基因工程原理習題

本文格式為Word版，下載可任意編輯——基因工程原理習題1、假使從一個原核生物中cloning某基因（1-2kb），請談談它的基本步驟？

①限制性內(nèi)切酶切割外源DNA和載體②將外源DNA片段與載體連接③轉化④篩選2、什么叫基因工程（GeneEngineering），試從理論和技術兩個方面談談GeneEngineering誕生的基礎？

基因工程：在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒

或其它載體分子，構成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之參入到原來沒有這類分子的宿主細胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖。

理論基礎：近幾十年來，由于受到分子生物學、分子遺傳學發(fā)展的影響，基因分子生物學的研究取得了前所未有的進步。而這些學科的綜合成就，又為基因工程的誕生奠定了堅實的理論基礎：①在40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，從而明確了遺傳的物質(zhì)基礎問題；

②在50年代透露了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保存復制機理，解決了基因的自我復制和傳遞的問題；

③在50年代末期和60年代，相繼提出了\中

心法則\和操縱子學說，并成功地破譯了遺傳密碼，從而說明了遺傳信息的流向和表達問題。技術基礎：

①60年代-70年代，限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶解決了對DNA分子進行體外的切割和連接；②基因克隆載體的出現(xiàn)

③大腸桿菌轉化體系的建立

④60年代發(fā)展的瓊脂糖凝膠電泳和Southern轉移雜交技術對DNA片段的分開和檢測十分有用。3、基因克隆、基因操作、基因重組、基因工程的概念及其相互聯(lián)系。

基因克?。℅enecloning）：是指對基因進行分離和擴大繁殖等操作過程，其目的在于獲得大量的基因拷貝，在技術上主要包括載體構建、大腸桿菌遺傳轉化、重組子篩選和擴大繁殖等環(huán)節(jié)?；蚬こ蹋菏峭ㄟ^基因操作，將目的基因或DNA片段與適合的載體連接轉入目標生物細胞，通過復制、轉錄、翻譯外源目的基因以及蛋白質(zhì)的活性表達，使轉基因生物獲得新的遺傳性狀的操作?；虿僮鳎簩蜻M行分開、分析、改造、檢測、表達、重組和轉移等操作的總稱。

基因重組：不同來源DNA分子通過共價連接（磷

酸二酯鍵）而組合成新的DNA分子的過程。它們的相互關系：基因工程是通過基因重組實

現(xiàn)的，但基因重組并不都是嚴格意義上的基因工程，基因重組是基因操作范疇的概念，包括試驗研究和生物技術的基因重組事件，而基因工程則專指為實踐應用而進行的重組事件?；虿僮魇腔蚬こ痰募夹g基礎；基因克隆好多時候并不涉及遺傳的改良。4、為什么說基因工程是生物學和遺傳學發(fā)展的必然產(chǎn)物？

生物學和遺傳學發(fā)展到現(xiàn)在無非就是向兩個方向發(fā)展，宏觀和微觀的，宏觀發(fā)展無非就性狀研究，外觀特征等，而微觀方面就是像小分子方向基因，蛋白等方面發(fā)展，而研究和鏈接這兩方面的橋梁就基因工程技術。

其次章分子克隆工具酶

1、限制性內(nèi)切酶可劃分為哪幾個類型，各自有何特點？

根據(jù)酶的結構、作用的不同，可將限制性

內(nèi)切酶分為三種類型。Ⅱ型限制性內(nèi)切酶具有高度特異性的DNA裂解點,而Ⅰ型和Ⅲ型兼有修飾（甲基化）作用和依靠于ATP的活性，但不能在識別序列上直接裂解DNA，故用途較少。因此，Ⅱ型限制性內(nèi)切酶是基因工程和基因診斷中重要的工具酶，尋常不特別說明的即為Ⅱ型限制性內(nèi)切酶。

2、哪些酶可用于DNA片段的末端標記？

KlenowDNA聚合酶和T4或T7DNA聚合酶在對DNA片段進行末端補平反應或末端的置換反應時可引入標記的核苷酸。

3、DNA聚合酶有哪些類型，各有什么活性？①E.coliDNApolI：5’-3’DNA聚合酶活性；5’-3’DNA外切酶活性；3’-5’DNA外切酶活性。心相印圖文工作室整理luqiu9102/4

②E.coliDNApolI大片段（Klenow酶）：5′→3′

DNA聚合酶活性；3′→5′DNA外切酶活性；5’-3’DNA外切酶活性。

③T4噬菌體DNApol：5′→3′DNA聚合酶活性（與Ｋlenow酶相像）；3′→5′外切酶活性（Ｋlenow酶×200）：在無dNTP時只有該活性。（常用于填平dsDNA的3′縮進末端及水解dsDNA的3′突出末端。）

④T7噬菌體DNApol及測序酶：5′→3′DNA聚合酶活性;3′→5′外切酶活性（Ｋlenow酶×

1000）。

⑤耐熱DNA聚合酶（Taq酶）：在高溫下仍具活性的DNA聚合酶。5′→3′DNA聚合酶活性；5’-3’DNA外切酶活性。

⑥反轉錄酶（依靠于RNA的DNApol）：5’→3’DNA聚合酶活性(需Mg

2+）；RNaseH活性（5’→3’及3’→5’RNA外切核酸酶活性)；

⑦末端轉移酶（terminaltransferase）（DNA修飾酶）：不依靠于模板的DNA聚合酶，在二價陽離子存在下，催化dNTP加在DNA分子的3′-OH端。4、在分子克隆中所用的酶主要作用于哪些底物？限制性內(nèi)切酶（又稱內(nèi)切限制酶或限制酶）作用底物：識別和切割雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸序列。

連接酶作用底物：將雙螺旋DNA分子的某一條鏈上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈缺口封閉起來。

修飾酶作用底物：能催化稀有堿基參入RNA或

DNA，或?qū)υ袎A基進行修飾，以防止限制性內(nèi)切酶的破壞。

第三章分子克隆

1、何為載體?一個理想的載體應具備那些特點？將外源DNA或基因攜帶入宿主細胞（hostcell）的工具稱為載體載體具備的特點：

①在宿主細胞內(nèi)必需能夠自主復制（具備復制原點）②必需具備適合的酶切位點，供外源DNA片段插入，同時不影響其復制

③有一定的選擇標記，用于篩選

④最好具有較高的拷貝數(shù)，便于制備

2、作為一個最基本的載體，它必需具備哪些功能元件？

克隆載體：復制起點ori、酶切位點、篩選標志；表達載體：啟動子、酶切位點、轉錄終止序列、篩選標志，原核表達載體還要有SD序列。

3、抗性基因（Resistantgene）是目前使用的最廣泛的選擇標記，常用的抗生素抗性有哪幾種？并舉兩例說明其原理？

氨芐青霉素抗性基因ampr、四環(huán)素抗性基因tetr、氯霉素抗性基因Cmr、卡那霉素和新霉素抗性基因kanr

①氨芐青霉素抗性基因ampr:

青霉素可抑制細胞壁肽聚糖的合成，與有關的酶結合并抑制其活性，抑制轉肽反應.氨芐青霉素抗性基因編碼一個酶，該酶可分泌進入細菌的周質(zhì)區(qū)，抑制轉肽反應并催化b-內(nèi)酰胺環(huán)水解（水解青霉素），從而解除了氨芐青霉素的毒性。②四環(huán)素抗性基因tetr：

四環(huán)素可與核糖體30S亞基的一種蛋白質(zhì)結合，從而抑制核糖體的轉位。四環(huán)素抗性基因編碼一個由399個氨基酸組成的膜結合蛋白，可阻止四環(huán)素進入細胞。

4、為什么野生的λ噬菌體DNA不能直接用于基因工程的載體？應當怎樣對其進行改造來構建λ噬菌體克隆載體？

不適合的原因：

①噬菌體DNA沒有容載能力，由于噬菌體的頭部對DNA包裝的量是有限制的，不能大于基因組的105%，所以要將λ噬菌體改造成載體，必需削減分子量。②野生型的λDNA對于一些常用的酶都有多個識別和切割位點，不便于克隆。

③沒有可供選擇的標記。

④野生型的λ噬菌體具有感染性，因此不夠安全。改造：①去掉基因組中一部分對裂解生長非必需的DNA片段

②消去一些多余的限制性內(nèi)切酶識別與切割位點，也可以引入多克隆位點MCS

③添加適合的遺傳標記便于篩選

5、YAC載體具有什么樣的功能性DNA序列？為什么在克隆大片段時，YAC具有優(yōu)越性？

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YAC帶有自然染色體所有的功能元件，包括一個著絲粒，一個DNA復制起點，兩個端粒。

YAC能夠容納長達幾百kb的外源DNA，這是質(zhì)粒和黏粒辦不到的。大片段的插入可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時能夠減少完整基因組文庫所需的克隆數(shù)目。6、何為α-互補，在載體構建中有何作用？答：α-互補：指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，由1024個氨基酸組成）陰性的突變體之間實現(xiàn)互補。α-互補是基于在兩個不同的缺陷β-半乳糖苷酶陰性的突變體之間可實現(xiàn)的功能互補而建立的。

將缺失編碼第11-41位氨基酸的β-半乳糖苷酶基因稱為lacZ△M15基因而將半乳糖苷酶基因(lacZ)

的調(diào)控序列和編碼β-半乳糖苷酶N端140個氨基酸的序列稱為lacZ’.這兩個基因的產(chǎn)物單獨存在時都無酶學活性,但混合在一起時卻有酶學活性.所以在載體上加lacZ’/(MSC),并在受體菌中引入lacZ△M15即可實現(xiàn)α-互補.IPTG是lac操縱子的誘導物,底物X-gal被β-半乳糖苷酶分解后可以產(chǎn)生藍色.假使質(zhì)粒載體中插入了外源DNA,lacZ’的產(chǎn)物則不能與lacZ△M15基因的產(chǎn)物實現(xiàn)α-互補，在IPTG誘導下不能產(chǎn)生有活性的β-半乳糖苷酶，菌落便不可能浮現(xiàn)藍色。白色菌落便是含有插入了外源DNA的重組質(zhì)粒。因此可利用菌落顏色變化來篩選插入外源DNA的重組質(zhì)粒。

這種方法是根據(jù)組織化學的原理來篩選重組體。主要是在λ載體的非必要區(qū)插入一個帶有大腸桿菌β

-半乳糖苷酶的基因片段，攜帶有l(wèi)ac基因片段的λ

載體轉入lacˉ的宿主菌后，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）平板上形成白色的噬

菌斑，非重組的噬菌體則為藍色噬菌斑。第四章大分子分開和分析

1、分析比較瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳的異同點？

同：①原理一致。瓊脂糖、聚丙烯酰胺均

為無反應活性的穩(wěn)定支持介質(zhì)，可降低對流運動，故使電場中的分子電泳遷移率僅與分子的摩擦系數(shù)成反比。在一定電場強度下，DNA分子的遷移率取決于核酸分子的大小和構象。②凝膠濃度的高低影響凝膠介

質(zhì)孔隙大?。粷舛仍礁?，空隙越小，其分辯能力也就越強；反之，濃度降低，空隙就增大，其分辯能力也就隨之減弱。

異：瓊脂糖凝膠分辯DNA片段的范圍為

02.Kb-50Kb之間；而聚丙烯酰胺分辯DNA片段的范圍為1-1000bp，分開小片段效果最好，分辯率極高，相差1bp的