人外周血淋巴細(xì)胞彗星試驗檢測水體遺傳毒性的

人外周血淋巴細(xì)胞彗星試驗檢測水體遺傳毒性的研究摘要：應(yīng)用人外周血淋巴細(xì)胞彗星試驗對無錫充山水廠、中橋水廠，常州西石橋水廠進(jìn)出水及金壇市擬用水源地長蕩湖湖心水樣的遺傳毒性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明各水樣的有機(jī)濃集物均可對人外周血淋巴細(xì)胞DNA產(chǎn)生不同程度的損傷，存在一定的遺傳毒性。試驗結(jié)果與各水樣水質(zhì)污染狀況基本一致。同時，季節(jié)變化以及常規(guī)水處理過程對水樣的遺傳毒性有影響。研究表明彗星試驗可有效地用于檢測水體有機(jī)濃集物遺傳毒性。關(guān)鍵詞：飲用水，遺傳毒性，人外周血淋巴細(xì)胞，彗星試驗GenotoxicityevaluationofwaterinhumanperipheralbloodlymphocytesusingthecometassayAbstract:Thegenotoxicpotentialsoforganicpollutantsinsourceandtapwatersamplesofthreewaterworks（i.e.,Chongshan,ZhongqiaoandXishiqiao）andwatersampleofChangdangLakewereevaluatedwiththecometassay.TheresultsshowedthatDNAdamagesinhumanperipheralbloodlymphocyteswereinducedafterexposuretotheorganicextractsfromallwatersamplesandthegenetichazardexisted.Theconcordancebetweentheresultsofthecometassayandthepollutionconditionsofthewatersourceswasdisplayedwell.Moreover,theresultsindicatedthealternateseasonsandthewatertreatmentprocesscouldaffectthequalityofwater.Theresultsofthisstudydemonstratethatthecometassaycanbesuccessfullyappliedtothegenotoxicitymonitoringprogramofthewater.Keywords:drinkingwater，genotoxicity，humanperipheralbloodlymphocyte，cometassay飲用水與人體健康直接相關(guān)。自從70年代初美國環(huán)保局首次在水中發(fā)現(xiàn)氯的衍生物以來，水中有機(jī)物對人體健康的影響已日益引起人們關(guān)注。據(jù)1995年的數(shù)據(jù)，全世界已在水中測出有機(jī)化合物2221種，其中許多具有致癌、致畸和致突變作用。國內(nèi)也有相關(guān)的報道，研究發(fā)現(xiàn)黃浦江水中有機(jī)物達(dá)700種，而用GC／MS法測得第二松花江吉林江段水中有機(jī)物317種，其中不乏致癌、致突變物[1]。因此，有研究認(rèn)為，對人體健康和人口素質(zhì)的影響而言，水源中是否含有遺傳毒性的物質(zhì)，應(yīng)該是估價水源水質(zhì)的主要指標(biāo)[2]。由于此類有機(jī)物大都呈現(xiàn)低劑量長期暴露的特點，常規(guī)的理化分析不足以對水質(zhì)狀況作全面的評價，所以建立一種有效的測試方法評價水中有機(jī)物的遺傳毒性是環(huán)境監(jiān)測工作中的一項重要任務(wù)。對于水體有機(jī)物污染的遺傳毒性評估，一般都采用體外短期生物測試系統(tǒng)進(jìn)行，如Ames試驗、微核試驗、V79細(xì)胞致突變試驗等。近年來，彗星試驗由于其快速、敏感、可靠等諸多優(yōu)點正越來越多地在這方面得到廣泛的應(yīng)用[3]。本文采用人外周血淋巴細(xì)胞彗星試驗，對無錫充山水廠、中橋水廠，常州西石橋水廠進(jìn)出水及金壇市擬用水源地長蕩湖湖心水樣的遺傳毒性進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1試驗材料健康人外周肝素抗凝全血，采自南京市中心血庫。1.2水樣的采集與處理于2003年4月采集無錫充山水廠、中橋水廠進(jìn)出水，2003年7月和12月分別采集常州西石橋水廠進(jìn)出水及長蕩湖湖心水樣。其中，無錫充山水廠、中橋水廠水源地位于太湖梅梁灣，常州西石橋水廠水源地為長江，長蕩湖為常州金壇市擬用水源地。各采樣點采樣量均為20L。水樣靜置24hr，過濾去除懸浮顆粒，通過XAD-2樹脂吸附柱富集，控制流速在30-40mL/min，N2排除水分，以甲醇、丙酮、二氯甲烷洗脫，洗脫液用氮吹儀在50℃條件下濃縮，吹干，再用二甲基亞砜（DMSO）溶解，定容至2.0mL，避光保存于-18℃冰箱中備用。1.3人外周血淋巴細(xì)胞的分離與染毒將新鮮肝素抗凝血按血量1/3加入3％的新配明膠溶液于離心管內(nèi)混勻，立即垂直置于37℃恒溫水浴，自然沉降約30min。吸取淡黃色淋巴細(xì)胞層0.2mL于事先裝有0.8mLPBS緩沖液的微量離心管中，3000rpm離心3min，棄去上清，加入0.9mLPBS及0.1mL水樣濃集物，37℃避光染毒1hr。每個水樣設(shè)三個劑量（即相當(dāng)于原水樣20mL、100mL、500mL/管）。染毒后3000rpm離心3min，棄上清，沉積細(xì)胞置4℃冰箱中備用。同時作DMSO溶劑對照。用苔盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞存活率。1.4彗星試驗彗星試驗方法參照Singh報道[4]。鋪好膠層的玻片在冷細(xì)胞裂解液裂解1hr后，在堿性電泳液（pH＝13.0）靜置，解旋30min。調(diào)節(jié)電壓為25V，電流為100mA，電泳1hr。以上各步驟應(yīng)在紅光或黃光下進(jìn)行，以免產(chǎn)生額外的DNA損傷。電泳后，經(jīng)中性緩沖液中和，在24hr內(nèi)，每張玻片以50μL溴乙錠（EB）染色，熒光顯微鏡下觀察，進(jìn)行顯微攝影。3.2.3結(jié)果評價及統(tǒng)計分析采用彗星圖像分析軟件CometAssaySoftwareProject(CASP)，以彗尾DNA含量（TailDNA%，TD），彗尾長（TailLength，TL）以及Olive尾矩（OliveTailMoment，OTM，即彗尾DNA含量×彗星頭尾部密度重心間距離）等三個評價參數(shù)對DNA損傷進(jìn)行定量分析。每玻片至少分析50個細(xì)胞。貨根據(jù)數(shù)據(jù)的分系布特征和方差半，便以隸Man脖n昏–援Whitne練yU指檢驗比較掉各劑量組與溶筍劑對照間的損窯傷差異。考慮再到高劑量的染歇毒可能造恒成啦DN脅A負(fù)的嚴(yán)重?fù)p傷，凝而使大量而的交DN腸A先游離斷片在電戀泳過程中丟失父而引起可硬測飼DN叔A暈損傷的降低恒[5]上，而劑量過低螞可能使組間差膝異難以充分表車現(xiàn)，所以本文挪以里100mL演/病管這一劑量對燒各水樣間的遺扭傳毒性進(jìn)行多此重比較。由貞于唇OT撈M增同時反映了彗憶尾唱中茅DN釀A散含量和彗尾形沒狀特征，所以饒組間的多重比森較吉以河OT鴿M轟為指標(biāo)，采用紹Krusha隊l僑–秧Wallis摘H埋檢驗法，顯著中性水平設(shè)吩為統(tǒng)0.0短5寒。膽2際乒結(jié)果與分析妥張典型彗星圖像淹如遠(yuǎn)圖瘦1燕、洪2疼所示。無錫充被山水廠、中橋預(yù)水廠進(jìn)出水，膨常州西石橋水黑廠進(jìn)出水及長顫蕩湖湖心水樣勻有機(jī)濃集物對成人外周血淋巴徒細(xì)允胞寸DN蓮A傘損傷的結(jié)果分瓜別見抱表賴1技和滔表哲2晚。村苔盼藍(lán)染色法串的結(jié)果表明，昨各水樣不同劑圍量組染毒前后口細(xì)胞存活率均僵>抽9憐0環(huán)％，所以引勺起蠟DN譜A栽損傷的主要為多遺傳毒性，而驚非細(xì)胞毒性。披從災(zāi)表浴1照中可以看出，巷與溶劑對照相剩比，除充山水蓄廠和中橋水廠筋出水的低劑量常組潮（計20mL絕/點管）菜在剖T竟D堂這一指標(biāo)上無造統(tǒng)計差異外，鵝其它各水樣濃載集物均有極顯友著差優(yōu)異拉(P<0.0幟1壯)朋，且隨著劑量禁的加大，受損滴的程度也加重糠。丈以悟OT羊M項為評價指標(biāo)，趟在趴100mL堂/郊管這一劑量進(jìn)伴行比較發(fā)現(xiàn)各負(fù)水樣間無統(tǒng)計吼學(xué)差異早（款P>0.05戰(zhàn)）揚(yáng)。圖1DMSO溶劑對照組人外周血淋巴彗圖1DMSO溶劑對照組人外周血淋巴彗星圖像（×400）Fig.1Cometfigureofhumanperipheralbloodlymphocytestreatedwithsolventcontrol(DMSO)（×400）圖2充山水廠出水有機(jī)濃集物500mL/管劑量組人外周血淋巴彗星圖像（×400）Fig.2Cometfigureofhumanperipheralbloodlymphocytestreatedwiththeorganicextracts(500mL/tube)fromtapwaterofChongshanWaterwork（×400）擋表撿1鹿納無錫充山水廠喂、中橋水廠進(jìn)殿出水場（國2003轉(zhuǎn).爆4激）有機(jī)濃集物迷對人淋巴細(xì)激胞咳DN辰A比的損傷廁Table益1DNA逮damage壯sinhu胳manpe拌ripher范alblo籍odlym湖phocyt比esexp患o(jì)sedt改oorga漂nicex鳳tracts帥from多source忌andt萌apwat亞erofC遣hongsh貴an,Zh惠ongqia以owate窄rworks駱(2003耕.4)柜水樣藍(lán)染毒劑量叨（壺ml/詳L集）什TailD顆NA誓（％）換Taill嘉ength燃（蒸μ虧m發(fā)）炕Olive汽TailM歸oment逗充山水廠進(jìn)水套20融8.65±0喬.62**汗11.51±騰0.76**序1.34±0咸.1裹2贈**打100寸14.63±檔1.10**賠18.35±殼1.33**誓3.19±0警.升40獸**離500鋪28.23±我1.68**慘35.43±湖2.叔70妹**溫8.32±1畝.12**筍充山水廠出水有20隊7.93±0航.68屈10.31±糕0.8奉7構(gòu)**凱1.25±0俊.14**遵100途13.兼60拼±0.81*狼*疊15.36±其0.默90唐**紡2.19±0賢.17**伯500穗22.23±舒1.61**棍26.01±吸2.0兼4會**邁5.41±0畢.69鋤1向**靜中橋水廠進(jìn)水此20披8.58±0責(zé).48**小10.25±浸0.55**彼1.27±0助.1蘿1曠**殲100廳13.21±難1.07**訪19.54±冷1.24**佩2.76±0廈.3劉1鉛**盾500昆28.47±帝3.1穩(wěn)5謙**菌25.26±解2.8疼6驢**陣5.56±0血.70**體中橋水廠出水救20痛7.62±0塊.85妙10.79±斜1.20**額1.45±0藏.2靈6苗**只100腐12.63±永1.535*赤*像13.95±稼1.嚇20開**往2.06±0圓.宣30故**組500訴18.05±癥1.03**弓17.74±稿1.1俯3擦**送3.24±0嬌.3邊2也**兇溶劑對照吉0荒6.65±0突.39勇7.81±0如.40凍0.86±0微.06辰注丈：繼1.全莖數(shù)據(jù)均配以箏mean±S愛.E.誕M淚表帽示錫;粗2.洪**:索P返<錫0.0原1艙。夠從艱表貴2葬中可以看出，攔與溶劑對照相毒比，賄除醫(yī)7病月西石橋進(jìn)水捕和唇1鳳2別月長蕩湖湖心守水樣的低劑量燃組腦（勸20mL冊/貫管）寇在窯T警D圾這一指標(biāo)上無豐統(tǒng)計差異外，羨其它各水樣濃懇集物均有顯著京或極顯著差掏異墨(P<0.0紹5致，同P<0.0龜1評)忙，且隨著劑量劈的加大，受損思的程度也加重溉。同時，多重刮比較的結(jié)果表乘明圾，圈7青月份對人血淋喜巴細(xì)所胞弊DN軍A饑損傷程度大小懲順序為長蕩湖叨湖心水樣、西魄石橋水廠出瞞水嗚>仇西石橋水廠進(jìn)賣水榜，放1踏2積月份長蕩湖湖夢心水公樣貓>鞋西石橋水廠進(jìn)醉水杰>燕西石橋水廠出融水挺（憂P<0.05蛛）做。同時，比較糟兩次不同時間風(fēng)的水樣可知，掠季節(jié)變化變化暑對水質(zhì)影響顯甩著，其墻中聞7邀月份西石橋水撓廠進(jìn)水對人血敗淋巴細(xì)趙胞憐DN嫌A肢損傷程度極顯竭著臺（吳P<0.0旋1虹）小博于導(dǎo)1猾2話月份進(jìn)水，長社蕩湖湖心水遭樣銹7塊月份顯著牢（昌P<0.0詠5怒）小突于杏1翻2奉月份，而西石傻橋水廠出水水垂質(zhì)燦7旦月份大飼于會1剛2珍月份，但無統(tǒng)奴計學(xué)差異。期表狂2沖常州西石橋水使廠進(jìn)出水、長靠蕩湖湖心水樣者（料2003.咐7白，音2003.1距2頁）樸有機(jī)濃集物對科人淋巴細(xì)易胞頭DN援A公的損傷伶Table楊2DNA床damage表sinh蜘umanp桿eriphe稼ralbl湊oodly響mphocy疏tesex侵posed撈toorg粗anice茂xtract燃sfrom懸sourc徹eand夢tapwa語terof勾Xishi奮qiaow蝶aterwo歸rk,an假dwate喊rsamp太leof怠Changd均angLa仍ke(20蠢03.7,燥2003.1緩2)培水樣供染毒劑量爛（攜mL潛/間管）刊TailD萄NA等（％）械Taill雖ength身（班μ蘋m繩）專Olive熱TailM欲oment搶７月份企西石橋水廠進(jìn)誼水牙20緩7.08±0爹.43永11.39±喪0.58**濱1.29±0拔.10**藥100系11.48±堅0.63**諒13.89±碑0.71**買1.89±0焦.14**a辟500游15.90±監(jiān)1.48**腥18.42±院1.83**慣3.01±0熄.53**擺西石橋水廠出葬水啞20娛9.84±0歌.69**呢11.40±弱0.71**陳1.49±0碗.13**時100楚15.88±刮0.99**浮19.53±鹽1.18**奏2.83±0液.21**b脆500氧30.81±輩4.壞50漁**纖31.85±埋6.38**斥6.62±1善.49**帖長蕩湖湖心水蝕樣固20獸8.66±0芝.92*擇10.14±是1.16**衫1.25±0廊.15**我100僑16.16±摟1.19**珍18.77±屆1.36**覺2.93±0料.28**b逗500少31.79±漆2.84**既30.56±足2.5鋒4順**華7.51±0延.98**繼1短2弄月份塵西石橋水廠進(jìn)蟲水紀(jì)20粉9.57±0濤.30**件18.33±魯0.57**土1.78±0綱.07**粘100煮12.19±統(tǒng)0.63**朽22.06±什1.04**育2.80±0年.26**b餐500馳15.38±以0.98**蠶30.33±紗1.80**王4.59±0吹.48**爺西石橋水廠出高水苗20坐7.86±0沙.34*防12.25±篩0.52**洽1.31±0摩.08**諸100逗9.70±0濤.55**勿14.68±系0.81**獵1.95±0執(zhí).31**a眠500板16.57±系0.79**編29.95±恒1.57**伴4.26±0偵.36**理長蕩湖湖心水棟樣叢20湯7.21±0帆.54虧12.32±閃0.77**奶1.50±0儉.16**煎100武16.79±品0.6鹽5扣**廉25.25±恢0.96**鑄3.92±0倆.26**c揉500讓32.26±歷1.10**宣46.47±狐1.89**肯10.17±遣0.60**瑞溶劑對照蘋0克6.65瓦±鉗0.39傭7.81雜±甜0.40鐵0.86跨±疊0.06偉注奮：滅1.廊竄數(shù)據(jù)均受以予mean±S學(xué).E.旁M思表示；舌*萍：恢P血<0.05測，樓**:夕P諸<旨0.01垮2.損納以蔬100mL闖/矮管進(jìn)行組間比殃較，相同字母夜表示樣本間無煮差異，顯著性構(gòu)水平蛛為抓0.0夾5打；薪以宗100mL嗽/架管這一劑量組毫比較各水廠進(jìn)暫出水可知，無令錫睛充山水廠和中瀉橋水廠進(jìn)水對棍人淋姓巴細(xì)雪胞渾DN針A榜的損傷程度均風(fēng)高于其出廠水宏，但無統(tǒng)計學(xué)梯差異強(qiáng)（挺P咽>漢0.0招5體）；常州西石紋橋水亮廠光1妻2弄月份進(jìn)水對人濁淋巴細(xì)隔胞備DN釘A計的損傷程度高醉于出廠水傲（長P壯<驚0.0戶5泊），副而若7誘月份進(jìn)水低于險出廠水與（獵P撓<脂0.0士5火）。3討論土長江江蘇段衫干流水質(zhì)總體墳較好，水質(zhì)符而合地表水環(huán)境截質(zhì)量構(gòu)II彈類標(biāo)準(zhǔn)?；轃o錫充山、中具橋水廠都位于崗太湖北部梅梁析灣執(zhí),幻目前該水域的艘生態(tài)環(huán)境惡化姻已經(jīng)成為太湖疤最主要的生態(tài)聾環(huán)境問題，水滔質(zhì)類別為臂劣簡Ⅴ為類。壞長蕩湖為太湖摩流域第三大湖折泊，目前水質(zhì)劫基本滿抗足啟Ⅲ械類標(biāo)準(zhǔn)，水體擾營養(yǎng)狀況為中診營養(yǎng)，但近年忘來水質(zhì)也在逐晶漸變差。人淋施巴細(xì)胞彗星試學(xué)驗的結(jié)果與以褲上各水樣的污扎染狀況基本相作符。攝目前，水廠一拐般采用絮凝、舟沉淀、沙濾、疊炭濾和氯消毒董等常規(guī)處理工要藝來生產(chǎn)自來搏水氏[6]蜘。研究表明，襖氯化消毒可產(chǎn)剃生多種副產(chǎn)品聽，其中不乏具陣有致癌、促癌怒和致突變作用殿的物質(zhì)，從而稈使出廠水的致框突變性增高悟[7],[仔8]財。馬梅等亦[6]甘對不同原水及煤不同水處理工義藝流程出水有唉機(jī)濃集物進(jìn)行晶的致突變試驗季表明，加氯處鮮理后可生成一掃些直接致突變增性物質(zhì)及某些品經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化后想形成的致突變廟性物質(zhì)，機(jī)械河攪拌和絮凝不另太可能改變致禮突變性的狀況惹，而在此之后鞏的煤砂池和炭掉濾池能夠有效慢地去除加氯和俘絮凝過程中生尊成的致突變性誦物質(zhì)。邱志群異等添[9]返認(rèn)為，當(dāng)水源鹿水圣致攪DN遠(yuǎn)A說損傷物質(zhì)的本躁底值較高時，仔混凝沉淀對它駁的去除作用更蹤為明顯，從而漫使出水致突變姑性降低。凳由于無錫市兩匹水廠以太湖梅樹梁灣（水質(zhì)相刻對較差）為水虜源水，而常州置西石橋水廠以削長江（水質(zhì)相斷對較好）為水猶源水，同時考獎慮到水質(zhì)的季膏節(jié)變化（統(tǒng)計懇分析表驗明耽7機(jī)月份進(jìn)水的致浮突變性并極顯著地低統(tǒng)于而1小2抱月份進(jìn)水蹤，戀P<0.01我），所以結(jié)果喜與以上報道是辛相符的。霞自靜198云8傭年銜Sing錘h顏提出堿性電泳蠟法以來，各國滋對彗星試驗的超應(yīng)用研究幾乎億呈指數(shù)式增長換，在遺傳毒性真研究、臨床應(yīng)滿用堤、事DN拐A糾修復(fù)研究、環(huán)頸境生物監(jiān)測、購人群監(jiān)測等領(lǐng)窯域得到廣泛應(yīng)秧用賊[10]郊。人血淋巴細(xì)拾胞是彗星試驗呀最常用的生物喉材料之一，應(yīng)索用也最為廣泛私，如人群流行剩病學(xué)調(diào)查，環(huán)允境監(jiān)測、臨床灶應(yīng)用（如疾病懶診斷、藥效評此估、病因與發(fā)槐病機(jī)理分析等枕）翁[11]扮。壺Rajagu嫂ru救等曾將人血淋女巴彗星試驗應(yīng)嘉用于受污染地北表水的檢測，軋表明其在環(huán)境扎評價中有良好歉的應(yīng)用前景范[團(tuán)1運(yùn)2]灑。本實驗室曾歡利用其評價揚(yáng)油中市地表水的憲污染狀況扎[嫂1郵3]消。本文研究也思證實了其用于即檢測水體有機(jī)猜濃集物遺傳毒案性的可行性。賽然而，由于彗液星試驗程序尚屬未標(biāo)準(zhǔn)化，限兄制了其在實踐晃中的推廣應(yīng)用亭，所以有必要克進(jìn)一步加強(qiáng)彗暮星試驗的方法費(fèi)學(xué)研究。4結(jié)論健（枝1器）無錫充山水良廠、中橋水廠飯，常州西石橋沾水廠進(jìn)出水及繞金壇市長蕩湖膛湖心水樣的有捎機(jī)濃集物均沃可對人外周血滿淋巴細(xì)樹胞失DN英A近產(chǎn)生不同程度詞的損傷，存在是一定的遺傳毒球性。晉試驗結(jié)果與各黃水樣水質(zhì)污染洪狀況基本一致繞。同時，霉季節(jié)變化銜以及常規(guī)水處師理過程執(zhí)對驕水樣的遺傳毒愁性有影響。遠(yuǎn)（服2曬）彗星試驗可鏡有效地應(yīng)用于脊水中有機(jī)物遺鎖傳毒性的檢測輸，在環(huán)境監(jiān)測頌中有良好的應(yīng)副用前景，但有版必要對其進(jìn)行闖標(biāo)準(zhǔn)化以利于美實踐中的推廣裳應(yīng)用。參考文獻(xiàn)：先[1]垃朱惠剛王.構(gòu)水中有機(jī)致突旋變物綜合評價嶺指標(biāo)探討你[J].掌上海環(huán)境科學(xué)漿，涌1995恢,識14茂(顫10醬):知44-49你[2]芝馮霄穗,驗陸壽珍珍,嚷撒陳中孚澤.S誰O緊S巖顯色法檢測黃濾浦江不同江段層水中有機(jī)污染峽物的遺傳毒性茶[J]前.府復(fù)旦學(xué)剝報斯(妨自然科學(xué)凈版向)造,1990,漏29(2倒)情：編198-20登2察[3]紡Rojas攝E塞，添Lopez涌MC刷，籃Valver割deM末.Sing董lecel棗lgel訓(xùn)electr傭ophore霧sisas施say:m藝ethodo慮logya脫ndapp彈licati腸ons揪[J]肆.共JChr裂omatog涉rB,1扁999,72鉗2:22咐5席–懲254躲[4]并Singh貪NP,M景cCoyM逮T,Ti峽ceRR逼,罩etal.房Asim撈plete畏chniqu需efor箏quanti察tation裕oflo白wleve樸lsof甚DNAda典magei案nindi跨vidual摸cells刊[J].學(xué)ExpCe懇llRes恭,1988塞,175:咬184-19醋1敏[5]框Devaux籌A崖,Peso債nenM,詢Monod理G.Al極kaline泳comet鏈assay禮inra果inbow飛trout魯hepato條cytes坦[J].T道oxicol惱inVi飯tro,1舅997,11撇:71~79摟[6]靈馬梅，尚瑋，撇王子健等由.葛飲用水處理流摩程中有機(jī)提取艘物的毒性變化錫規(guī)律牙[J].歇腔環(huán)境科學(xué)話,副2001厲,差22混(依l擦):魄49-52濫[7]灘馬軍避.肌氯化消毒副產(chǎn)哨物的形成及對俗飲用水質(zhì)的影四響劃[J]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