微生物遺傳育種

微生物遺傳育種第1頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四遺傳和變異的概念遺傳和變異是生物體最本質(zhì)的屬性之一。遺傳性是指生物的親代傳遞給子代一套遺傳信息的特性。生物體所攜帶的全部遺傳因子或基因的總稱，即遺傳型（genotype）。只有遺傳型的改變，即生物體遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)上發(fā)生的變化，才稱為變異。但一旦發(fā)生后，變異形狀是穩(wěn)定的，可遺傳的。第2頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四遺傳和變異的概念微生物的變異（variation）即是微生物子代的表型特征與其親代的表型特征發(fā)生較大的差異，這種差異是由于子代的基因發(fā)生了突變（mutation）所引起的，即遺傳物質(zhì)DNA或RNA病毒和噬菌體中的RNA中的核苷酸序列發(fā)生了一種穩(wěn)定的和可遺傳的變化。第3頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)什么是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，在歷史上曾經(jīng)存在爭論。通過3個(gè)經(jīng)典的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，證明核酸（細(xì)胞生物里是DNA）是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)。

細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)噬菌體感染實(shí)驗(yàn)病毒重建實(shí)驗(yàn)第4頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四1、細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第5頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第6頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四2、噬菌體感染實(shí)驗(yàn)

第7頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四病毒重建實(shí)驗(yàn)P126

第8頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)噬菌體感染實(shí)驗(yàn)病毒重建實(shí)驗(yàn)____________________________________上述實(shí)驗(yàn)證明是DNA攜帶遺傳信息第9頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四

DNA的結(jié)構(gòu)第10頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第11頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四中心法則第12頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四5.2微生物的基因和基因組基因的概念

基因是一段具有特定功能和結(jié)構(gòu)的連續(xù)的DAN片斷，是編碼蛋白質(zhì)或RNA分子遺傳信息的基本遺傳單位。第13頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四原核生物基因組和真核生物基因組的比較1351、真核生物基因組還包括葉綠體、線粒體的基因組。2、原核生物的細(xì)胞中除了主染色體以外，還含有各種質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座因子。質(zhì)粒常為雙鏈環(huán)狀DNA，可獨(dú)立復(fù)制，有的既可以游離于細(xì)胞質(zhì)中，也可以整合到染色體上。轉(zhuǎn)座因子一般都是整合在基因組中。3、原核生物的染色體分子量較小，基因組含有大量單一順序（unique-sequences），DNA僅有少量的重復(fù)順序和基因。

真核生物基因組存在大量的非編碼序列。包括：內(nèi)含子和外顯子、基因家族和假基因、重復(fù)DNA序列。

5.2微生物的基因和基因組第14頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四5.2微生物的基因和基因組第15頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第16頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四5.3質(zhì)粒質(zhì)粒的概念一般指細(xì)菌真菌等微生物細(xì)胞中、獨(dú)立于染色體外、能進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳因子。第17頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四

5.3質(zhì)粒

5.3.2質(zhì)粒的命名P138

1976年Novick等人提出并逐漸形成了一個(gè)可為質(zhì)粒研究者普遍接受和遵循的命名原則，主要包括以小寫p代表質(zhì)粒，p后面的大寫字母用來描述質(zhì)粒，或代表最早分離者，或重新構(gòu)建人。大寫字母之后的數(shù)字以識(shí)別特定的結(jié)構(gòu)。在質(zhì)粒進(jìn)一步改造后，以不同的數(shù)字指出它的變化。如質(zhì)粒pBR322，構(gòu)建者為BoliVer和Rodriguer，取其第一個(gè)字母BR，數(shù)字為衍生質(zhì)粒數(shù)(或編號(hào))，這樣就構(gòu)成pBR322。而pBR325則代表氯霉素抗性基因的插人，新的數(shù)字以區(qū)別原來的322。第18頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四5.3質(zhì)粒

5.3.3質(zhì)粒的檢測(cè)P139第19頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四5.3質(zhì)粒5.3.3質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與類型

P140

第20頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四5.4基因突變與遺傳育種

1、突變突變的概念。P143第21頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四突變包括基因突變（genemutation）或稱點(diǎn)突變（pointmutation）和染色體畸變（chromosomalaberration）兩大類型。

基因突變是由于DNA（或RNA病毒的RNA）鏈上的一對(duì)或少數(shù)幾對(duì)堿基被另一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)堿基對(duì)取代發(fā)生改變的突變類型。

染色體畸變則是DNA鏈上大段發(fā)生變化或損傷所引起的突變類型。這里包括染色體DNA鏈上的插入（insertion）、缺失（deletion）、重復(fù)（duplication）、易位（translocation）、倒位（inversion）等。

第22頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四2、突變的幾種常見形式

第23頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四5.4基因突變與遺傳育種

微生物突變的表型：(1)形態(tài)突變型

(2)

致死突變型

(3)

條件致死突變型

(4)生化突變型微生物突變的效應(yīng)：(1)同義突變

(2)

錯(cuò)義突變

(3)

無義突變型5.4.1.1基因突變的類型P144

第24頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四5.4.1.2遺傳學(xué)上常用的幾個(gè)突變株P(guān)272營養(yǎng)缺陷突變株溫度敏感突變株抗性突變株這幾種突變株都相對(duì)容易分離。第25頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四5.4.1.4突變與育種

P148微生物基因的突變可以是自發(fā)發(fā)生（自發(fā)突變）和人工創(chuàng)造環(huán)境促使發(fā)生（誘變）。自發(fā)突變：發(fā)生頻率極低。

誘變：可大大提高突變發(fā)生的頻率，可定向篩選加速獲得符合研究目標(biāo)的遺傳性狀。第26頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四組氨酸營養(yǎng)缺陷型的突變非誘變（少量自發(fā)突變）誘變后突變株大大增加第27頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四1、誘變與誘變劑的概念。

凡能提高突變率的任何理化因子都可稱為誘變劑（mutagen）。2、常用的誘變方式。

誘變劑可包括堿基類似物，可與DNA堿基直接起化學(xué)反應(yīng)的亞硝酸、羥胺和烷化劑等，紫外線、X射線、γ射線、快中子等等射線，熱處理等，還有一些來自于其他微生物的DNA片段、轉(zhuǎn)座子等生物因子等都可誘發(fā)突變。第28頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四物理誘變和化學(xué)誘變。物理誘變：紫外線、X射線、γ射線、快中子、β射線等物理因素引起突變的產(chǎn)生主要是對(duì)DNA產(chǎn)生作用。常用紫外線照射，由于DNA對(duì)波長254nm的紫外線有強(qiáng)烈的吸收作用，所以DNA對(duì)紫外線十分敏感?；瘜W(xué)誘變：亞硝酸、羥胺、亞硝基呱等。誘變的機(jī)理：（1）通過滲入DNA分子而引起突變。（2）通過和DNA直接反應(yīng)而引起突變。（3）通過一對(duì)核苷酸的插入或缺失而引起的突變。第29頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第30頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第31頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四測(cè)定化學(xué)物質(zhì)誘變性（致畸致癌性）的埃姆斯實(shí)驗(yàn)第32頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四組氨酸營養(yǎng)缺陷型的突變非誘變（少量自發(fā)突變）誘變后突變株大大增加第33頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四3、誘變?cè)谖⑸镉N中的重要作用。

是傳統(tǒng)的提高微生物菌株生產(chǎn)性能的方法。紫外線誘變與化學(xué)誘變。突變率與回復(fù)突變。第34頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四誘變的特點(diǎn)第35頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)移和重組遺傳重組和突變的區(qū)別。細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)移和重組對(duì)于細(xì)菌的進(jìn)化非常重要。細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)移和重組的方式。轉(zhuǎn)化作用。轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。接合作用。第36頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)移和重組1、轉(zhuǎn)化（Transformation）轉(zhuǎn)化是從周圍培養(yǎng)基吸收游離的DNA片段，整合到自己染色體基因組的結(jié)果。第37頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)移和重組

2、轉(zhuǎn)導(dǎo)

(Transduction)通過缺陷型噬菌體的媒介，把供體細(xì)胞的DNA片斷攜帶到受體細(xì)胞中，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。

第38頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第39頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)移和重組3、接合(conjugation)

接合是指通過質(zhì)粒使遺傳物質(zhì)在兩個(gè)細(xì)菌細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的機(jī)制。第40頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四接合第41頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)菌接合第42頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四F+F-F+F-F+F+F+F+第43頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四接合示意圖第44頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)接合第45頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四微生物的雜交育種一般指兩個(gè)不同基因型的菌株通過接合使遺傳物質(zhì)重組，得到新的菌株第46頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四接合示意圖第47頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四原生質(zhì)體融合：人為方法使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融和，并產(chǎn)生重組子的過程。第48頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四5.5基因工程（重組DNA技術(shù)）

基因工程的核心即體外重組DNA技術(shù)。第49頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四基因工程的基本步驟主要有包括：①目的基因的制取；②基因載體的選擇與構(gòu)建；③目的基因與載體DNA的拼接；④重組體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，篩選和無性繁殖（克?。虎萃庠椿虻谋磉_(dá)和產(chǎn)物的分離純化。第50頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四一、目的基因克隆

5.5基因工程（重組DNA技術(shù)）

第51頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四二、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用載體。P162質(zhì)粒：質(zhì)粒作為載體的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。噬菌體：噬菌體作為載體的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。其它載體，如動(dòng)物病毒等。8.5基因工程（重組DNA技術(shù)）

第52頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四

載體經(jīng)常需要用抗生素抗性基因或色素基因進(jìn)行標(biāo)記目的基因連接到載體上第53頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四Transformedcell第54頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四三、克隆子的篩選和鑒定1、篩選在構(gòu)建文庫之后就需要從眾多的克隆中，篩選出含有目的基因的重組體。載體經(jīng)常需要用抗生素抗性基因或色素基因進(jìn)行標(biāo)記，以利于篩選。2、鑒定鑒定其正確性。這通常有三種鑒定方法：一是重組體表型特征的鑒定，二是重組DNA分子結(jié)構(gòu)特征的鑒定，三是外源基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定。載體上的抗生素抗性標(biāo)記第55頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第56頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四基因工程基本操作示意圖

第57頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四基因工程技術(shù)生產(chǎn)口蹄疫病毒疫苗第58頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四

DNA的人工合成和擴(kuò)增

1、DNA的人工合成。2、DNA的人工細(xì)胞外擴(kuò)增：PCR技術(shù)。PCR技術(shù)的概念。

PCR每一循環(huán)的基本步驟：變性、退火、延伸。PCR技術(shù)的重要性。第59頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四PCR（polymerasechainreaction）

是體外酶促合成特異DNA片段的新方法，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成：即在高溫（95℃）下，待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；而后在低溫（37～55℃）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72℃）下，以引物3’端為合成的起點(diǎn)，以單核苷酸為原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經(jīng)過一次解鏈、退火、延伸三個(gè)步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。

如此反復(fù)進(jìn)行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增一倍，PCR產(chǎn)物得以2n的批數(shù)形式迅速擴(kuò)增，經(jīng)過25～30個(gè)循環(huán)后，理論上可使基因擴(kuò)增109倍以上，實(shí)際上一般可達(dá)106～107倍。

第60頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四PCR技術(shù)的基本原理PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。(Plateau)。第61頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四

PCR擴(kuò)增步驟第62頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第63頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四

PCR擴(kuò)增方式一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘第64頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四PCR擴(kuò)增

方式一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘第65頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四PCR儀第66頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四PCR技術(shù)的應(yīng)用

PCR技術(shù)具有十分廣泛的實(shí)際用途：

①可用于DNA的擴(kuò)增和克隆，制備單鏈或雙鏈DNA探針；也可用于定位誘變和DNA測(cè)序。②在臨床醫(yī)學(xué)上可用于檢測(cè)病原體，診斷遺傳病，以及對(duì)癌基因的分析確定。③用于微生物分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析，以確定分類地位。當(dāng)用多對(duì)引物進(jìn)行PCR時(shí)，可得到對(duì)個(gè)體特定的條帶圖譜，稱為指紋圖譜（DNAfingerprinting）。DNA指紋圖譜能確定個(gè)體間的血緣關(guān)系。

由于PCR技術(shù)操作簡單、實(shí)用性強(qiáng)、靈敏度高，并可自動(dòng)化，因而在分子生物學(xué)、基因工程研究，微生物分子系統(tǒng)學(xué)以及臨床醫(yī)學(xué)、法醫(yī)和檢疫等領(lǐng)域得到日益廣泛的應(yīng)用。第67頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四PCR技術(shù)的應(yīng)用

PCR技術(shù)具有十分廣泛的實(shí)際用途：

①可用于DNA的擴(kuò)增和克隆，制備單鏈或雙鏈DNA探針；也可用于定位誘變和DNA測(cè)序。②在臨床醫(yī)學(xué)上可用于檢測(cè)病原體，診斷遺傳病，以及對(duì)癌基因的分析確定。③用于微生物分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析，以確定分類地位。當(dāng)用多對(duì)引物進(jìn)行PCR時(shí)，可得到對(duì)個(gè)體特定的條帶圖譜，稱為指紋圖譜（DNAfingerprinting）。DNA指紋圖譜能確定個(gè)體間的血緣關(guān)系。

第68頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四PCR技術(shù)的應(yīng)用

PCR技優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、實(shí)用性強(qiáng)、靈敏度高，并可自動(dòng)化。

應(yīng)用領(lǐng)域：

分子生物學(xué)

基因工程研究

微生物分子系統(tǒng)學(xué)

臨床醫(yī)學(xué)

法醫(yī)

檢疫。第69頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四PCR技術(shù)可靈敏檢測(cè)微生物第70頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四

微生物菌種的衰退、復(fù)壯和保存方法一、微生物菌種的衰退定義：衰退的防止：（1）控制傳代次數(shù)（2）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件（3）利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行接種傳代（4）采用有效的菌種保藏方法第71頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四二、復(fù)壯

1.純種分離：平板劃線分離培養(yǎng)、稀釋傾注平板分離培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和單細(xì)胞分離培養(yǎng)。

2.通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯

3.淘汰已衰退的個(gè)體第72頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四三、菌種的保藏

菌種保存方法原則：不死亡、不變異、沒有雜菌污染。挑選典型菌種的優(yōu)良純種，最好是休眠體，例如分生孢子、芽孢等；創(chuàng)造一個(gè)最有利休眠或降低代謝的環(huán)境條件，例如干燥、低溫、缺氧、避光。

第73頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四三、菌種的保藏1、低溫保存（冰箱保藏）法

溫度下降，微生物代謝活動(dòng)降低；用于微生物短期保藏（除嗜冷微生物外）。

在瓊脂斜面上——（細(xì)菌、霉菌、酵母）保藏期3~6月；

在半固體中——2~5℃（細(xì)菌、酵母）保藏期6~12月；

第74頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四三、菌種的保藏2、冰凍真空干燥保存菌種→保護(hù)劑→滴數(shù)滴無菌菌種玻管→-40℃冰箱中凍結(jié)→低溫高真空干燥→封口→室溫或低溫保存數(shù)年。第75頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四三、菌種的保藏3、超低溫冰箱保存。

－80℃超低溫冰箱，可以長期保存菌種4、液氮超低溫保存。液氮的溫度可達(dá)-196℃