用本法。人白細(xì)胞介素2（IL-2）檢測

（雙抗體夾心-ELISA法）原理

雙抗體夾心ABC-ELISA法。抗人IL-2單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的人IL-2會與單抗結(jié)合，游離的成分被洗去。同時(shí)加入生物素化的抗人IL-2抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合；抗人IL-2抗體與結(jié)合在單抗上的人IL-2結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色劑，若反應(yīng)孔中有人IL-2，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變黃。在450nm處測A值，人IL-2濃度與A450值之間呈正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中人IL-2濃度。圖4人白細(xì)胞介素2（IL-2

）檢測（ABC-ELISA法）原理示意圖

材料儀器

1、人IL-2ELISA試劑盒

1a標(biāo)準(zhǔn)品1支(1000pg，凍干)4℃1b標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本稀釋液(黃色)1瓶(16ml)4℃2a濃縮生物素化抗體2/1支*(60μl)4℃2b生物素化抗體稀釋液

1瓶(16ml)4℃3a濃縮酶結(jié)合物2/1支*(60μl)4℃(避光)3b酶結(jié)合物稀釋液(紅色)1瓶(16ml)4℃4濃縮洗滌液100×(蘭色)1瓶(10ml)4℃5a顯色劑A1瓶(6ml)4℃5b顯色劑B1瓶(6ml)4℃(避光)6終止液1瓶(6ml)4℃抗體包被板條8×12或8×64℃封板膠紙1張說明書1份*:[96/48Test]

2、酶標(biāo)儀(450nm)3、高精度加液器及吸頭：2-20,20-200,200-1000μl4、雙蒸水或去離子水，坐標(biāo)紙等標(biāo)本收集1、收集血液的試管應(yīng)為無熱原和內(nèi)毒素試管。血漿抗凝劑為EDTA。標(biāo)本應(yīng)清澈透明，避免溶血，高血脂，如有懸浮物應(yīng)離心去除。2、標(biāo)本收集后若不及時(shí)檢測，按一次用量分裝，凍存于－20℃，避免反復(fù)凍融。方法

1、提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。2、將濃縮洗滌液（4）用雙蒸水稀釋(1:20)。未用完的放回4℃。3、標(biāo)準(zhǔn)品:以標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本稀釋液(1b)1.0ml復(fù)溶凍干標(biāo)準(zhǔn)品(1a),靜置15分鐘后混勻(濃度為1000pg/ml),根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋。未用完的復(fù)溶標(biāo)準(zhǔn)品放入-20℃保存,稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品不應(yīng)重復(fù)使用。4、可根據(jù)實(shí)際情況，將標(biāo)本做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（可做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù)）。5、從密封袋中取出所需板條，其它板條密封放回4℃6、除空白孔外，分別將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本100ul/孔加入板條的相應(yīng)孔中，