無菌檢查法錢

無菌檢查法錢第1頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五國內(nèi)外藥典微生物學(xué)檢驗(yàn)發(fā)展的宗旨：

——

提高方法撿出率、保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性。1、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、設(shè)施的發(fā)展；2、培養(yǎng)基的品種和適用性要求；3、檢驗(yàn)數(shù)量、檢驗(yàn)量符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求；4、檢驗(yàn)方法和儀器的改進(jìn)（薄膜過濾法、全封閉過濾培養(yǎng)器）5、驗(yàn)證試驗(yàn)；（ICH、USP、EP、BP、JP均有規(guī)定）6、培養(yǎng)時(shí)間；7、結(jié)果的分析和判斷；等。第2頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五

回顧國際無菌檢查法發(fā)展歷史1925年直接接種法首先使用在英國1932年英國藥典推薦使用無菌測(cè)試1936年美國藥典第十一章首先引用單個(gè)培養(yǎng)基的直接接種法1950年美國藥典第十六章推薦使用FTG和SB兩種培養(yǎng)基分別培養(yǎng)需、厭氣菌和真菌1957年美國FDA和MILLIPORE公司介紹膜過濾法用于抗生素?zé)o菌測(cè)試1963年英國藥典63版收載薄膜過濾法無菌測(cè)試1965年美國藥典引用薄膜過濾法用于非抑菌性藥品的無菌測(cè)試1971年歐洲藥典第二版公布參照薄膜過濾法無菌測(cè)試1978年歐洲藥典修訂版發(fā)行公布推薦使用薄膜過濾法無菌測(cè)試1988年美國FDA規(guī)定：假如第一次無菌檢查不符合規(guī)定的樣品不再復(fù)試，這一批次的藥品應(yīng)報(bào)廢。實(shí)際上排除了藥品無菌陽性后再測(cè)試的機(jī)會(huì)1998年英國藥典1998無菌測(cè)試以一次檢出為準(zhǔn)，取消復(fù)試。2000年美國藥典24版無菌測(cè)試以一次檢出為準(zhǔn)，取消復(fù)試。第3頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五

檢視我國歷版藥典無菌檢查法發(fā)展歷史

1953版實(shí)驗(yàn)環(huán)境僅要求為半無菌操作箱；僅收載一種直接接種法；用一種培養(yǎng)基檢查1963版僅一種直接接種法；用三種培養(yǎng)基分別培養(yǎng)細(xì)菌和霉菌1977版開始收載薄膜過濾法（簡(jiǎn)單裝置），用二種培養(yǎng)基分別培養(yǎng)細(xì)菌和霉菌1985版收載薄膜過濾法限于抗生素樣品；用需、厭氣菌培養(yǎng)基及霉菌培養(yǎng)基；要求實(shí)驗(yàn)環(huán)境為紫外線滅菌的無菌室。1990版與85年版相同1995版開始要求對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行靈敏度檢查。2000版規(guī)定實(shí)驗(yàn)環(huán)境為100級(jí)潔凈度；檢驗(yàn)數(shù)量從2支/瓶增加為6～11支/瓶；明確薄膜過濾法為首選方法包括大容量液體樣品首次引用、收載全封閉過濾技術(shù)。第4頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五

對(duì)比國際無菌檢查發(fā)展歷史，我國2000版以前藥典無菌檢查法因技術(shù)和認(rèn)識(shí)的不足，對(duì)提高方法撿出率、保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性方面的規(guī)定與先進(jìn)國家藥典中的要求嚴(yán)重脫節(jié)。第5頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五2005版無菌檢查法取得長(zhǎng)足發(fā)展

實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求、驗(yàn)證試驗(yàn)、延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至少為14天、以一次檢出為準(zhǔn)，取消復(fù)試等亮點(diǎn)。是2005年版藥典無菌檢查法的大步發(fā)展，從而使2005年版無菌檢查法比歷版無菌檢查法有了突破性的提高。基本與國際先進(jìn)藥典無菌檢查法接軌。

第6頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五

2010年版藥典無菌檢查法的發(fā)展，主要是在總結(jié)和鞏固實(shí)施驗(yàn)證試驗(yàn)以來所取得經(jīng)驗(yàn)及認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，作兩方面的發(fā)展：一、附錄無菌檢查法（一部附錄ⅩⅢB）（二部附錄ⅪH）（三部附錄ⅫA）圍繞著保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性作進(jìn)一步的增、修訂。二、品種各論中【無菌】各論化的發(fā)展第7頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五一、附錄無菌檢查法中的增、修訂

（一）總則部分（二）培養(yǎng)基部分（三）靈敏度檢查部分（四）稀釋液、沖洗液部分（五）方法驗(yàn)證部分（六）薄膜過濾法部分（七）培養(yǎng)及觀察部分（八）結(jié)果判斷部分（九）表1、表2和表3第8頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五（一）總則部分新增規(guī)定1、“防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出?！?、“日常檢驗(yàn)還需要對(duì)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控?！?、“無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識(shí)，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)。

第9頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五（二）培養(yǎng)基部分1、刪除：

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基后括號(hào)（用于培養(yǎng)好氧菌、厭氧菌）的說明2、刪除：

改良馬丁培養(yǎng)基后括號(hào)（用于培養(yǎng)真菌）的說明第10頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五3、刪除：

選擇性培養(yǎng)基項(xiàng)下加入適量中和劑或表面活性劑“如對(duì)氨基苯甲酸（用于磺胺類供試品）、聚山梨酯80（用于非水溶性供試品）或β-內(nèi)酰胺酶（用于β-內(nèi)酰胺類供試品）”等說明。修訂為：在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同驗(yàn)證試驗(yàn)。

增訂：表1常見干擾物的中和劑或滅活方法

(見微生物限度檢查法中）第11頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊二醛酚類、乙醇、吸附物醛類季銨類化合物（QACs）、對(duì)羥基苯甲酸酯汞類制劑雙胍類化合物碘酒、洗必泰類鹵化物乙二胺四乙酸（EDTA）磺胺類?-內(nèi)酰胺類抗生素亞硫酸氫納稀釋法稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽卵磷脂、聚山梨酯亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽卵磷脂聚山梨酯硫代硫酸鹽鎂或鈣離子對(duì)氨基苯甲酸?-內(nèi)酰胺酶表1常見干擾物的中和劑或滅活方法第12頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五4、將原排列第6.的0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（用于硫酸鏈霉素等抗生素的無菌檢查）

修訂排列為第4.

——按順序歸類培養(yǎng)基1.～4.均為直接用于無菌檢查的液體培養(yǎng)基。第13頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五（三）培養(yǎng)基靈敏度檢查部分1、在菌液制備中，修訂黑曲霉的孢子懸液制備方法：規(guī)定應(yīng)使用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液，洗脫孢子及稀釋孢子液，制成每1ml中含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。刪除了：（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸管）吸出孢子懸液的操作方法第14頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五2、新增加稀釋后的工作用菌液的保存條件和保存期限：菌液制備后“若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在2～8℃，可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2℃～8℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用?！钡?5頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五

（四）

稀釋液、沖洗液及其制備方法部分

在原有1.0.1%蛋白胨水溶液2.pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖新增加：可根據(jù)供試品的特性，選用其他經(jīng)驗(yàn)證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。第16頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五（五）方法驗(yàn)證試驗(yàn)部分1、驗(yàn)證試驗(yàn)用菌種及菌液制備在培養(yǎng)基靈敏度所用菌種的基礎(chǔ)上，刪除銅綠假單胞菌，增訂大腸埃希菌?！且蛟隍?yàn)證試驗(yàn)的實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)作為革蘭氏陰性桿菌代表的銅綠假單胞菌在驗(yàn)證試驗(yàn)中對(duì)大部分抗生素不敏感，而大腸埃希菌對(duì)抗革蘭氏陰性桿菌為主的抗生素敏感性較好。第17頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五2、驗(yàn)證試驗(yàn)中樣品用量的規(guī)定：刪除了原：“

將規(guī)定量供試品按…”修訂為

薄膜過濾法：“取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾”直接接種法：“接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量”

——明確了驗(yàn)證試驗(yàn)所需樣品量是供試品的檢驗(yàn)量而不是供試品的檢驗(yàn)數(shù)量。第18頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五（六）供試品的無菌檢查部分1、陽性對(duì)照用量的修訂：原：“若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品1支（或瓶）作陽性對(duì)照用。”修訂為：若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品無菌檢查時(shí)每個(gè)培養(yǎng)基容器接種的樣品量作陽性對(duì)照用。——因若是液體制劑，應(yīng)該采用薄膜過濾法，若是固體制劑每管接種量可能不止1支（或瓶），應(yīng)按驗(yàn)證的方法確定。第19頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五2、薄膜過濾法中的增、修訂：2.1新增規(guī)定：抗生素供試品應(yīng)選擇低吸附的濾器及濾膜2.2新增規(guī)定：對(duì)每片濾膜的總沖洗量不得過1000ml2.3新增規(guī)定：所用沖洗量、沖洗方法同驗(yàn)證試驗(yàn)第20頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五

2.4修訂：無菌氣（噴）霧劑供試品的檢驗(yàn)方法：規(guī)定置至少-20℃冰室冷凍1小時(shí)。并新增開啟容器后“將供試品轉(zhuǎn)移至無菌容器中”的操作步驟。第21頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五2.5修訂：裝有藥物的注射器供試品的檢驗(yàn)方法：刪除原“裝上無菌針頭（非包裝中所配帶的）”修訂為“取規(guī)定量，排出注射器中的內(nèi)容物，若需要可吸入稀釋液或標(biāo)簽所示的溶劑溶解，直接過濾，”

——沒有必要將原裝配好的針頭取下來第22頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五

3、

直接接種法中的增、修訂：刪除了原直接接種法中?-內(nèi)酰胺類或黃胺類供試品項(xiàng)?！蛟搩深惞┰嚻返臒o菌檢查以采用薄膜過濾法加中和劑更好。第23頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五4、

培養(yǎng)及觀察中的增、修訂：對(duì)于培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長(zhǎng)時(shí)，刪除了：“或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上”的規(guī)定。必然刪除：可根據(jù)斜面是否有菌生長(zhǎng)而判斷的規(guī)定。第24頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五（七）結(jié)果判斷部分新增訂：陽性對(duì)照管應(yīng)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照管不得有菌生長(zhǎng)。否則，試驗(yàn)無效?！獜?qiáng)調(diào)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照在無菌檢查實(shí)驗(yàn)成立與否中的作用。第25頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五（八）表1、表2和表3部分

表1將表1第3列的表題原“每種培養(yǎng)基最少檢驗(yàn)數(shù)量”修訂為：“接種每種培養(yǎng)基所需的最少檢驗(yàn)數(shù)量”——更明確指出接種到培養(yǎng)基中去的檢驗(yàn)量。修訂了表1下的注:對(duì)供試品容器裝量不夠接種兩種培養(yǎng)基的情況，明確規(guī)定最少檢驗(yàn)數(shù)量應(yīng)加倍。第26頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五

表2將表2原名稱：“上市抽驗(yàn)樣品（液體制劑）的最少檢驗(yàn)數(shù)量”修訂為：“液體制劑最少檢驗(yàn)量及上市抽驗(yàn)樣品的最少檢驗(yàn)數(shù)量”——明確液體制劑最少檢驗(yàn)量見表2的第2列，供試品最少檢驗(yàn)數(shù)量見表2的第3列。

·

修訂了表2下的注:——對(duì)供試品容器裝量不夠接種兩種培養(yǎng)基的情況，明確規(guī)定最少檢驗(yàn)數(shù)量應(yīng)加倍。第27頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五表3

·將表3原名稱：“上市抽驗(yàn)樣品（固體制劑）的最少檢驗(yàn)量”修訂為：“固體制劑最少檢驗(yàn)量及上市抽驗(yàn)樣品的最少檢驗(yàn)數(shù)量”——明確固體制劑最少檢驗(yàn)量見表3第2列；供試品最少檢驗(yàn)數(shù)量見表3的第3列?！ば抻喠吮?下的注:——對(duì)供試品容器裝量不夠接種兩種培養(yǎng)基的情況，明確規(guī)定最少檢驗(yàn)數(shù)量應(yīng)加倍。第28頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五二、各論中【無菌】各論化的發(fā)展

舉例如下：乙酰谷酰胺注射液、丁溴東莨菪堿注射液

無菌：取本品，經(jīng)薄膜過濾法處理，用0.1％無菌蛋白胨水溶液分次沖洗（每膜不少于100ml），以金黃色葡萄球菌為陽性對(duì)照菌，依法檢查（附錄ⅪH），應(yīng)符合規(guī)定。第29頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五舉例如下：頭孢曲松鈉、頭孢拉定、頭孢哌酮鈉、頭孢硫脒、注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀、鹽酸林可霉素注射液無菌：取本品，用適宜溶劑溶解后轉(zhuǎn)移至不少于500ml的0.9%無菌氯化鈉溶液中，用薄膜過濾法處理后，依法檢查（附錄ⅪH），應(yīng)符合規(guī)定。氧氟沙星氯化鈉注射液無菌：取本品，經(jīng)薄膜過濾法處理，用0.1％無菌蛋白胨水溶液分次沖洗（每膜不少于500ml）每管培養(yǎng)基中加入0.1mol/L硫酸錳溶液1ml,以大腸埃希菌為陽性對(duì)照菌，依法檢查（附錄ⅪH），應(yīng)符合規(guī)定。第30頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五一、無菌檢查用培養(yǎng)基的不斷改進(jìn)二、增加對(duì)檢出菌的檢定要求三、對(duì)每種接種后的培養(yǎng)基分別置兩種溫度（適合細(xì)菌生長(zhǎng)和適合真菌生長(zhǎng)）下培養(yǎng)四、各論化中無菌檢查表述的進(jìn)一步規(guī)范化

無菌檢查法的展望第31頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五一、無菌檢查用培養(yǎng)基的不斷改進(jìn)1、應(yīng)與國際先進(jìn)藥典無菌檢查法所用培養(yǎng)基保持一致

理由（1）與USP/BP/EP/JP保持一致便于國際交流。

第32頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五理由（2）

USP<71>中大豆酪蛋白胨培養(yǎng)基靈敏度測(cè)定要求用3種菌：枯草桿菌、白念、黑曲檢查。我國藥典改良馬丁培養(yǎng)基靈敏度測(cè)定只要求2種菌：白念、黑曲。實(shí)驗(yàn)證明大豆酪蛋白胨培養(yǎng)基同時(shí)適合真菌、細(xì)菌的生長(zhǎng)，有利于提高污染菌的檢出率。第33頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五2、須進(jìn)一步深入開展無菌檢查用培養(yǎng)基的研究與開發(fā)理由（1）無菌檢查用培養(yǎng)基曾從僅1種發(fā)展起來，且配方也逐步調(diào)整。隨著對(duì)藥品安全的保證和藥品無菌檢查要求的不斷提高，無菌檢查用培養(yǎng)基應(yīng)不斷改進(jìn)。理由（2）任何一種培養(yǎng)基不可能把藥品中可能存在的菌都培養(yǎng)出來。第34頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五理由（3）

與培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)用菌相比較，藥品中的污染微生物會(huì)更廣泛、活性更低。

理由（4）如存在某些苛養(yǎng)菌、亞致死狀態(tài)菌——是否需要添加更豐富的營養(yǎng)成分，如動(dòng)物的血液、動(dòng)物組織提取液等才能被檢出。第35頁，共41頁，2023年，2月20日，星期五理由（5）據(jù)報(bào)道：巰乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中指示劑刃天青對(duì)微生物有一定抑制作用，（加0.1%刃天青1ml~0.5ml對(duì)靈敏度無顯著差異。）美國藥典中同時(shí)收載兩種巰乙醇酸鹽