淀粉酶活性測(cè)定試驗(yàn)報(bào)告

本文格式為Word版，下載可任意編輯——淀粉酶活性測(cè)定試驗(yàn)報(bào)告班級(jí)：植物092姓名：徐煒佳學(xué)號(hào)：0901080223

淀粉酶活性的測(cè)定

一、研究背景及目的

酶是高效催化有機(jī)體新陳代謝各步反應(yīng)的活性蛋白，幾乎所有的生化反應(yīng)都離不開(kāi)酶的催化，所以酶在生物體內(nèi)扮演著極其重要的角色，因此對(duì)酶的研究有著十分重要的意義。酶的活力是酶的重要參數(shù)，反映的是酶的催化能力，因此測(cè)定酶活力是研究酶的基礎(chǔ)。酶活力由酶活力單位表征，通過(guò)計(jì)算適合條件下一定時(shí)間內(nèi)一定量的酶催化生成產(chǎn)物的量得到

淀粉酶是水解淀粉的糖苷鍵的一類酶的總稱，依照其水解淀粉的作用方式，可分為α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的兩種，存在于禾谷類的種子中。β-淀粉酶存在于休眠的種子中，而α-淀粉酶是在種子萌發(fā)過(guò)程中形成的。

α-淀粉酶活性是衡量小麥穗發(fā)芽的一個(gè)生理指標(biāo),α-淀粉酶活性低的品種抗穗發(fā)芽,反之則易穗發(fā)芽。目前,關(guān)于α-淀粉酶活性的測(cè)定方法好多種,活力單位的定義也各不一致,國(guó)內(nèi)外測(cè)定α-淀粉酶活性的方法常用的有凝膠擴(kuò)散法、3,5-二硝基水楊酸比色法和下降值法。這3種方法所用的材料分別是新鮮種子、萌動(dòng)種子和面粉,獲得的α-淀粉酶活性應(yīng)當(dāng)分別是延遲(內(nèi)源)α-淀粉酶、萌動(dòng)種子α-淀粉酶和后熟面粉的α-淀粉酶活性。測(cè)定方法DNS優(yōu)點(diǎn)靈敏、確鑿、確切度高,適合確切測(cè)量小樣品α-淀粉酶活性大小簡(jiǎn)便、快速、省時(shí)、省力,消耗材料和藥品較少,不需要特別儀器,測(cè)定范圍較寬快速、省時(shí)、重現(xiàn)性好、平行性好、消耗的藥品少,適合于測(cè)量大量樣品缺點(diǎn)測(cè)定步驟較繁,不便分析大量樣品,測(cè)定范圍較窄邊界不明了,靈敏度與確鑿度較低,不適合確切測(cè)量α-淀粉酶活性的大小消耗的材料多,間接測(cè)定α-淀粉酶活性大小凝膠擴(kuò)散法下降值法本試驗(yàn)的目的在于把握α-淀粉酶和β-淀粉酶的提取和測(cè)定方法。

二、試驗(yàn)原理

萌發(fā)的種子中存在兩種淀粉酶，分別是α-淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐熱，在高溫下易鈍化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6下則發(fā)生鈍化。本試驗(yàn)的設(shè)計(jì)利用β-淀粉酶不耐熱的特性，在高溫下（70℃）下處理使得β-淀粉酶鈍化而測(cè)定α-淀粉酶的酶活性。

酶活性的測(cè)定是通過(guò)測(cè)定一定量的酶在一定時(shí)間內(nèi)催化得到的麥芽糖的量來(lái)實(shí)現(xiàn)的，淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用3,5-二硝基水楊酸試劑測(cè)定，由于麥芽糖能將后者還原生成硝基氨基水楊酸的顯色基團(tuán)，將其顏色的深淺與糖的含量成正比，故可求出麥芽糖的含量。常用單位時(shí)間內(nèi)生成麥芽糖的毫克數(shù)表示淀粉酶活性的大小。然后利用同樣的原理測(cè)得兩種淀粉酶的總活性。試驗(yàn)中為了消除非酶促反應(yīng)引起的麥芽糖的生成帶來(lái)的誤差，每組試驗(yàn)都做了相應(yīng)的對(duì)照試驗(yàn)，在最終計(jì)算酶的活性時(shí)以測(cè)量組的值減去對(duì)照組的值加以校正。

在試驗(yàn)中要嚴(yán)格控制溫度及時(shí)間，以減小誤差。并且在酶的作用過(guò)程中，四支測(cè)定管及空白管不要混淆。

三、材料、試劑與儀器

試驗(yàn)材料：

萌發(fā)的小麥種子（芽長(zhǎng)1厘米左右）儀器：

722光柵分光光度計(jì)(編號(hào)990695)

DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(編號(hào)L-304056)離心機(jī)(TDL-40B)

容量瓶：50ml×1，100ml×1小臺(tái)秤研缽

具塞刻度試管：15ml×6試管：8支移液器燒杯試劑：

①1%淀粉溶液（稱取1克可溶性淀粉，參與80ml蒸餾水，加熱熔解，冷卻后定容至100ml）；②pH5.6的檸檬緩沖液：

A液（稱取檸檬酸20.01克，溶解后定容至1L）B液（稱取檸檬酸鈉29.41克，溶解后定容至1L）

取A液5.5ml、B液14.5ml混勻即為pH5.5檸檬酸緩沖液；

③3，5-二硝基水楊酸溶液（稱取3，5-二硝基水楊酸1.00克，溶于20ml1M氫氧化鈉中，參與50ml蒸餾水，再參與30克酒石酸鈉，待溶解后，用蒸餾水稀釋至100ml，蓋緊瓶蓋保存）；

④麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（稱取0.100克麥芽糖，溶于少量蒸餾水中，防備移入100ml容量瓶中定容）；

⑤0.4MNaOH

四、試驗(yàn)步驟1.酶液的制備

稱取2克萌發(fā)的小麥種子與研缽中，加少量石英砂，研磨至勻漿，轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，混勻后在室溫下放置，每隔數(shù)分鐘振蕩一次，提取15-20分鐘，于3500轉(zhuǎn)/分開(kāi)心20分鐘，取上清液備用。2.α-淀粉酶活性的測(cè)定

①取4支管，注明2支為對(duì)照管，另2支為測(cè)定管

②于每管中各加酶提取液液1ml，在70℃恒溫水浴中（水浴溫度的變化不應(yīng)超過(guò)±0.5℃）確鑿加熱15min，在此期間β-淀粉酶鈍化，取出后迅速在冰浴中完全冷卻。

③在試管中各參與1ml檸檬酸緩沖液

④向兩支對(duì)照管中各參與4ml0.4MNaOH，以鈍化酶的活性

⑤將測(cè)定管和對(duì)照管置于40℃（±0.5℃）恒溫水浴中確鑿保溫15min再向各管分別參與40℃下預(yù)熱的淀粉溶液2ml，搖勻，馬上放入40℃水浴中確鑿保溫5min后取出，向兩支測(cè)定管分別迅速參與4ml0.4MNaOH,以終止酶的活性，然后準(zhǔn)備下步糖的測(cè)定。3.兩種淀粉酶總活性的測(cè)定

取上述酶液5ml于100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度（稀釋倍數(shù)視樣品酶活性大小而定，一般為20倍）?；旌暇鶆蚝?，取4支管，注明2支為對(duì)照管，另2支為測(cè)定管，各管參與1ml稀釋后的酶液及pH5.6檸檬酸緩沖液1ml，以下步驟重復(fù)α-淀粉酶測(cè)定的第④及第⑤的操作。

4.麥芽糖的測(cè)定⑴標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取15ml具塞試管7支，編號(hào)，分別參與麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml)0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0毫升，用蒸餾水補(bǔ)充至1.0ml，搖勻后再參與3，5-二硝基水楊酸1ml，搖勻，沸水浴中確鑿保溫5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至15ml，搖勻后用分光光度計(jì)于520nm波長(zhǎng)下比色，記錄消光值，以消光值為縱坐標(biāo)，以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。⑵樣品的測(cè)定

取15ml具塞試管8支，編號(hào)，分別參與步驟2和3中各管的溶液各1ml，再參與3，5-二硝基水楊酸1ml，搖勻，沸水浴中確鑿煮沸5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至15ml，搖勻后用分光光度計(jì)于520nm波長(zhǎng)下比色，記錄消光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。

五、數(shù)據(jù)整理及計(jì)算

麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度mg/mlOD520項(xiàng)目OD520平行組數(shù)據(jù)均值OD520樣品麥芽糖濃度mg/ml0α(測(cè))0.1α(測(cè))0.3α(對(duì))0.5α(對(duì))0.7α+β(測(cè))0.9α+β(測(cè))1.0α+β(對(duì))α+β(對(duì))上表中前4行數(shù)據(jù)為試驗(yàn)的原始數(shù)據(jù)。以表中前兩行數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)下頁(yè)），計(jì)算上表中第4行數(shù)據(jù)（各樣品的OD值）均值，填入上第5行中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程，計(jì)算第5行OD值所對(duì)應(yīng)的麥芽糖濃度，填入最終一行，如上表。

根據(jù)以上的數(shù)據(jù)整理的結(jié)果，結(jié)合以下公式計(jì)算兩種淀粉酶的活性：

??淀粉酶活性（毫克麥芽糖·克?1鮮重分鐘·?1）?（A－A'）?樣品稀釋總體積

樣品重（g）?5（B－B'）?樣品稀釋總體積(?????)淀粉酶活性（毫克麥芽糖?克?1鮮重·分鐘?1）?

樣品重（g）?5A——α-淀粉酶測(cè)定管中的麥芽糖濃度

A’——α-淀粉酶對(duì)照管中的淀粉酶的濃度

B——(α-+β-)淀粉酶總活性測(cè)定管中的麥芽糖濃度B’——(α-+β-)淀粉酶總活性對(duì)照管中的麥芽糖濃度計(jì)算結(jié)果如下：

α-淀粉酶活性=（毫克麥芽糖?克-1鮮重?分鐘-1）

(α-+β-)淀粉酶活性=（毫克麥芽糖?克-1鮮重?分鐘-1）β-淀粉酶活性=（毫克麥芽糖?克-1鮮重?分鐘-1）

六、結(jié)果分析

七、思考題

1、酶活力測(cè)定試驗(yàn)的總體設(shè)計(jì)思路是什么？試驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵你認(rèn)為是什么？為什么？答：利用酶的專一性或酶活力的影響因素抑制除待測(cè)酶以外的其它酶活性，通過(guò)測(cè)酶促反應(yīng)的產(chǎn)率推算酶活力大小。

關(guān)鍵在于抑制其它酶的活力而不影響測(cè)定酶，這樣可以減小或避免其它酶產(chǎn)物給測(cè)定結(jié)果帶來(lái)的誤差。

2、本試驗(yàn)最易產(chǎn)生對(duì)結(jié)果有較大誤差影響的操作是哪些步驟？為什么？怎樣的操作策略可以盡量減少誤差？

答：①浸提步驟。70℃溫度或15min時(shí)間控制不嚴(yán)格不確鑿則可能導(dǎo)致β淀粉酶未完全鈍化使測(cè)得活性偏大。應(yīng)嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間。②70℃水浴后需要馬上冰浴，否則β淀粉酶復(fù)性使測(cè)得α淀粉酶活性結(jié)果偏大。③向測(cè)定管中參與NaOH時(shí)應(yīng)迅速，否則酶與底物繼續(xù)反應(yīng)使結(jié)果偏大。

3、?-淀粉酶活性測(cè)定時(shí)70℃水浴為何要嚴(yán)格保溫15分鐘？保溫后為何要馬上于冰浴中驟冷？

答：由于?-淀粉酶不耐熱，在70℃下處理一定時(shí)間可以鈍化，嚴(yán)格保溫15分鐘可以達(dá)到理想的鈍化效果，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，?-淀粉酶活性也會(huì)受到影響；時(shí)間不足，?-淀粉酶鈍化不完全。保溫后馬上驟冷是為了通過(guò)猛烈的溫變改變?-淀粉酶的結(jié)構(gòu)以防止在隨后的反應(yīng)中復(fù)性，這樣就保證了在隨后的40℃溫浴的酶促反應(yīng)中?-淀粉酶不會(huì)再參與催化反應(yīng)。此外我認(rèn)為冰浴使酶迅速降溫，便于嚴(yán)格控制高溫處理時(shí)間的長(zhǎng)短。

4、pH5.6檸檬酸緩沖液的作用？各管于40℃水浴確鑿保溫15分鐘的作用？

答：酶試驗(yàn)體系的pH值變化或變化過(guò)大，會(huì)使酶活性下降甚至完全失活。參與pH5.6的緩沖液調(diào)至酶促反應(yīng)的最適pH，同時(shí)穩(wěn)定溶液的pH不至于在反應(yīng)過(guò)程中大幅波動(dòng)。40℃水浴確鑿保溫15分鐘為調(diào)整酶促反應(yīng)的最適溫度

5、眾多測(cè)定淀粉酶活力的試驗(yàn)設(shè)計(jì)中一般均采取鈍化?-淀粉酶的活力而測(cè)?-淀粉酶和測(cè)總酶活力的策略，為何不采取鈍化?-淀粉酶活力去測(cè)?-淀粉酶活力呢？這種設(shè)計(jì)思路說(shuō)明什么？

答：β淀粉酶與α淀粉酶的催化特性是有差異的。β淀粉酶主要作用于直鏈淀粉的α-1，4-糖苷鍵，而且僅從淀粉分子外圍的非還原性末端開(kāi)始，切斷至α-1,6-鍵的前面反應(yīng)就中止了；而α淀粉酶則無(wú)區(qū)別地作用于直鏈淀粉與支鏈淀粉的α-1，4-糖苷鍵，所以β淀粉酶需要α淀粉酶淀粉支鏈的α-1，4-糖苷鍵后才能完全表達(dá)其催化能力。此外我認(rèn)為在試驗(yàn)中溫度比酸度更易控制，鈍化α淀粉酶難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于β淀粉酶，而且若提高酸度鈍化α淀粉酶，則回調(diào)最適pH時(shí)α淀粉酶也有可能由于復(fù)性恢復(fù)活力。

這種設(shè)計(jì)思路說(shuō)明在測(cè)定酶的比活力時(shí)要綜合考慮各種可能出現(xiàn)的酶的性質(zhì)以及它們之間的聯(lián)系，也要考慮到試驗(yàn)操作的可行性。

6、本試驗(yàn)中所設(shè)置的對(duì)照管的作用？它與比色法測(cè)定物質(zhì)含量試驗(yàn)中設(shè)置的空白管有何異同？本試驗(yàn)可否用對(duì)照管調(diào)分光光度計(jì)的100%T？為什么？

答：消除非酶促反應(yīng)（如淀粉酸性環(huán)境下加熱水解）和非測(cè)定時(shí)間內(nèi)的酶促反應(yīng)引起的麥芽糖的生成帶來(lái)的誤差。

兩種都是為了消除非測(cè)定部分對(duì)光的吸收，空白組是為了消除溶液中溶劑等其它組分對(duì)光的吸收，而對(duì)照管是為了消除非測(cè)量所需反應(yīng)所得的多余溶質(zhì)對(duì)光的吸收。

不可，由于標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定是在空白的基礎(chǔ)上的，得到的是OD值與麥芽糖含量的關(guān)系