第7章高效液相色譜法

第17章高效液相色譜法

(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)張松1現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四1.基本概念與特點(diǎn)2.HPLC與經(jīng)典LC、GC的比較3.HPLC儀器結(jié)構(gòu)4.液相色譜的固定相與流動(dòng)相5.HPLC應(yīng)用本章主要內(nèi)容

現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四一、概述它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)．為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進(jìn)行比較：3現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四

1．高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法高效液相色譜法的最大優(yōu)點(diǎn)在于高速、高效、高靈敏度、高自動(dòng)化．為了獲得高柱效而使用了粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過(guò)時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。4現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四

1．高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相色譜高效液相色譜常壓或減壓高壓，40～50MPa填料顆粒大填料顆粒小，2～50μm柱效低柱效高,40000～60000塊/m分析速度慢分析速度快色譜柱只用一次色譜柱可重復(fù)多次使用不能在線檢測(cè)能在線檢測(cè)5現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四

（l）氣相色譜法分析對(duì)象只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20％．對(duì)于占有機(jī)物總數(shù)近80％的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析．

2．高效液相色譜法與氣相色譜法6現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四

(2)氣相色譜采用流動(dòng)相是惰性氣體，它對(duì)組分沒有相互作用力，僅起運(yùn)載作用．而高效液相色譜法中流動(dòng)相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對(duì)組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對(duì)組分作用的選擇競(jìng)爭(zhēng)．因此，流動(dòng)相對(duì)分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個(gè)控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便．7現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四

(3)氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而高效液相色譜法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作．總之，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點(diǎn)，并用現(xiàn)代化手段加以改進(jìn)，因此得到迅猛的發(fā)展．8現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四

2．高效液相色譜法與氣相色譜法氣相色譜高效液相色譜只能分析揮發(fā)性物質(zhì)，只能分析20%的化合物幾乎可以分析各種物質(zhì)不能分析熱不穩(wěn)定物質(zhì)可以分析熱不穩(wěn)定物質(zhì)用毛細(xì)管色譜可得到很高的柱效色譜柱不能很長(zhǎng)，柱效不會(huì)很高有很靈敏的檢測(cè)器如ECD和較靈敏的通用檢測(cè)器(FID和TCD)沒有較高靈敏的通用檢測(cè)器流動(dòng)相為氣體，無(wú)毒，易于處理流動(dòng)相有毒，費(fèi)用較高運(yùn)行和操作容易運(yùn)行和操作比GC難一些儀器制造難度較小儀器制造難度大9現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四液相色譜儀器

highperformanceliquidchromatograph10現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四液相色譜儀（2）11現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四液相色譜儀（3）12現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四液相色譜儀（4）13現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四二、高效液相色譜儀

高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意見下圖，一般可分為4個(gè)主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)．此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等．14現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜結(jié)構(gòu)及流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器溶劑數(shù)據(jù)處理廢液現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四1．高壓輸液系統(tǒng)由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對(duì)流動(dòng)相阻力很大，為使流動(dòng)相較快流動(dòng)，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)．它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、過(guò)濾器、壓力脈動(dòng)阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件．常用的輸液泵為機(jī)械往復(fù)式恒流泵．16現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四泵工作示意圖凸輪柱塞桿柱塞密封圈單向閥泵頭流動(dòng)相入口流動(dòng)相出口現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四2.進(jìn)樣系統(tǒng)

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出．柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬.進(jìn)樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)．進(jìn)樣方式：注射器

18現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四閥

旋轉(zhuǎn)式六通閥4/8/2023現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四旋轉(zhuǎn)式六通閥工作原理20現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四3.分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱是液相色譜儀的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬．玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長(zhǎng)5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。21現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四4.檢測(cè)系統(tǒng)在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測(cè)器.一類是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等.另一類是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有示差折光，電導(dǎo)檢測(cè)器等.現(xiàn)將常用的檢測(cè)器介紹如下:

22現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四1.紫外-可見光檢測(cè)器⑴檢測(cè)原理：基于Lambert-Beer定律，即被測(cè)組分對(duì)紫外光或可見光具有吸收，且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。液相色譜儀一般都配置有UV-Vis檢測(cè)器.⑵組成：光源、流通池、檢測(cè)元件、工作站等。⑶特點(diǎn)：①靈敏度高，噪聲低；②不破壞樣品，可用于制備；③對(duì)溫度、流動(dòng)相流速波動(dòng)不敏感，可用于梯度淋洗；④屬于濃度型檢測(cè)器?，F(xiàn)在是23頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四⑷缺點(diǎn)①只能檢測(cè)有紫外吸收的樣品；②檢測(cè)波長(zhǎng)＞流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)。⑸波長(zhǎng)選擇①選擇λmax作檢測(cè)波長(zhǎng)，以得到較高的靈敏度；②檢測(cè)波長(zhǎng)＞流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)。⑹紫外檢測(cè)器的類型①固定波長(zhǎng)型(已淘汰)；②可變波長(zhǎng)型(最常用)；③二極管陣列檢測(cè)器(最新型)。現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四（2）熒光檢測(cè)器

（fluorescencedetector）

高靈敏度、高選擇性；對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；其結(jié)構(gòu)同熒光分光光度計(jì)。25現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四(3)示差折光檢測(cè)器

（differentialrefractiveindexdetector）除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器；原理：折射率隨介質(zhì)中的成分變化而變化，連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值，差值與濃度呈正比；通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫。26現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四4/8/2023現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四三.液相色譜的固定相與流動(dòng)相1.液相色譜固定相

高效液相色譜固定相以承受高壓能力來(lái)分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以SiO2為基質(zhì)，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在SiO2表面鍵合各種官能團(tuán)，就是鍵合固定相，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5×108Pa。現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型兩大類。表面多孔型：基體是30～40μm實(shí)心玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁等。表面積小，柱容量低。

全多孔型：由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；現(xiàn)采用5～10μm的小顆粒，比表面積和柱容量都很大，是化學(xué)鍵合制備柱填料。29現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四化學(xué)鍵合固定相

化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣；

c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)1）傳質(zhì)快，表面無(wú)深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；2）壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無(wú)固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；3）耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；4）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；5）有利于梯度洗脫；現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四2.液相色譜的流動(dòng)相

(1)流動(dòng)相特性

（a）液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（b）親水性固定相常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液相色譜法，極性柱也稱正相柱。（c）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液相色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反?，F(xiàn)在是32頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四(2)流動(dòng)相類別按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間?，F(xiàn)在是33頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四(3)流動(dòng)相選擇在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四(4)選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收?，F(xiàn)在是35頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四流動(dòng)相應(yīng)具備的條件:理想的流動(dòng)相應(yīng)具備化學(xué)穩(wěn)定性好；對(duì)樣品有較寬的溶解范圍；擴(kuò)散性好即低粘度；沸點(diǎn)適中；與檢測(cè)方法具有好的兼容性；不損壞固定相和儀器；易于獲得純品并且毒性低。4/8/2023現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四四.高效液相色譜法的主要類型離子交換色譜尺寸排阻色譜（凝膠過(guò)濾色譜）親和色譜分配色譜吸附色譜（如反相色譜，疏水作用色譜）現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四1.

液-液分配色譜

基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配系數(shù)不同；固定相：早期涂漬固定液，由于流失，已較少采用；現(xiàn)在應(yīng)用最廣的是化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到擔(dān)體（硅膠）表面的游離羥基上。流動(dòng)相：流動(dòng)相與固定相均為液體，但應(yīng)互不相溶。38現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四

根據(jù)兩相極性程度，分為正相色譜和反相色譜：

正相色譜：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性。流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。

反相色譜：相反，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。反相與正相的出峰順序恰好相反。

39現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四2.液-固吸附色譜

固定相：為固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是硅膠。

流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑?；驹恚航M分在固定相吸附劑上的吸附與脫附。40現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四3.離子交換色譜

固定相：陰離子或陽(yáng)離子交換樹脂；流動(dòng)相：陰離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽(yáng)離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；

基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)；

陽(yáng)離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，包括氨基酸、核酸等。41現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四42現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四5.尺寸排阻色譜（凝膠色譜）

固定相：凝膠具有一定大小孔隙分布。

原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。

可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物進(jìn)行分離43現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四五.液相色譜分離類型的選擇1.根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量選擇相對(duì)分子質(zhì)量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜．標(biāo)準(zhǔn)液相色譜類型（液--固、液--液、及離子交換色譜）最適合的相對(duì)分子質(zhì)量范圍是20O～2000．對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量大于2000的樣品，則用尺寸排阻法為最佳．44現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四(2)根據(jù)溶解度選擇如：樣品可溶于水并屬于能離解物質(zhì)，以采用離子交換色譜為佳；如：樣品可溶于烴類（如苯或異辛烷），則可采用液--固吸附色譜；45現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四（3）根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇例如，酸、堿化合物宜用離子交換色譜；脂肪族或芳香族宜用液--液分配色譜或液--固吸附色譜；異構(gòu)體用液--固吸附色譜；同系物用液--液分配色譜．等等46現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四分離類型選擇總結(jié)，P37047現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀應(yīng)用實(shí)例

氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但是受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)饣虼瞬皇茉嚇訐]發(fā)性的限制。對(duì)于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子量大（大于400）的有機(jī)物原則上都可應(yīng)用高效液相色譜法來(lái)進(jìn)行分離、分析（這些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的75%～80%）。48現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四HPLC的應(yīng)用

1.環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析固定相：薄殼型硅膠流動(dòng)相：正己烷流速：1.5mL/min

色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)

檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器

可對(duì)水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。49現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四2.稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動(dòng)相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC

柱壓：70104Pa

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器50現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有56頁(yè)\編輯于星期四1.從分離原理、儀器構(gòu)造及應(yīng)用范圍上簡(jiǎn)要比較氣相色譜及液相色譜的異同點(diǎn)。解：二者都是根據(jù)樣品組分與流動(dòng)相和固定相相互作用力的差別進(jìn)行分離的。從儀器構(gòu)造上看，液相色譜需要增加高壓泵以提高流動(dòng)相的流動(dòng)速度，克服阻力。同時(shí)液相色譜所采用的固定相種類要比氣相色譜豐富的多，分離方式也比較多樣。氣相色譜的檢測(cè)器主要采用熱導(dǎo)檢測(cè)器、氫焰檢測(cè)器和火焰光度檢測(cè)器等。而液相色譜則多使用紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器及電化學(xué)檢測(cè)器等。但是二者均可與MS等聯(lián)用。二者均具分離能力高、靈敏度高、分析速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)難以用氣相色譜進(jìn)行分析。而只要試樣能夠制成溶液，既可用于HPLC分析，而不受沸點(diǎn)高、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子量大的限制。思考題解答4/8/202351