生物大分子的分離與制備2

課程要求平時成績占30%，包括考勤、課前提問10分；要求每位同學(xué)準(zhǔn)備筆記本，記好每堂課的筆記，占20分。期末考試占到70%，其中包括名詞解釋，填空，簡答題，分析及其敘述題借閱相關(guān)的書籍資料進(jìn)行預(yù)習(xí)以及復(fù)習(xí)，奠定好基礎(chǔ)。課程講述以專題的形式，涉及相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)以及生物化學(xué)與分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展。現(xiàn)在是1頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023生物大分子的提取與制備現(xiàn)在是2頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023引言生物化學(xué)研究的三個主要發(fā)展階段：敘述生物化學(xué)階段（1770～1903年）。又稱為靜態(tài)或形態(tài)生物化學(xué)，研究內(nèi)容以分析生物體內(nèi)物質(zhì)的化學(xué)組成、性質(zhì)和含量為主。動態(tài)生物化學(xué)階段（1903～1950年）。又稱為生理化學(xué)。主要研究生物體內(nèi)組成物質(zhì)的化學(xué)變化及相互轉(zhuǎn)變。功能或分子生物化學(xué)階段（1950年至今）。研究生命的本質(zhì)和奧秘：運(yùn)動、神經(jīng)、內(nèi)分泌、生長、發(fā)育、繁殖等的分子機(jī)理。4/8/20233現(xiàn)在是3頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023生物化學(xué)研究技術(shù)方法生物化學(xué)研究的方法：觀察：生命現(xiàn)象分離：未知蛋白組分，新基因片段，新的次生代謝物。（抽提、過濾、離心、色譜）分析：結(jié)構(gòu)與性質(zhì)（序列分析，X-射線晶體衍射，核磁共振，波譜，質(zhì)譜等）功能（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法）代謝及其細(xì)胞調(diào)控改造及利用4/8/20234現(xiàn)在是4頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023分離生命現(xiàn)象生化組分分析1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)2、功能3、代謝及其細(xì)胞調(diào)控改造利用生物化學(xué)研究技術(shù)方法經(jīng)典的研究步驟：分離生化組分（細(xì)胞器和生物分子）；分析生化組分的結(jié)構(gòu)；分析生化組分的功能和代謝（合成與分解）及其相互作用。4/8/20235現(xiàn)在是5頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023生物化學(xué)研究技術(shù)方法生物化學(xué)研究技術(shù)：分離技術(shù)：沉淀、吸附、膜分離（過濾、透析等）、離心、層析、電泳等；分析檢測技術(shù)：電泳、層析、光譜、質(zhì)譜、電化學(xué)技術(shù)、分子標(biāo)記等。分子生物學(xué)研究技術(shù)：基因重組、分子雜交、PCR與反轉(zhuǎn)錄、核酸測序、免疫技術(shù)、生物芯片等等。4/8/20236現(xiàn)在是6頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023生物化學(xué)研究技術(shù)方法

研究技術(shù)的選擇：？？？

實(shí)驗(yàn)的目的：定性分析與定量分析；分離或分析物的物理化學(xué)性質(zhì)；研究技術(shù)的精確性、準(zhǔn)確性及檢測限；研究成本；潛在的風(fēng)險與危害。4/8/20237現(xiàn)在是7頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023生物分子的結(jié)構(gòu)與功能分析：1.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析2.酶活力檢測3.蛋白質(zhì)組學(xué)分析4.DNA序列分析5.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）6.分子雜交7.基因克隆8.基因組文庫構(gòu)建9.cDNA文庫構(gòu)建10.文庫篩選11.報告基因檢測12.基因芯片13.基因敲除14.RNAi15.轉(zhuǎn)基因動物現(xiàn)在是8頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023生物大分子相互作用分析:生化反應(yīng)過程實(shí)際上是生物分子間的相互作用過程。生物大分子間的相互作用是它們的功能基礎(chǔ)。隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，建立了一系列研究核酸及蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)?，F(xiàn)在是9頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023生物大分子相互作用分析技術(shù):凝膠阻滯分析法DNA酶Ⅰ足紋分析法蛋白質(zhì)芯片酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互作用蛋白質(zhì)現(xiàn)在是10頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023第一章

生物大分子的分離純化

蛋白質(zhì)（酶）、核酸存在于一切生物體中，是非常重要的生物大分子。蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者，擔(dān)負(fù)著生物催化、物質(zhì)運(yùn)輸、運(yùn)動、防御、調(diào)控及記憶、識別等多種生理功能；核酸是遺傳信息的攜帶者，在生物體中指導(dǎo)各種蛋白質(zhì)的合成?，F(xiàn)在是11頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023生物材料組成非常復(fù)雜。其中包括數(shù)百種甚至數(shù)千種化合物，并且在分離過程中，這些化合物仍在發(fā)生代謝變化，如蛋白質(zhì)和核酸的水解。

有些化合物的含量極微，如激素等。

許多具有生物活性的物質(zhì)一旦離開活體，很易變變性破壞，因此常選用比較溫和的條件進(jìn)行制備。

生化分離制備幾乎都在溶液中進(jìn)行，影響因素很多，實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)驗(yàn)性較強(qiáng)。生物化學(xué)分離方法與一般的化學(xué)分離方法相比，有下列幾個特點(diǎn)：現(xiàn)在是12頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023

生物大分子的制備通常可按以下步驟進(jìn)行：確定要制備的生物大分子的目的和要求，是進(jìn)行科研、開發(fā)還是要發(fā)現(xiàn)新的物質(zhì)。建立相應(yīng)的可靠的分析測定方法，這是制備生物大分子的關(guān)鍵。通過文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)備性實(shí)驗(yàn)，掌握生物大分子目的產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)。

現(xiàn)在是13頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023生物材料的破碎和預(yù)處理。分離純化方案的選擇和探索，這是最困難的過程。生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定，要求達(dá)到一維電泳一條帶，二維電泳一個點(diǎn)，或HPLC和毛細(xì)管電泳都是一個峰。產(chǎn)物的濃縮，干燥和保存?，F(xiàn)在是14頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023生物大分子分離純化的一般步驟和原則

層析法電泳法超離心法透析和超濾鹽析（硫酸銨鹽析）等點(diǎn)電沉淀有機(jī)溶劑沉淀離心│←前處理→│←粗分級→│←細(xì)分級→│材料選擇與處理細(xì)胞破碎（機(jī)械破碎、溶賬和自溶、酶解、化學(xué)處理）生物組織→→提取液→

→粗產(chǎn)品→→結(jié)晶分子大小溶解度電荷性質(zhì)吸附性質(zhì)生物親和力依據(jù)原理現(xiàn)在是15頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023注意事項(xiàng)

基本原則：防止生物分子變性、降解1．控制適當(dāng)?shù)膒H2．控制低溫3．注意提取過程中的溶液環(huán)境4．防止提純過程中丟失一些輔助因子或亞基現(xiàn)在是16頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023第一節(jié)：生物材料的選擇

選擇生物材料的原則：有效成分含量多，穩(wěn)定性好；來源豐富，保持新鮮；提取方法簡單；有綜合利用價值等。生物材料一般可以分為兩大類：天然生物材料和人工生物材料。生物材料一般是指在自然界易采集的、目的物含量較高的生物個體、器官或組織。人工生物材料又分為三種：1、新品種材料2、組織培養(yǎng)材料3、生物產(chǎn)品與生物制品材料現(xiàn)在是17頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023要了解的生物大分子的物理、化學(xué)性質(zhì)主要有：在水和各種有機(jī)溶劑中的溶解性。在不同溫度、pH值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性。固態(tài)時對溫度、含水量和凍干時的穩(wěn)定性。各種物理性質(zhì)：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數(shù)。其他化學(xué)性質(zhì)：如對各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性。對其他生物分子的特殊親和力。現(xiàn)在是18頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023

制備生物大分子的分離純化方法多種多樣，主要是利用它們之間特異性的差異，如分子的大小、形狀、酸堿性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其他分子的親和性等。

現(xiàn)在是19頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/20231.動物組織：

選材：必須選擇有效成分含量豐富且易分離的臟器組織為原材料。單酯酶，從含量看，雖然在胰臟、肝臟和脾臟中較豐如磷酸富，但是因其與磷酸二酯酶共存，進(jìn)行提純時，這兩種酶很難分開。所以實(shí)踐中常選用含磷酸單酯酶少，但幾乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。

脫脂：臟器中含量較高的脂肪，容易氧化酸敗，導(dǎo)致原料變質(zhì)影響純度操作和制品的率。常用的脫脂方法有：人工剝?nèi)ヅK器外的脂肪組織；浸泡在脂溶性的有機(jī)溶劑（丙酮，乙醚）中脫脂；采用快速加熱（50℃左右），快速冷卻的方法，使溶化的油滴冷卻后凝聚成油塊而被除去。現(xiàn)在是20頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/20231、動物組織保存：對預(yù)處理好的材料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)冷凍保存。a.冰凍：剝?nèi)ブ竞徒钇さ冉Y(jié)締組織，短期保存：－10℃的冰箱內(nèi)；長期保存：－70℃低溫冰箱內(nèi)。b.干燥：對于像腦垂體一類小組織，可置丙酮液中脫水，干燥后磨粉儲存?zhèn)溆?；對于含耐高溫有效成分（如：肝素）的腸粘膜，可在沸水蒸煮處理，烘干后能長期保存。

冰箱的除霜循環(huán)，可能對細(xì)胞造成傷害，要特別小心。解凍時要越快越好，但避免局部過熱?，F(xiàn)在是21頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/20232.植物材料：

選材：注意植物品種和生長發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。種子須泡脹或粉碎才可使用。含油脂較多的也要進(jìn)行脫脂處理。

a.提取核DNA：選用黃化苗（生長7－10天小麥，水稻），防止葉綠體DNA的干擾b.提取RNA：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用生長幼嫩組織為好。保存：冷凍采樣后盡快放于－4℃――20℃冰箱內(nèi)。DNA,RNA采樣后，N2速凍，至－70℃冰箱。對RNA樣，如不立即使用，冷凍保存尤為重要?，F(xiàn)在是22頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023

3、微生物

為制備生命大分子物質(zhì)的主要材料之一。

用離心法收集到的上清液，可用于制備胞外酶和某些輔基等有效成分；可置低溫下短時間貯存。

收集到的菌體，經(jīng)破細(xì)胞處理后則可從中提取其他有效成分；或制成凍干粉，在4℃保存(數(shù)月不會變質(zhì))?，F(xiàn)在是23頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023第二節(jié)細(xì)胞的破碎胞外物質(zhì)——直接提取胞內(nèi)物質(zhì)——破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜后提取細(xì)胞破碎的主要方法：機(jī)械破碎溶脹和自溶化學(xué)處理：如丙酮、氯仿、甲苯、SDS等生物酶降解現(xiàn)在是24頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023研磨細(xì)胞破碎技術(shù)現(xiàn)在是25頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法超聲法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：表面活性劑：酸堿酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理現(xiàn)在是26頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/20231.機(jī)械破碎：(1)研磨法（小量樣品）剪碎的動物組織如鼠肝、兔肝等置研缽中，用研磨棒研碎。為了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。用勻漿器處理，也能破碎動物細(xì)胞。此法較溫和，適宜實(shí)驗(yàn)室使用。但加石英砂時，要注意其對有效成分的吸附作用。如系大規(guī)模生產(chǎn)時，可用電動研磨法。細(xì)菌和植物組織的細(xì)胞破碎均可用此法?，F(xiàn)在是27頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023(2)組織搗碎器法：用搗碎器(轉(zhuǎn)速8000-10000r/m)處理30-45s可將植物和動物細(xì)胞完全破碎。如用其破碎酵母菌和細(xì)菌的細(xì)胞時，須加入石英砂才有效。在搗碎期間必須保持低溫，搗碎的時間不易太長，以防溫度升高引起有效成分變性?，F(xiàn)在多用細(xì)胞破碎儀。（大量樣品）效果：作用強(qiáng)烈，但活性物質(zhì)易受破壞操作：低溫、短時?，F(xiàn)在是28頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023(3)超聲波法：借助聲波的震動力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器的有效方法。多用于微生物細(xì)胞的破碎，一般輸出功率100-200W，破碎時間3—15min。如果在細(xì)胞懸浮液中加石英砂則可縮短時間。為了防止電器長時間運(yùn)轉(zhuǎn)產(chǎn)生過多的熱量，常采用間歇處理和降低溫度的方法進(jìn)行。超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)?，F(xiàn)在是29頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023超聲波破碎的機(jī)理：一般認(rèn)為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation),液體中局部空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，引起的粘滯性旋渦在細(xì)胞上造成了剪切力，使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從而使細(xì)胞破碎。操作過程產(chǎn)生大量的熱，需在冰水或外部冷卻的容器中進(jìn)行。JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)現(xiàn)在是30頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對酵母菌的效果較差。但超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)失活。超聲波破碎的有效能量利用率極低由于對冷卻的要求相當(dāng)苛刻，所以不易放大，但在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用?，F(xiàn)在是31頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023(4)壓榨法：是一種溫和、徹底破碎細(xì)胞的方法。用30MPa左右的壓力迫使幾十毫升細(xì)胞懸液通過一個小孔(＜細(xì)胞直徑的孔)，致使其被擠破、壓碎。(5)凍融法：將細(xì)胞置低溫下冰凍一定時間，然后取出置室溫下(或40℃左右)迅速融化。如此反復(fù)凍融多次，細(xì)胞可在形成冰粒和增高剩余胞液鹽濃度的同時，發(fā)生溶脹、破碎?，F(xiàn)在是32頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/20232

非機(jī)械破碎非機(jī)械方法很多1）酶解2）化學(xué)法溶胞3）物理法滲透壓沖擊凍結(jié)和融化干燥法其中酶法和化學(xué)法溶胞應(yīng)用最廣?，F(xiàn)在是33頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023四、酶解法Enymaticlysis)

酶解是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜。1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等現(xiàn)在是34頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023外加酶法酶解法的特點(diǎn)是專一性強(qiáng)，因此在選擇酶系統(tǒng)時，必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成來選擇。溶菌酶（lysozyme)能專一性地分解細(xì)胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷鍵，因此主要用于細(xì)菌類細(xì)胞壁的裂解。革蘭氏陽性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產(chǎn)生溶壁現(xiàn)象。但對于革蘭氏陰性菌，單獨(dú)采用溶菌酶無效果，必須與螯合劑EDTA一起使用。放線菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌，以肽聚糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶。酵母和真菌由于細(xì)胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì)等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。現(xiàn)在是35頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023

有時采用幾種酶的混合物會產(chǎn)生更好的效果，加入時需確定相應(yīng)的次序。對酵母細(xì)胞采用酶法破碎時，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)-甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時若緩沖液的滲透壓變化，則細(xì)胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物?，F(xiàn)在是36頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023酶解-自溶作用自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代謝過程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長過程繼續(xù)下去。自溶作用：改變其生長環(huán)境（溫度、ｐＨ、緩沖液），可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。缺點(diǎn)是：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降?，F(xiàn)在是37頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。（2）化學(xué)處理法（Chemicalpermeation）現(xiàn)在是38頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用6mol/LHCl。堿能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來。特點(diǎn)：成本低，反應(yīng)激烈，不具選擇性。1）酸、堿處理法現(xiàn)在是39頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023細(xì)胞破碎常用的表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（SDS，陰離子型）；非離子型如TritonX-100和吐溫（Tween）等對疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。2）表面活性劑無論表面活性劑是陰離子、陽離子還是非離子型，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用，能與細(xì)胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解現(xiàn)在是40頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023

能分解細(xì)胞壁中的磷脂，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。有機(jī)溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等3）有機(jī)溶劑4）EDTA螯合劑

處理G-細(xì)菌，對細(xì)胞壁外層有破壞作用。G-細(xì)菌的壁外層結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。現(xiàn)在是41頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023通用性差；時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50%；有些化學(xué)試劑有毒?；瘜W(xué)試劑的加入常會給隨后產(chǎn)物的純化帶來困難，并影響最終產(chǎn)物純度化學(xué)處理法特點(diǎn)：缺點(diǎn)對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。優(yōu)點(diǎn)現(xiàn)在是42頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023（3）物理法滲透壓沖擊法凍結(jié)-融化法干燥法現(xiàn)在是43頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023選擇破碎方法的依據(jù)：細(xì)胞處理量；細(xì)胞壁強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)(高聚物交聯(lián)程度、種類和壁厚度)；目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性；破碎程度；目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放現(xiàn)在是44頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023破碎技術(shù)的研究方向多種破碎方法相結(jié)合化學(xué)法、酶法、機(jī)械法相結(jié)合。酶法與高壓勻漿、超聲波震蕩、鰲合劑、滲透壓法結(jié)合如用溶解酶預(yù)處理面包酵母，然后高壓勻漿，95MPa壓力下勻漿4次，總破碎率接近100%。而單獨(dú)采用高壓勻漿法，同樣條件下破碎率只有32%。有機(jī)溶劑與凍融法、干燥法結(jié)合現(xiàn)在是45頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023第三節(jié)生物大分子的提取提取是在分離純化前期，將樣品研磨，把被破碎的細(xì)胞置于一定的溶劑（提取液）中，使某一類分子目的物釋放到提取液中的過程。提取液應(yīng)具備的條件：對有效成分溶解度大，破壞作用??；對雜質(zhì)溶解度小或不溶解；來源廣泛、價格低廉、操作安全等?，F(xiàn)在是46頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023溶劑提取法原理:利用溶劑的溶解作用把所需物質(zhì)從細(xì)胞中轉(zhuǎn)移出來。影響溶劑提取效率的因素（影響溶解度的的因素）1、溶劑的性質(zhì)：（根據(jù)相似相溶原理）2、離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度是影響物質(zhì)溶解度的主要因素，但離子強(qiáng)度對不同物質(zhì)溶解度的影響不同，如高離子強(qiáng)度下DNA-核蛋白溶解度增加，而低離子強(qiáng)度下RNA-核蛋白溶解度增加；絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在稀鹽溶液中溶解度增加（鹽溶）?，F(xiàn)在是47頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023影響溶劑提取效率的因素

（影響溶解度的的因素）3、PH值：溶劑的PH值影響溶質(zhì)分子的解離狀態(tài)，離子狀態(tài)的物質(zhì)，不能是陽離子還是陰離子都易溶于水，而非離子狀態(tài)的物質(zhì)易溶于有機(jī)溶劑。4、溫度：溫度的升高可以增加物質(zhì)的溶解度。5、去垢劑：去垢劑是一類既有親水基又有疏水基的物質(zhì)，可以分為陰離子、陽離子和中性去垢劑等，如SDS，Tween20，TritonX-100?，F(xiàn)在是48頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023一、分離純化的意義①從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)、核酸，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。②工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。③醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。④基因工程的需要現(xiàn)在是49頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023二、分離純化的要求1、純度：主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。如作為研究蛋白和一級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標(biāo)準(zhǔn)蛋白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應(yīng)用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達(dá)到一定純度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分離純化過程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大?，F(xiàn)在是50頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023三、分離純化的一般程序

1、材料的選擇和預(yù)處理2、破碎細(xì)胞及提?。ㄓ袝r還需要進(jìn)行細(xì)胞器的分離）3、分離純化：包括粗分級分離和細(xì)分級分離其中前兩個階段為生物大分子分離純化的前處理?，F(xiàn)在是51頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023

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水溶液提?。?/p>

蛋白質(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主。稀溶液和緩沖液對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。用水溶液提取生物大分子應(yīng)注意的幾個主要影響因素是：

1)鹽濃度（即離子強(qiáng)度）：離子強(qiáng)度對生物大分子的溶解度有極大的影響，有些物質(zhì)，如DNA-蛋白復(fù)合物，在高離子強(qiáng)度下溶解度增加。

現(xiàn)在是52頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023

絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強(qiáng)度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時大大增加，稱為“鹽溶”現(xiàn)象。鹽溶現(xiàn)象的產(chǎn)生主要是少量離子的活動，減少了偶極分子之間極性基團(tuán)的靜電吸引力，增加了溶質(zhì)和溶劑分子間相互作用力的結(jié)果。為了提高提取效率，有時需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強(qiáng)度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性?，F(xiàn)在是53頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/20232)

pH值：蛋白質(zhì)、酶與核酸的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有關(guān)。過酸、過堿均應(yīng)盡量避免，一般控制在pH=6～8范圍內(nèi)，提取溶劑的pH應(yīng)在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點(diǎn)的兩側(cè)。3)溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質(zhì)和酶，提取時一般在0℃～5℃的低溫操作。4)防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制劑或調(diào)節(jié)提取液的pH、離子強(qiáng)度或極性等方法使相應(yīng)的水解酶失去活性，防止它們對欲提純的蛋白質(zhì)、酶及核酸的降解作用。

現(xiàn)在是54頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023

5)攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用溫和攪拌為宜，速度太快容易產(chǎn)生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會引起酶等物質(zhì)的變性失活。

因?yàn)橐话愕鞍踪|(zhì)都含有相當(dāng)數(shù)量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需基團(tuán)，若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會使巰基氧化為分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導(dǎo)致酶活性的喪失。在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸以防止巰基氧化。現(xiàn)在是55頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/20231、蛋白質(zhì)（酶）的提取水溶液提取法：通常采用類似生理?xiàng)l件下的緩沖液，如20-50mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.0-7.5）或0.1mol/LTris-HCl（pH7.5-8.0）緩沖液作提取液。有機(jī)溶劑提取法：如乙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇等。五、提取現(xiàn)在是56頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/20232、DNA提取:原則:保持核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性。去除雜質(zhì)，保證核酸足夠純。步驟：①破膜釋放出目的核酸分子。②分離通過酶、有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)pH值、離心等手段得到粗制品。③純化進(jìn)一步去除雜質(zhì)。濃度和質(zhì)量檢測:分光光度法、Agarose凝膠電泳?，F(xiàn)在是57頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/20232、核酸的提取DNA的提取：一般是利用DNA-核蛋白（DNP）易溶于1mol/LNaCl溶液而不溶于0.14mol/LNaCl溶液。RNA的提?。豪肦NA-核蛋白（RNP）易溶于0.14mol/LNaCl溶液而不溶于1mol/LNaCl溶液的性質(zhì)，先提取得到RNP。提取得到DNP或RNP后，再將蛋白質(zhì)除去即可得到相應(yīng)的核酸?，F(xiàn)在是58頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023

細(xì)胞的破碎細(xì)胞壁?去除蛋白質(zhì)核酸的沉淀研磨破碎CTAB、SDS苯酚、氯仿、異戊醇（25：24：：1）異丙醇、乙醇三大步驟現(xiàn)在是59頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023去污劑法或有機(jī)溶劑法去污劑法是利用SDS等陰離子去污劑與蛋白質(zhì)帶正電荷的側(cè)鏈結(jié)合，從而使核酸與蛋白質(zhì)分開。然后加入濃醋酸鉀溶液，使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀，并使多余的SDS轉(zhuǎn)化為溶解度小的鉀鹽而同時沉淀。有機(jī)溶劑法是利用酚、氯仿的混合液作蛋白質(zhì)的變性劑，當(dāng)它們與含核酸和蛋白質(zhì)的水溶液一起振搖時形成乳狀液，蛋白質(zhì)因充分接觸酚和氯仿而變性，與核酸分開。離心后可分為兩相，一般上層為含核酸的水相，下層為有機(jī)相，交界處是變性凝聚的蛋白質(zhì)層。最后利用乙醇或異丙醇講核酸沉淀離心收集即可。

蛋白質(zhì)的去除現(xiàn)在是60頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023RNA提取:哺乳動物細(xì)胞總RNA主要由rRNA(80%-85%)、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(10%-15%)、mRNA(1%-5%)組成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于細(xì)胞質(zhì)中。注意事項(xiàng):使用RNA酶抑制劑；防止污染?，F(xiàn)在是61頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023第四節(jié)：生物大分子的濃縮沉淀法:在提取液中加入適量的中性鹽或有機(jī)溶劑，使有效的成分變?yōu)槌恋?，?jīng)過離心或過濾收集的沉淀物，加少量緩沖液溶解后，在經(jīng)離心出去不溶物，獲得的上清液通過透析或凝膠過濾脫鹽。鹽析法：有機(jī)溶劑沉淀法；等電點(diǎn)沉淀法；非離子多聚體沉淀法；生成鹽復(fù)合物沉淀法；熱變性沉淀法；酸堿變性沉淀法等。

吸附法：將干葡聚糖凝膠加入提取液中，由于凝膠吸水，提取液的體積可縮小三倍左右。

現(xiàn)在是62頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023超過濾法：把提取液裝入過濾裝置，在空氣或氮?dú)獾膲毫ο拢剐》肿游镔|(zhì)通過半透膜，大分子物質(zhì)留在膜內(nèi)。透析濃縮法減壓蒸餾濃縮法：將提取液裝入減壓蒸餾裝置中，在減壓真空狀態(tài)下進(jìn)行蒸餾。冰凍干燥法現(xiàn)在是63頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法是：中性鹽沉淀（鹽析法）：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。有機(jī)溶劑沉淀：多用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分離純化。選擇性沉淀（熱變性沉淀和酸堿變性沉淀）：多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。

現(xiàn)在是64頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023

選擇適宜的溶劑，使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成沉淀而與核酸分離，這種方法稱為選擇性溶劑沉淀法。①在核酸提取液中加入氯仿/異戊醇或氯仿/辛醇，振蕩一段時間，使蛋白質(zhì)在氯仿/水界面上形成凝膠狀沉淀而離心除去，核酸仍留在水溶液中。②在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，DNA和RNA都進(jìn)入水層，而蛋白質(zhì)沉淀于苯酚層中被分離除去。③在DNA與RNA的混合液中，用異丙醇選擇性地沉淀DNA而與留在溶液中的RNA分離。選擇性溶劑沉淀法：現(xiàn)在是65頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023一、硫酸氨鹽析法原理：根據(jù)蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中溶解度會隨著鹽濃度的增高而上升（鹽溶），但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時，其溶解度又逐漸下降，直至蛋白質(zhì)析出。鹽析的發(fā)生在于鹽濃度增高到一定數(shù)值時，使水活度降低，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子之間相互聚集并從溶液中析出?，F(xiàn)在是66頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團(tuán)的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。如：血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度飽和析出析出分段鹽析現(xiàn)在是67頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023

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中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的基本原理

蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，因?yàn)樵摲肿拥模瑿OOH、－NH2和－OH都是親水基團(tuán)，這些基團(tuán)與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周圍形成1nm～100nm顆粒的親水膠體，削弱了蛋白質(zhì)分子之間的作用力，蛋白質(zhì)分子表面極性基團(tuán)越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大。親水膠體在水中的穩(wěn)定因素有兩個：即電荷和水膜。因?yàn)橹行喳}的親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀。現(xiàn)在是68頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023

⑵中性鹽的選擇

常用的中性鹽中最重要的是（NH4）2SO4，因?yàn)樗c其他常用鹽類相比有十分突出的優(yōu)點(diǎn)：溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當(dāng)高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（0～4℃）進(jìn)行。

現(xiàn)在是69頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023

分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75％的雜蛋白，純度提高了四倍。不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用2～3mol/L濃度的（NH4）2SO4保存可達(dá)數(shù)年之久。價格便宜，廢液不污染環(huán)境?，F(xiàn)在是70頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023影響蛋白質(zhì)鹽析的因素（主要的4個）蛋白質(zhì)濃度對鹽析的影響：蛋白質(zhì)濃度過大，鹽析時發(fā)生共沉現(xiàn)象，分離效果不好；蛋白質(zhì)濃度太稀，耗鹽量過大，蛋白質(zhì)回收率也低。一般為2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度較適中。離子強(qiáng)度和離子類型對鹽析的影響：離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低，越容易產(chǎn)生鹽析現(xiàn)象；離子半徑小而價數(shù)高的離子在鹽析方面影響較強(qiáng)，離子半徑大而價數(shù)低的離子對鹽析影響弱。現(xiàn)在是71頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023影響蛋白質(zhì)鹽析的因素（主要的4個）ＰＨ對鹽析的影響：蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，溶解度越大；在凈電荷為零時，溶解度最低。一般將ＰＨ值調(diào)到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近，這樣有利于鹽析。溫度對鹽析的影響：在低離子強(qiáng)度或水中在一定范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增加；但在高鹽溶液中，溫度的升高有時反而下降。一般情況下在０-４℃操作?，F(xiàn)在是72頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023三、透析濃縮法原理：天然或人工半透膜只允許小分子通過而阻礙大分子通過。當(dāng)膜的兩側(cè)存在小分子濃度梯度差時，小分子就從高濃度一側(cè)向低濃度一側(cè)擴(kuò)散，直至達(dá)到平衡，如果能不斷去除擴(kuò)散出來的小分子，從而達(dá)到分離純化的目的。影響透析的因素1、半透膜的通透性：半透膜的通透性取決于膜孔徑的大小，在能阻礙大分子擴(kuò)散的前提下，孔徑越大，透析速度越快。2、透析外液的更換3、溫度：溫度越高，透析速度越快。4、壓力：用跨膜的壓力梯度可加速大分子的分離速度。5、溶劑現(xiàn)在是73頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023四、蛋白質(zhì)（酶）的分離純化蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。性質(zhì)方法分子大小透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾溶解度等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀電荷電泳、離子交換層析吸附性質(zhì)吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析）對配體分子親和層析的生物親和力現(xiàn)在是74頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/20231、鹽析法鹽離子與水分子作用，原來溶液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層，暴露出來的蛋白質(zhì)表面疏水性區(qū)域相互結(jié)合，形成沉淀。

現(xiàn)在是75頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法是：等電點(diǎn)沉淀：用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀，但此法單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其他方法結(jié)合使用。有機(jī)聚合物沉淀：是發(fā)展較快的一種新方法，主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyeneglycol）作為沉淀劑?，F(xiàn)在是76頁\一共有86頁\編輯于星期三4/8/2023鹽析時的注意事項(xiàng)：（1）添加的硫酸銨的純度要高，添加后，要放30min以上使其充分溶解，且要不斷攪拌，防止局部過濃，發(fā)生共沉淀；（2）同一溶液中欲分離幾種蛋白質(zhì)時，可采用分段鹽析的方法。鹽析通常與等電點(diǎn)沉淀法配合使用。（3）選擇好溫度，一般在室溫下進(jìn)行；（4）蛋白濃度不易過高，一般25－30g/L；低濃度鹽析，可用離心分離；高濃度鹽析（70－8