第二章微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)

培養(yǎng)物（culture）：在微生物學(xué)中，在人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)、繁殖得到的微生物群體稱為培養(yǎng)物。純培養(yǎng)物（pureculture）：只有一種微生物的培養(yǎng)物稱為純培養(yǎng)物。

純培養(yǎng)技術(shù)是進行微生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，是微生物學(xué)的基本技術(shù)之一。顯微技術(shù)是進行微生物研究的另一項重要技術(shù)。正是由于顯微技術(shù)和純培養(yǎng)技術(shù)的建立，才使我們得以認識豐富多彩的微生物世界，對其真正研究，使其發(fā)展為一門學(xué)科?，F(xiàn)在是1頁\一共有62頁\編輯于星期四第一節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)第二節(jié)顯微鏡和顯微技術(shù)第三節(jié)顯微鏡下的微生物現(xiàn)在是2頁\一共有62頁\編輯于星期四第一節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)一、無菌技術(shù)（aseptictechnique）

1、概念：在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時防止其被其他微生物污染，其自身也不污染操作環(huán)境的技術(shù)。

2、方法：器具、培養(yǎng)基及其滅菌接種操作——無菌操作現(xiàn)在是3頁\一共有62頁\編輯于星期四現(xiàn)在是4頁\一共有62頁\編輯于星期四現(xiàn)在是5頁\一共有62頁\編輯于星期四固體培養(yǎng)基是用瓊脂或其他凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基。

細菌的固體培養(yǎng)特征：

菌落（colony）：分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞生長群體，稱為菌落。每個菌落一般是由單個微生物活體細胞生長、繁殖形成的純培養(yǎng)物。二、用固體培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)現(xiàn)在是6頁\一共有62頁\編輯于星期四菌落特征：有光滑型、粗糙型和粘液型三種。如濕潤、較光滑、較透明、較粘稠、易挑起、質(zhì)地均勻、菌落正反面及邊緣與中央部分的顏色一致。生物學(xué)意義：不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落（或菌苔）一般都具有穩(wěn)定的特征，是微生物分類鑒定的指征之一。

菌苔（lawn）：當(dāng)固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時，便成為菌苔（lawn）。現(xiàn)在是7頁\一共有62頁\編輯于星期四菌落現(xiàn)在是8頁\一共有62頁\編輯于星期四現(xiàn)在是9頁\一共有62頁\編輯于星期四

目前實驗室常用固體培養(yǎng)基獲得微生物純培養(yǎng)物的幾種方法：1、涂布平板法（spreadplatemethod)2、稀釋倒平板法(pourplatemethod，50℃左右)3、平板劃線法(streakplatemethod)（如四區(qū)劃線）4、稀釋搖管法(shaketubemethod)現(xiàn)在是10頁\一共有62頁\編輯于星期四涂布平板法與稀釋倒平板法12現(xiàn)在是11頁\一共有62頁\編輯于星期四平板劃線法現(xiàn)在是12頁\一共有62頁\編輯于星期四稀釋搖管法（分離厭氧菌）現(xiàn)在是13頁\一共有62頁\編輯于星期四三、用液體培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)---稀釋法適用于一些個體大的細菌、許多原生動物和藻類等。通過高度稀釋，使一支試管中分配不到一個微生物。同一個稀釋度應(yīng)有較多的平行試管。四、單細胞（孢子）分離---顯微分離法對操作技術(shù)要求較高，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個微生物細胞或孢子以獲得純培養(yǎng)?，F(xiàn)在是14頁\一共有62頁\編輯于星期四1、選擇平板培養(yǎng)根據(jù)待分離微生物的特點選擇不同的培養(yǎng)條件（對于從自然界中分離、尋找有用的微生物十分重要，如從土壤中篩選蛋白酶產(chǎn)生菌，分離高溫菌，分離某種抗菌素抗性菌株）

2、富集培養(yǎng)加富性選擇培養(yǎng)基（投其所好）--對羥基苯甲酸抑制性選擇培養(yǎng)基（取其所抗）--致病性腸道桿菌五、選擇培養(yǎng)現(xiàn)在是15頁\一共有62頁\編輯于星期四現(xiàn)在是16頁\一共有62頁\編輯于星期四六、微生物的保藏技術(shù)菌種保藏就是根據(jù)菌種特性及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，使其存活而得以延續(xù)。

保藏的方法：傳代培養(yǎng)保藏4℃

冷凍保藏-196℃，-70℃，-30～-20℃

干燥保藏法沙土管，安瓿管（冷凍真空干燥保藏，最普遍最重要）現(xiàn)在是17頁\一共有62頁\編輯于星期四第二節(jié)顯微鏡和顯微技術(shù)

絕大多數(shù)微生物的大小都遠遠低于肉眼的觀察極限，因此一般必須借助顯微鏡放大系統(tǒng)的作用，才能看到它們的個體形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。除了放大外，決定顯微觀察效果的還有兩個重要因素，分辨率和反差。分辨率是指能辨別兩點之間最小距離的能力，而反差是指樣品區(qū)別于背景的程度，它們與顯微鏡的自身特點有關(guān)，也取決于進行顯微觀察時對顯微鏡的正確使用以及良好的標本制作和觀察技術(shù)，這就是顯微技術(shù)。現(xiàn)在是18頁\一共有62頁\編輯于星期四現(xiàn)代顯微技術(shù)不僅僅是觀察物體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，而且發(fā)展到對物體的組成成分的定性和定量，特別是與計算機技術(shù)結(jié)合出現(xiàn)的圖像分析、模擬仿真等技術(shù)，為探索微生物的奧秘提供了強大武器?，F(xiàn)在是19頁\一共有62頁\編輯于星期四一、顯微鏡的種類及原理

1、普通光學(xué)顯微鏡現(xiàn)在是20頁\一共有62頁\編輯于星期四現(xiàn)在是21頁\一共有62頁\編輯于星期四2、暗視野顯微鏡現(xiàn)在是22頁\一共有62頁\編輯于星期四3、相差顯微鏡4、熒光顯微鏡（激光共聚焦顯微鏡）現(xiàn)在是23頁\一共有62頁\編輯于星期四5、透射電子顯微鏡現(xiàn)在是24頁\一共有62頁\編輯于星期四6、掃描電子顯微鏡

7、掃描隧道顯微鏡現(xiàn)在是25頁\一共有62頁\編輯于星期四二、顯微觀察樣品的制備

1、光學(xué)顯微鏡的制樣（1）活體觀察：壓滴法懸滴法菌絲埋片法（玻璃紙，涂布放線菌或霉菌孢子懸液，培養(yǎng)，鏡下）現(xiàn)在是26頁\一共有62頁\編輯于星期四（2）染色觀察死菌細菌染色法正染色簡單染色法鑒別染色法抗酸染色法革蘭染色法芽孢染色法姬姆薩染色法負染色：莢膜染色法等活菌：用美藍或TTC（氧化三苯基四氮唑）等做活菌染色現(xiàn)在是27頁\一共有62頁\編輯于星期四現(xiàn)在是28頁\一共有62頁\編輯于星期四革蘭染色法（GramStain)現(xiàn)在是29頁\一共有62頁\編輯于星期四2、電子顯微鏡的制樣

（1）透射電鏡的樣品制備

1）負染技術(shù)

2）投影技術(shù)

3)超薄切片技術(shù)：取材→固定→脫水→浸透與包埋→切片→撈片→染色→觀察現(xiàn)在是30頁\一共有62頁\編輯于星期四現(xiàn)在是31頁\一共有62頁\編輯于星期四（2）掃描電鏡的樣品制備

利用電子束作光柵狀掃描以取樣品的形貌信息。主要要求樣品干燥，且表面能夠?qū)щ姟８稍锓椒ǎ鹤匀桓稍镎婵崭稍锢鋬龈稍锱R界點干燥等現(xiàn)在是32頁\一共有62頁\編輯于星期四第三節(jié)顯微鏡下的微生物微生物：細胞型：凡具有細胞形態(tài)的微生物非細胞型：細胞型微生物：細菌（Bacteria)

古生菌（Archaea）真核生物（Eukarya）現(xiàn)在是33頁\一共有62頁\編輯于星期四定義：以二分裂為主要繁殖方式的單細胞原核微生物。

1、細菌的形態(tài)和排列三種基本形態(tài)：球狀：一個分裂面、兩個分裂面、三個分裂面、無定向分裂面

桿狀：單桿、鏈桿、柵狀、八字

螺旋狀：弧菌、螺旋菌一、細菌現(xiàn)在是34頁\一共有62頁\編輯于星期四現(xiàn)在是35頁\一共有62頁\編輯于星期四單球菌細胞分裂沿一個平面進行，新個體分散而單獨存在。如尿素微球菌現(xiàn)在是36頁\一共有62頁\編輯于星期四雙球菌細胞沿一個平面分裂，新個體成對排列。如肺炎鏈球菌現(xiàn)在是37頁\一共有62頁\編輯于星期四四聯(lián)球菌細胞分裂是沿兩個相垂直的平面進行，分裂后每四個細胞特征性地連在一起，成田字形。如四聯(lián)微球菌現(xiàn)在是38頁\一共有62頁\編輯于星期四鏈球菌細胞沿一個平面進行分裂，新個體不但可保持成對的樣子，并可連成鏈狀。如乳鏈球菌、無乳鏈球菌、溶血性鏈球菌現(xiàn)在是39頁\一共有62頁\編輯于星期四八疊球菌細胞按三個互相垂直的平面進行分裂后，每八個球菌特征性地連在一起形成立方體形。如藤黃八疊球菌現(xiàn)在是40頁\一共有62頁\編輯于星期四葡萄球菌細胞無定向分裂，多個新個體形成一個不規(guī)則的群體，猶如一串葡萄。如金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌現(xiàn)在是41頁\一共有62頁\編輯于星期四桿菌桿菌的基本形態(tài)短桿狀、長桿狀、棒桿狀、梭狀桿狀、月亮狀、竹節(jié)狀、分枝狀等；按桿菌細胞繁殖后的排列方式則有鏈狀、柵狀、“八”字狀等桿菌細胞的排列方式鏈狀、柵狀、八字狀、鞘衣包裹的絲狀等現(xiàn)在是42頁\一共有62頁\編輯于星期四短桿狀長桿狀梭狀芽孢菌現(xiàn)在是43頁\一共有62頁\編輯于星期四螺旋菌根據(jù)螺旋環(huán)的數(shù)目將螺旋狀細菌分為：弧菌：螺菌：2~6環(huán)的小型堅硬的螺旋狀細菌，有鞭毛，靠鞭毛運動。螺旋體：高于6環(huán)，體長而柔軟的螺旋狀細菌，無鞭毛，靠周質(zhì)間軸絲伸縮運動?，F(xiàn)在是44頁\一共有62頁\編輯于星期四現(xiàn)在是45頁\一共有62頁\編輯于星期四其他形態(tài)：柄細菌球衣菌支原體星型細菌細菌的菌落特征：表面濕潤，小而突起或大而平坦、易挑起現(xiàn)在是46頁\一共有62頁\編輯于星期四柄細菌球衣菌支原體星型細菌現(xiàn)在是47頁\一共有62頁\編輯于星期四現(xiàn)在是48頁\一共有62頁\編輯于星期四現(xiàn)在是49頁\一共有62頁\編輯于星期四現(xiàn)在是50頁\一共有62頁\編輯于星期四細菌的形態(tài)受溫度、pH、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)時間等因素影響很大。一般是細菌在適宜的生長條件下培養(yǎng)8~18h時形態(tài)比較典型，在不利環(huán)境或菌齡老時常出現(xiàn)梨形、氣球狀和絲狀等不規(guī)則的多形性（polymorphism），稱為衰退型（involutionform）。因此，觀察細菌的大小和形態(tài)，應(yīng)選擇其適宜生長條件下的對數(shù)期為宜?，F(xiàn)在是51頁\一共有62頁\編輯于星期四2、古生菌與細菌類似的個體形態(tài)，但多生活于一些生存條件十分惡劣的極端環(huán)境中，如高鹽、高溫、高酸等。如“121株”能在121℃的條件下繁殖。現(xiàn)在是52頁\一共有62頁\編輯于星期四現(xiàn)在是53頁\一共有62頁\編輯于星期四3、原核生物的細胞大小細菌大小量度單位：微米（μm）亞細胞構(gòu)造的量度單位：納米（nm）常見細菌的大小：球菌：直徑0.5~1.0μm桿菌：寬×長0.5~1.0×1.0~5.0μm螺形菌：寬×長0.5~1.0×1.0~50μm現(xiàn)在是54頁\一共有62頁\編輯于星期四現(xiàn)在是55頁\一共有62頁\編輯于星期四最小和最大的細菌最小的細菌：納米細菌，細胞直徑最小為50nm，甚至比最大的病毒更小一點。最大的細菌：一種硫磺細菌，其大小一般在0.1~0.3mm，但有些可達0.75mm，相當(dāng)于果蠅頭部的大小，能夠清楚地用肉眼看到。命名為Thiomargaritanamibiensis，即“納米比亞硫磺珍珠菌”?，F(xiàn)在是56頁\一共有62頁\編輯于星期四圖中箭頭所指的是直徑在0.5mm的一個Thiomargaritanamibiensis菌體，其