凝膠過濾層析法測定蛋白質(zhì)分子量

凝膠過濾層析法測定蛋白質(zhì)分子量實驗三凝膠過濾層析法測定蛋白質(zhì)分子量

【目的要求】掌握凝膠層析的基本原理學(xué)習(xí)利用凝膠層析法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量

的實驗技能

【原理】凝膠層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進行分離的技術(shù)。

相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔被完全排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間向下流動，因此流程較短，移動速度快；所以首先流出。相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可完全滲透進入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動過程中，因此流程較長，移動速率慢；所以最后流出。中等大小的分子，它們在凝膠顆粒內(nèi)外部分滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時間介于二

者之間，這樣分子大的組分先流出，分子小的組分后流出。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達到了分離的目的。

◎

圖3-1

凝膠層析分離原理示意圖

【基本概念】外水體積、內(nèi)水體積、柱床體積、洗脫體積外水體積(Vo)是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積內(nèi)水體積(Vi)是指凝膠顆粒中孔穴的體積。柱床體積是(Vt)凝膠柱所能容納的總體積。

【基本概念】洗脫體積(Ve)是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。它包括自加入樣品時算起，到組分最大濃度出現(xiàn)時所流出的體積。Ve一般是介于Vo和Vt之間的。對于完全排阻的大分子由于其不進入凝膠顆粒內(nèi)，故其

洗脫體積積內(nèi)，故其洗脫體積

VeVe

=Vo

對于完全滲透的小分子由于它可以存在于凝膠柱整個體=Vt

分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。

圖3-3

凝膠層析柱洗脫曲線示意圖Ⅱ中等分子Ⅲ完全滲透的小分子

Ⅰ完全排阻的大分子

洗脫體積的測定外水體積(Vo):可以通過測定完全排阻的大分子物質(zhì)的洗脫體積來測定，一般常用藍色葡聚糖-2000作為測定外水體積的物質(zhì)。

內(nèi)水體積(Vi):可以通過測定完全滲透的小分子溶質(zhì)(如重鉻酸鉀)的洗脫體積來測定

Ve=Vo+Vi推出Vi=Ve-Vo柱床體積(Vt):1)可用下式計算：Vt=π〓(D/2)2〓h2)根據(jù)Vt=Vo+Vi可以得到即3)加入一定量的水至層析柱預(yù)定標記處，然后測量水的體積。

分配系數(shù)表示某個組分在內(nèi)水體積和在外水體積中的濃度分配關(guān)系。

Kav=

Ve-VoVt-Vo

Kav值的大小和凝膠柱床的總體積(Vt)、外水體積(Vo)以及分離物本身的洗脫體積(Ve)有關(guān)。Vo和Vt可以通過測定得到，測定了某個組分的Ve

就可以得到這個組分的分配系數(shù)。在一定的條件下，Vt和Vo都是恒定值。大分子先從柱中流出→Ve值小→Kav值小小分子后從柱中流出→Ve值大→Kav值大

對于完全排阻的大分子對于完全滲透的小分子

Ve

Vo故Kav=0Ve=Vt故Kav=1=

Kav是判斷分離效果的一個重要參數(shù)，同時也是測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的一個依據(jù)。對于某一型號的凝膠，在一定的分子質(zhì)量范圍內(nèi)，各個組分的Kav與其分子質(zhì)量的對數(shù)成線性關(guān)系：

Kav

=-blgMr+c

由于Ve和Kav也成線性關(guān)系所以同樣有：

Ve

=-b’lgMr+c’

通過將一些已知分子質(zhì)量的標準蛋白質(zhì)在同一凝膠柱上以相同條件進行洗脫，分別測定Ve或Kav,并根據(jù)上述的線性關(guān)系繪出標準曲線，然后在相同條件下測定未知樣品的Ve或Kav,通過標準曲線即可求出其分子質(zhì)量。

吸水率和床體積吸水率是指1g干的凝膠吸收水的體積或者重量，但它不包括顆粒間吸附的水份。所以它不能表示凝膠裝柱后的體積。SephadexG-25~200數(shù)字是吸水率〓10例如SephadexG-75例如SephadexG-75吸水率7.5〒ml/g床體積12~15ml/g床體積指1g干的凝膠吸收水后的最終體積

干膠用量(g)=柱(ml)床體積/凝膠床體積(ml/g)

【應(yīng)用】生物大分子的純化分子量測定

脫鹽及去除小分子雜質(zhì)去熱源物質(zhì)

溶液的濃縮

【操作方法】一、凝膠的選擇和處理量取110mLSephadexG-75于250mL燒杯中，加入洗脫液100mL,在沸水浴中煮沸1h,冷卻至室溫后抽真空脫去顆?？障吨械目諝?。

二、裝柱1)取潔凈的玻璃層析柱垂直固定在鐵架臺上。2)凝膠柱床總體積(Vt)的測定：在距柱上端約5㎝處作一記號，關(guān)閉柱出水口，加入蒸餾水，打開出水口，液面降至柱記號處即關(guān)閉出水口，然后用量筒接收柱中蒸餾水，讀出的體積即為柱床總體積Vt。

3)向柱內(nèi)加入約1/4柱體積的洗脫液，將濃漿狀

的凝膠緩慢地傾入柱中，使之自然沉降，凝膠沉降約2~3㎝高度后打開出水口，待膠面上升到柱記號處時則裝柱完畢。然后關(guān)閉出水口，靜置片刻，等完全沉降，將接接口的乳膠管與盛有洗脫液的儲液瓶連接，調(diào)流速3~6mL/10min,用2~3

倍柱床體積的洗脫液平衡。

三、Vo的測定打開柱上端的塞子，待柱內(nèi)洗脫液下降至與凝

膠膠面相切時，關(guān)閉出水口。用細滴管吸取1mL藍色葡聚糖-2000液，小心地繞柱壁一圈(距膠面2mm)緩慢加入，打開出水口(開始收集),待溶液完全滲入柱床后，關(guān)閉出水口，取1mL洗脫液沿管壁洗柱一次，等溶液完全滲入柱床，柱上端再

加入幾毫升洗脫液，將柱上端接口與儲液瓶連接，打開出水口，開始洗脫。收集藍色葡聚糖-2000洗脫峰，測

出洗脫體積Ve,得出Vo值。

四、標準曲線的制作1)用洗脫液配制標準蛋白質(zhì)溶液(牛血清蛋白、雞卵清蛋白、溶菌酶)。2)按上述方法加入1mL標準蛋白質(zhì)混合液，以3mL/10min的速度洗脫并收集洗脫液體積。3)分別收集各標準蛋白質(zhì)的洗脫峰(靈敏度0.2A),測量它們的洗脫體積Ve。代入公式計算出各標準蛋白質(zhì)的

Kav值。4)以Kav值為橫坐標，標準蛋白質(zhì)lgMr為縱坐標，繪出標準曲線。

五、未知樣品蛋白質(zhì)分子量的測定

將待測待測雞卵粘蛋白樣品配制成5mg/mL溶液,以下步驟完全按照標準曲線的條件操作。根據(jù)紫

外檢測的洗脫峰位置，量出洗脫體積Ve,代入公式計算待測蛋白的Kav值，然后在標準曲線上查得