方法學(xué)評價試驗重復(fù)性試驗

方法學(xué)評價試驗重復(fù)性試驗第1頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五方法學(xué)評價試驗---重復(fù)性試驗方法學(xué)評價試驗

——重復(fù)性試驗掌握：批內(nèi)精密度評價的基本原理、實驗步驟及統(tǒng)計方法。熟悉：重復(fù)性實驗的注意事項和評價標(biāo)準(zhǔn)。了解：批間、日內(nèi)及日間重復(fù)性實驗的區(qū)別第2頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五什么是方法學(xué)評價方法學(xué)評價（evalution

of

methodology）是通過實驗的途徑客觀評價實驗方法及其試劑分析性能的重要手段。其基本內(nèi)容是通過實驗途徑，測定并評價方法的精密度與準(zhǔn)確度，在實驗中測定的是不精密度與不準(zhǔn)確度，不論精密度還是準(zhǔn)確度，強調(diào)的都是誤差，評價實驗的過程就是對誤差的測定。方法學(xué)評價試驗---重復(fù)性試驗第3頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五方法學(xué)評價常用技術(shù)性能指標(biāo)準(zhǔn)確度(accuracy)是指測定值與真值之間的符合程度，由于真值實際上也是一個近似值，所以準(zhǔn)確度往往用不準(zhǔn)確度來表示。精密度(precision)是指在重復(fù)性條件下對同一標(biāo)本進行多次測定時，各測定值之間隨機誤差的大小。精密度常用標(biāo)準(zhǔn)差(s)或變異系數(shù)(CV%)來表示。方法學(xué)評價試驗---重復(fù)性試驗第4頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五方法學(xué)評價常用技術(shù)性能指標(biāo)靈敏度(sensitivity)是指檢測系統(tǒng)可檢測出的最低分析物濃度，或稱檢測限。特異度(specificity，SPE)，又稱真陰性率(truenegativerate，TNR)，即實際無病按該診斷標(biāo)準(zhǔn)被正確地判為無病的百分比。它反映篩檢試驗確定非病人的能力。方法學(xué)評價試驗---重復(fù)性試驗第5頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五方法學(xué)評價常用技術(shù)性能指標(biāo)分析測量范圍(analysismeasurerange，AMR)是指對沒有進行任何預(yù)處理（稀釋、濃縮等）的標(biāo)本，分析方法能夠直接測定出的待測物的范圍，也就是系統(tǒng)最終的輸出值（活性或濃度）與被分析物的活性或濃度成線性比例的范圍，即線性范圍。臨床可報告范圍(clinicalreportablerange，CRR)，是允許應(yīng)用樣本稀釋、濃縮和預(yù)處理后，分析方法可測定樣本中分析物的可靠范圍濃度。CRR是擴展的AMR。方法學(xué)評價試驗---重復(fù)性試驗第6頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五重復(fù)性試驗重復(fù)性試驗是在相同條件下，用同一方法、同一試劑和校準(zhǔn)品、同一臺儀器、在同一實驗室由同一人操作對同一標(biāo)本在盡可能短的時間內(nèi)進行多次分析測定（一般為20次），以獲得批內(nèi)精密度實驗數(shù)據(jù)。其結(jié)果反映各次測定結(jié)果間相互接近的程度。其目的在于評價或驗證試驗方法的隨機誤差或不精密度。包括批內(nèi)重復(fù)性試驗、日內(nèi)重復(fù)性試驗和日間重復(fù)性試驗等。方法學(xué)評價試驗---重復(fù)性試驗第7頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五批內(nèi)重復(fù)性試驗是將同一材料分成數(shù)份實驗標(biāo)本，在盡可能短的時間內(nèi)平行測定20次；日內(nèi)重復(fù)性試驗是將同一材料分成數(shù)份實驗標(biāo)本，在1天內(nèi)作5輪，每輪4次測定，獲得20個測定數(shù)據(jù)；日間重復(fù)性試驗是將同一材料分成20份實驗標(biāo)本，每天測定1份，連測20天。分別作統(tǒng)計處理即可測得候選方法的批內(nèi)、日內(nèi)和日間的隨機誤差。方法學(xué)評價試驗---重復(fù)性試驗第8頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五血清(漿)總蛋白(TP)測定血清總蛋白質(zhì)檢測有何臨床意義？血清總蛋白質(zhì)（totalprotein，TP）是血清中各種蛋白質(zhì)的總稱，是血漿固體成分中含量最多的一類物質(zhì)，具有維持血液正常膠體滲透壓和pH、運輸多種代謝物、免疫、催化、營養(yǎng)作用等多種功能。90%以上的血清總蛋白由肝臟合成，如清蛋白、a1、a2、β球蛋白，纖維蛋白原等，當(dāng)肝臟發(fā)生病變時，肝細胞合成蛋白質(zhì)的功能減退，血漿中蛋白質(zhì)即會發(fā)生質(zhì)和量的變化。臨床上用各種方法檢測血漿蛋白的含量來協(xié)助診斷肝臟疾患，并作為療效觀察，預(yù)后判斷的指標(biāo)。但由于肝功能有很大代償能力及清蛋白半衰期較長，因此肝臟病變往往達到一定程度和一定病程后才能出現(xiàn)血清總蛋白和清蛋白量的改變。第9頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五血清(漿)總蛋白(TP)測定血清總蛋白質(zhì)檢測有何臨床意義？1．生理性升高：劇烈運動后。2．生理性降低：妊娠。3．病理性升高（相對少見）：(1)血清中水分減少，使總蛋白濃度相對增高。常見于急性失水引起血液濃縮(如嘔吐、腹瀉等)；休克時，毛細血管通透性發(fā)生變化，血漿濃縮；慢性腎上腺皮質(zhì)機能減退的病人，由于鈉的丟失繼發(fā)水分丟失，血漿也發(fā)生濃縮。(2)血清蛋白質(zhì)合成增加(主要是球蛋白的增加)?？偟鞍卓沙^100g／L，多見于多發(fā)性骨髓瘤病人。參考區(qū)間：65~85g/L第10頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五血清(漿)總蛋白(TP)測定血清總蛋白質(zhì)檢測有何臨床意義？4．病理性降低：(1)血漿中水分增加，血漿被稀釋。因各種原因引起的水鈉潴留或輸注過多的低滲溶液。(2)營養(yǎng)不良或長期消耗性疾病。如嚴重結(jié)核病和惡性腫瘤等。(3)合成障礙。主要是肝臟功能嚴重損害時，蛋白質(zhì)的合成減少，以白蛋白的下降最為顯著。(4)蛋白質(zhì)丟失。大出血時大量血液丟失；腎病時尿液中長期丟失蛋白質(zhì)；嚴重?zé)齻麜r，大量血漿滲出等。第11頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五重復(fù)的肽鏈結(jié)構(gòu)酪氨酸和色氨酸殘基對酚試劑反應(yīng)或紫外吸收與某些染料特異結(jié)合的能力采用沉淀反應(yīng)借助濁度或光折射原理測定電泳的遷移率大小血清(漿)總蛋白(TP)測定蛋白質(zhì)檢測方法第12頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五凱式定氮法（N）雙縮脲法（肽鍵）酚試劑法（Lowry法）比濁法（沉淀）血清(漿)總蛋白(TP)測定蛋白質(zhì)檢測方法早期用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。該方法較雙縮脲法反應(yīng)靈敏100倍左右，檢測范圍最低可達5μg，通常為20~250μg，使用很廣泛，但花費時間長（40~60分鐘），干擾因素較多(硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸，各種硫醇)，顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化，較適合單一蛋白質(zhì)測定。近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。（靈敏度好，費時，操作要嚴格計時）1883年建立，是經(jīng)典的蛋白質(zhì)測定方法。該法結(jié)果準(zhǔn)確，精密度高，靈敏度低，適用于0.2~1.0mg氮測定，是蛋白質(zhì)測定的參考方法，但由于操作復(fù)雜、費時（8~10h），影響因素較少（主要為非蛋白氮，但可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離），不適用于常規(guī)測定，目前多用于蛋白質(zhì)的定值和校正其他方法。（測定準(zhǔn)確，干擾少，費時太長）此法操作簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，干擾物質(zhì)少(硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸)，在10~120g/L濃度范圍內(nèi)成良好的線形關(guān)系，批內(nèi)CV值＜2%。其缺點是靈敏度較低(1~20mg)，不同蛋白質(zhì)顯色相似，但能滿足臨床要求，是目前臨床測定蛋白質(zhì)的一種首選方法。此法操作簡便、靈敏度高，缺點是影響因素較多。一般用于測定尿液、腦脊液等蛋白質(zhì)濃度較低的樣品。第13頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五電泳法紫外分光光度法血清(漿)總蛋白(TP)測定蛋白質(zhì)檢測方法此法操作簡便、快速（5~10分鐘），不消耗樣品，測定后仍能回收使用，靈敏高，適用于50~100μg測定。但受蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量的影響，干擾因素也較多（各種嘌呤和嘧啶，各種核苷酸，可校正）。故適用于測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)，不適合血清等組成復(fù)雜的蛋白質(zhì)測定，特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測。主要有醋酸纖維素薄膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳，等電聚焦電泳、雙向電泳等。全自動電泳儀在臨床的應(yīng)用也逐漸增多，條帶清晰，分辨效果好，能看到蛋白質(zhì)全貌，但耗時較長，需要特殊儀器。第14頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五常用染料有氨基黑、麗春紅、考馬斯亮藍、鄰苯三酚紅鉬等。氨基黑、麗春紅常作為血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳或瓊脂糖凝膠電泳的染料?？捡R斯亮藍(Bradford)1976年由Bradford建立，該法靈敏度最高（1~5μg），試劑配制簡單，檢測速度快（5~15分鐘）、簡便，，干擾因素少(強堿性緩沖液；TritonX100；SDS)，顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化。適用于要求靈敏度高的微量蛋白質(zhì)快速定量測定，如尿液、腦脊液等。但有染料粘附比色杯上不易洗脫的缺點。血清(漿)總蛋白(TP)測定蛋白質(zhì)檢測方法第15頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五鄰苯三酚紅鉬也可用于測定尿液、腦脊液蛋白質(zhì)含量，既不粘附比色杯,又具有高靈敏度，已有用于自動化分析測定尿液蛋白質(zhì)的試劑盒。還有測定Alb常用的染料甲基橙、溴甲酚紫(BCP)、溴甲酚綠（BCG）等，目前應(yīng)用最廣的是BCG。此法操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好，適合自動分析；且球蛋白一般與陰離子染料不結(jié)合，無干擾作用。是清蛋白測定的常規(guī)方法，應(yīng)用最廣。血清(漿)總蛋白(TP)測定蛋白質(zhì)檢測方法第16頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五利用抗原抗體特異反應(yīng)免疫比濁法、免疫擴散法、免疫沉淀法、免疫化學(xué)法等血清(漿)總蛋白(TP)測定蛋白質(zhì)檢測方法第17頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下，與Cu2+產(chǎn)生穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物。與兩分子尿素縮合后生成的雙縮脲在堿性溶液中與Cu2+的反應(yīng)相似，故稱為雙縮脲反應(yīng)。絡(luò)合物顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)的濃度成正比（與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)），與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比較，經(jīng)計算即可求出血清總蛋白質(zhì)含量。方法學(xué)評價試驗---重復(fù)性試驗第18頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五1.樣本：收集無溶血、無脂濁、無傳染性疾病、肝腎功能正常的人混合血清。方法學(xué)評價試驗---重復(fù)性試驗2．雙縮脲試劑3．蛋白標(biāo)準(zhǔn)液4．自動生化分析儀或722型分光光度計，刻度吸管，試管，試管架，微量加樣器，恒溫水浴箱等硫酸銅2.0mmol/L酒石酸鉀鈉31.9mmol/L碘化鉀30.1mmol/L氫氧化鈉600mmol/L酒石酸鉀鈉可以與Cu2+形成絡(luò)合物，并維持Cu2+在堿性溶液中的穩(wěn)定性，避免形成Cu(OH)2沉淀使試劑失效。碘化鉀是抗氧化劑，防止Cu2+還原，從而延長試劑的使用壽命。氫氧化鉀僅僅是為了提供堿性環(huán)境，因此它可被其他堿，如氫氧化鈉所代替。第19頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五血清(漿)總蛋白(TP)測定加入物空白管（B）標(biāo)準(zhǔn)管（S）測定管（U1~20）蒸餾水（μl）20——蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（μl）—20—待測血清（μl）——20雙縮脲試劑(ml)1.01.01.0混勻，置37℃水浴10min，以空白管調(diào)零，用540nm波長比色，讀取各管吸光度值(A值)并計算。將以上收集的樣本分為20份并進行編號，按下表操作：第20頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五方法學(xué)評價試驗---重復(fù)性試驗1.根據(jù)以下公式求出各個測定管（U1~20）的血清總蛋白的濃度：第21頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五2.根據(jù)以下公式求出均值和標(biāo)準(zhǔn)差s：表示各測定值總和；i=1表示從第1個樣本值開始加，加到第n個x值，本實驗共20個測定值。方法學(xué)評價試驗---重復(fù)性試驗第22頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五3.離群值檢驗用求得的均值和標(biāo)準(zhǔn)差對20個測定值進行檢驗，如果其中有一個數(shù)據(jù)超過X±3S時，該數(shù)據(jù)為離群值。剔除該數(shù)據(jù)后補做一個實驗數(shù)據(jù)后重新計算X和s。有兩個以上離群值時，重新進行實驗，本次實驗作廢。4.計算CV。方法學(xué)評價試驗---重復(fù)性試驗第23頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五5.如試驗求得的血清TP雙縮脲試劑法的CV值＜WHO對中等實驗室提出的OCV(±3%)標(biāo)準(zhǔn)，即表明實驗條件的控制達到最佳條件，試驗結(jié)果可按OCV%報告。作為方法探討實驗，其變異系數(shù)應(yīng)該＜OCV標(biāo)準(zhǔn)。方法學(xué)評價試驗---重復(fù)性試驗第24頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五6.變異指數(shù)得分（VIS）方法學(xué)評價試驗---重復(fù)性試驗VI＝V×100／CCVV為變異百分數(shù)，X為各室測定結(jié)果，X為各實驗室結(jié)果均值（剔除X+3S以外的結(jié)果）,T為靶值,VI為變異指數(shù)，CCV為選定的變異系數(shù)。VIS即變異指數(shù)得分。VI＜400時，VIS＝VI；當(dāng)VI＞40時，VIS＝400,測定結(jié)果與靶值完全一樣時，VIS＝0第25頁，共27頁，2023年，2