植物組織培養(yǎng)實驗室的構(gòu)建與操作技術(shù)

植物組織培養(yǎng)實驗室的構(gòu)建與操作技術(shù)第1頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五

實驗室設(shè)計原則：保證無菌操作，達到工作方便，防止污染。實驗室的大小應(yīng)取決于工作的目的和規(guī)模按組織培養(yǎng)流程來設(shè)計，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂利用一定的設(shè)備、器材和特殊的實驗室結(jié)構(gòu)設(shè)計，達到嚴(yán)格無菌的條件第一節(jié)植物組織培養(yǎng)實驗室及主要設(shè)備一、實驗室設(shè)計與設(shè)備第2頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五組培的常見技術(shù)路線：外植體→愈傷組織→不定芽→生根→再生植株基本的工藝流程：容器具洗滌，物質(zhì)準(zhǔn)備→配置培養(yǎng)基并滅菌→外植體消毒與無菌操作接種→觀察、記錄、處理（脫分化、再分化、繼代）→再生植株第3頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五標(biāo)準(zhǔn)的組培實驗室洗滌室、準(zhǔn)備室、無菌室、培養(yǎng)室、觀察室等基本組培實驗室準(zhǔn)備室（含配藥室）、緩沖間、無菌操作室、培養(yǎng)室第4頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五第5頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五第6頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五功能：進行一切與實驗有關(guān)的準(zhǔn)備工作器皿洗滌、藥品的配制培養(yǎng)基配制與分裝培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿的滅菌培養(yǎng)材料的預(yù)處理等要求：明亮、通風(fēng)便于多人同時工作地面應(yīng)便于清潔，并應(yīng)進行防滑處理1、準(zhǔn)備室（化學(xué)實驗室）第7頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五準(zhǔn)備室主要儀器設(shè)備：工作臺藥品柜冰箱普通冰箱、低溫冰箱等。主要用于貯存母液、各種易變質(zhì)、易分解的化學(xué)藥品以及植物材料等。天平

感量0.001g的分析天平、感量0.0001g的電子天平（用于稱量微量元素和一些較高精確度的實驗用品）、感量為0.1g的托盤天平（用于稱取用量較大的糖和瓊脂等）放置在水平、干燥、不受震動的操作臺上第8頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五第9頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五(5)恒溫水浴鍋(6)蒸餾水發(fā)生器蒸餾水用于配制母液或培養(yǎng)基（普通實驗可以用自來水代替蒸餾水）(7)電爐(8)高壓滅菌鍋進行培養(yǎng)基、水和器械用具的滅菌第10頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五不銹鋼蒸餾水器（單蒸水）第11頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五第12頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五(9)酸度計測定培養(yǎng)基及酶制劑的pH值（普通實驗可使用pH試紙）(10)烘箱干燥洗凈的玻璃器皿，也可用于干熱滅菌和測定干物重(11)搖床振蕩培養(yǎng)(12)離心機分離培養(yǎng)基中的細胞以及解離細胞壁后的原生質(zhì)體第13頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五PHS-802中文臺式酸度計通用型或經(jīng)濟型酸度計全溫型恒溫培養(yǎng)搖床多振幅高速軌道搖床第14頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五２、緩沖室（注意門的朝向）工作人員在此換上工作服、拖鞋，戴上口罩功能減少人體從外界帶入的塵埃等污染物。要求緩沖間需3-5平方米，應(yīng)保持清潔無菌；有清潔的實驗用拖鞋、已滅菌過的工作服；

1-2盞紫外燈定時照射，對衣物及空間進行滅菌。第15頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五３、無菌操作室（接種室）功能

外植體消毒、接種、培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移、試管苗的繼代、原生質(zhì)體的制備等要求環(huán)境干爽，清潔，居于上風(fēng)位空間宜小不宜大地面、天花板及四壁密閉光滑，無衛(wèi)生死角室內(nèi)物品越少越好，盡可能減少空氣流動維護方法定期消毒（紫外線照射、氣霧熏蒸、藥品噴灑）及時維護（干燥、潔凈）第16頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五第17頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五接種室主要設(shè)備及用具

接種箱

主體為玻璃箱罩、入口有袖罩超凈工作臺

操作臺面半開放，方便、操作舒適；通過過濾的空氣連續(xù)不斷吹出，大于0.03um直徑的微生物很難在工作臺的操作空間停留解剖鏡

分離微莖尖、轉(zhuǎn)基因等無菌操作用的器具

酒精燈、鑷子、解剖刀，解剖刀片、剪刀、培養(yǎng)瓶，刀剪架等第18頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五第19頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五第20頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五４、培養(yǎng)室功能

接種的材料進行培養(yǎng)生長的場所（其設(shè)計以充分利用空間和節(jié)省能源為原則）。要求：能控制光照和溫度保持相對的無菌環(huán)境有排風(fēng)窗和換氣扇等培養(yǎng)室的換氣裝置有適宜的培養(yǎng)架，日光燈照明。

主要設(shè)備培養(yǎng)架、培養(yǎng)箱、空調(diào)機、除濕機、換氣扇、臭氧發(fā)生器等。第21頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五第22頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五第23頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五小型臭氧發(fā)生器第24頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五二、培養(yǎng)器皿及用具1、培養(yǎng)器皿（包括玻璃器皿和塑料器皿）各種規(guī)格的培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、培養(yǎng)瓶。2、微孔過濾器（細菌過濾器）

0.45微米，抽濾滅菌用，如激素3、器械用具鑷子、剪刀、解剖刀、接種針（鏟）等。第25頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五第26頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五思考題1、一個正規(guī)的組織培養(yǎng)實驗室應(yīng)具備哪些房間？2、組織培養(yǎng)常用的設(shè)備有哪些？各有何用途？第27頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制定義：培養(yǎng)基(culturemedium)——根據(jù)植物生長所需營養(yǎng)成分，配制成的供植物生長的人工制作的營養(yǎng)物質(zhì)。是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。不同植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官找到一合適的培養(yǎng)基，是培養(yǎng)成功的基礎(chǔ)。第28頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五一．培養(yǎng)基成分主要為：

水無機鹽有機化合物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)培養(yǎng)體的支持材料第29頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五１．水水是植物體的重要組成成分，是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒，是生命活動過程中不可缺少的物質(zhì)。培養(yǎng)基大部分是水（固體培養(yǎng)基約75—80%）天然水或自來水不能直接用于培養(yǎng)基配制原生質(zhì)體培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)及分生組織培養(yǎng)一般應(yīng)用雙蒸水或超純水。大批量快速繁殖培養(yǎng)，可用單蒸水或純凈水。

保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性防止貯藏過程發(fā)霉變質(zhì)第30頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五２．無機鹽類(inorganicelement）離體組織生長發(fā)育的基本成分，根據(jù)植物對必需元素需要的量，可以分為：大量元素微量元素第31頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五大量元素指植物所需元素的濃度大于0.5mmol／L的元素，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。除C、H、O外，其它礦質(zhì)元素通常以一定濃度的無機化合物形式，按一定比例配制而成，溶于水中以離子態(tài)被吸收N有硝態(tài)氮KNO3和銨態(tài)氮(NH4)2SO4兩種形式（一般NH4—N對植物生長較為有利）。

第32頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五微量元素

濃度小于0.5mmol／L的元素，有

Fe、Cu、Zn等。

鐵鹽在合成葉綠素中起重要作用，缺鐵影響到胚的發(fā)育，阻礙子葉變綠。第33頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五3.有機化合物(organiccompound)

[基本培養(yǎng)基（只含有大量和微量元素）]為使培養(yǎng)物的生長更好，還需添加各種有機成分：糖類、維生素、醇類、嘌呤、氨基酸等（１）糖類（碳水化合物）碳源，維持培養(yǎng)基的滲透壓在1.5-4.1MPa。多使用蔗糖。

不同濃度會影響細胞的增殖分化，試管苗生長與繁殖濃度2-3%，幼胚培養(yǎng)4-6%，某些特殊培養(yǎng)中用8-10%。細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)還用麥芽糖、葡萄糖、果糖第34頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五（２）維生素明顯的促進離體培養(yǎng)物的生長。鹽酸硫胺素-VB1、鹽酸吡哆醇-VB6、煙酸、生物素、抗壞血酸-Vc等。一般用量為0.1～1.0mg／L。（３）肌醇（環(huán)己六醇）促進胚狀體和芽的形成。用量一般50-100mg/L。（５）氨基酸

常用甘氨酸和多種氨基酸混合物（水解酪蛋白、水解乳蛋白）用量在10-1000mg／L之間。（營養(yǎng)豐富，極易引起污染，如在培養(yǎng)中無特別需要，以不用為宜。）

第35頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五（６）

天然復(fù)合物（包括部分蛋白質(zhì)水解物）其成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促進作用，但對器官的分化作用不明顯。成分大多不清楚，一般盡量避免使用。第36頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五椰乳

使用最多、效果最大。用量為10%—20%（愈傷、細胞培養(yǎng)）。香蕉汁用量為150-200ml／L，緩沖pH值（蘭花組培）。馬鈴薯

用量為150—200g／L，緩沖pH值。其他

酵母提取液、麥芽提取液、蘋果和番茄的果汁等。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時使用，有時有效。

第37頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五４、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（植物激素）

植物激素（hormone）是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，能以極微小的量影響到植物的細胞分化、分裂、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等多種生理生化活動，是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)。主要包括：生長素、細胞分裂素、赤霉素生長素0.05-5mg／L細胞分裂素0.05—10mg／L。第38頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五（１）生長素類(auxin)

生長素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，促進細胞脫分化，誘導(dǎo)根的分化和促進細胞伸長生長。天然的生長素?zé)岱€(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。組織培養(yǎng)中常用人工合成的生長素類物質(zhì)常用IAA、IBA、NAA、2,4-D配成1mg/ml的溶液貯于冰箱中第39頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五IAA--天然生長素，亦可人工合成，其活力較低，是生長素中活力最弱的激素，對器官形成的副作用小，高溫高壓易被破壞，受光也易分解NAA--啟動能力比IAA高出3-4倍，可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，應(yīng)用較普遍IBA--促進發(fā)根能力較強NAA和IBA廣泛用于生根，并與細胞分裂素互作促進芽的增殖和生長。2，4—D--啟動能力比IAA高10倍，特別是促進愈傷組織的形成，同時強烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應(yīng)第40頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五腺嘌吟的衍生物，包括6-BA、Kt、Zt等。其中Zt活性最強，但非常昂貴，常用的是6-BA。作用：誘導(dǎo)芽的分化促進側(cè)芽萌發(fā)生長促進細胞分裂與擴大（莖增粗），抑制根的分化，延緩衰老多用于誘導(dǎo)不定芽的分化、芽的增殖。

（２）細胞分裂素類(cytokinin，CTK)第41頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五（３）赤霉素（gibberellicacid）有20多種，培養(yǎng)基中添加的是GA3，一般極少使用作用促進幼苗莖的伸長生長促進胚發(fā)育成小植株；離體培養(yǎng)下，還與生長素協(xié)調(diào)作用對形成層分化有影響當(dāng)生長素／赤霉素比值高，木質(zhì)部分化，比值低，韌皮部分化。打破休眠，促進種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。在器官形成后，添加赤霉素有時可促進器官或胚狀體的生長第42頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五激素配比模式

生長素/細胞分裂素的比值決定分化發(fā)育的方向，是愈傷組織、長根還是長芽。生長素/細胞分裂素高利于根、愈傷組織的形成適中利于根芽的分化低有利于芽的形成

生長素與細胞分裂素同時使用有協(xié)調(diào)作用。同時其在培養(yǎng)基中的絕對值也會影響外植體分化發(fā)育的方向。第43頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurface

Veryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.TheresultiscomparablewiththecontrolmediumtissuecultureintheAfricanViolet第44頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五No6-BA

6-BAreducedto0.1mg.l-1

NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1

Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant第45頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五NAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.

MSsaltsreducedto0.47g.l-1

SomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsMSsaltsincreasedto9.52g.l-1

Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.第46頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五５．其它附加成分（１）瓊脂(agar)

是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。組織培養(yǎng)中最常用作凝固劑，是最方便、最好的凝固劑和支持物，常用量6-10g／L

，不是培養(yǎng)基必需成分。（２）活性炭(activecarbon)

常用的吸附劑，某些培養(yǎng)類型中，可以吸附培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的一些有毒物質(zhì)，有利于培養(yǎng)物的生長。常用濃度0.5%左右，其吸附作用選擇性較差，常受溫度影響，低溫吸附效果好，高溫吸附能力降低甚至解吸附。

第47頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五二、常用培養(yǎng)基的種類、配方及特點１、培養(yǎng)基種類根據(jù)作用分：誘導(dǎo)培養(yǎng)基：誘導(dǎo)外植體啟動生長。增殖培養(yǎng)基：誘導(dǎo)離體培養(yǎng)苗擴大繁殖。生根培養(yǎng)基：誘導(dǎo)離體培養(yǎng)苗生根。根據(jù)營養(yǎng)水平分：基本培養(yǎng)基：包含無機鹽等基本營養(yǎng)成分。完全培養(yǎng)基：包含使植物離體生長全面營養(yǎng)。第48頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五培養(yǎng)基的種類1681，出現(xiàn)由無機鹽組成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作為基本的無機鹽培養(yǎng)基40年代多用White培養(yǎng)基60年代至今大多采用MS等高濃度培養(yǎng)基（可以保證培養(yǎng)材料對營養(yǎng)的需要，由于濃度高，在配制、消毒過程中某些成分有些出入，也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡）

培養(yǎng)基的名稱，多以發(fā)明人的名字來命名，也有對某些成分進行改良稱作改良培養(yǎng)基。第49頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五MS培養(yǎng)基

無機鹽和離子濃度較高，硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高。B5培養(yǎng)基

含有較低的銨，雙子葉植物特別是木本植物許多都適于用B5。White培養(yǎng)基

1963年又作了改良，稱作White改良培養(yǎng)基。無機機鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。N6培養(yǎng)基

成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。KM—8P培養(yǎng)基

有機成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)融合的培養(yǎng)。第50頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五三、培養(yǎng)基的配制１、母液的配制和保存母液是欲配制液的濃縮液保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性，減少微量元素用藥稱量誤差配制時能快速移取，減少稱藥麻煩便于低溫保藏。一般母液配成比所需濃度高10-100倍。第51頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五注意事項濃度高耐貯存，但準(zhǔn)確度低；濃度過低不耐貯避免不恰當(dāng)混合引起沉淀母液保存在5℃冰箱中，出現(xiàn)沉淀、霉變的不能使用母液濃縮倍數(shù)=（稱取藥物的量×1000ml）/（每升培養(yǎng)基需藥物量×母液體積）第52頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五（１）大量元素

可以混在一起配制成10—100倍液（常用50倍）

高濃度的Ca2+和Mg2+會與磷酸鹽混合，產(chǎn)生不溶性沉淀，應(yīng)單獨配制/或者單獨配制CaCl2

也可（２）微量元素可配成50-1000倍（常用100、200倍）混合母液，KI可單獨配。第53頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五（３）鐵鹽

硫酸亞鐵和EDTA鈉鹽易沉淀，需單獨配制，配成100—200倍鰲合劑不易沉淀。（４）有機化合物維生素、肌醇、氨基酸等一起配成100或200倍液，也可分別配制。第54頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五（５）激素每種單獨配成母液儲于冰箱，濃度一般為0.5－1mg/ml。一般一次只配50ml或100ml。

激素難溶于水，配制母液時用95%酒精或

1NHCl，1NNaOH溶解后再定容。生長素類用NaOH、細胞分裂素用HCl溶解第55頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五（6）有機附加物椰乳液體胚乳（紗布濾渣）---80℃水浴濾液（20分鐘）---過濾（去蛋白）---高溫高壓滅菌---冰箱保存酵母提取液酵母粉（加水煮沸30分鐘）----過濾去渣---消毒第56頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五２、培養(yǎng)基的配制及滅菌培養(yǎng)基配制程序：取適量蒸餾水放入容器將母液取出混合將瓊脂和糖加入容器蒸餾水定容至所需體積調(diào)整pＨ分裝培養(yǎng)瓶培養(yǎng)基的滅菌：濕熱滅菌法，滅菌15~20min某些遇熱不穩(wěn)定的物質(zhì)如IAA、ZT等進行過（抽）濾滅菌第57頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五第三節(jié)外植體的選擇與培養(yǎng)

植物細胞組織培養(yǎng)的成敗除與培養(yǎng)基的組分有關(guān)外，另一個重要因素就是外植體本身，為了使外植體適于在離體培養(yǎng)條件下生長，使組織培養(yǎng)工作順利進行，有必要對外植體進行選擇與處理。第58頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五一、外植體的選擇有代表性的主要植物優(yōu)良的種質(zhì)、特殊的基因型在植株生長的最適時期取材（花藥培養(yǎng)在單核期取材）大小一般在0.5-1.0cm之間（胚胎培養(yǎng)或脫毒在0.5cm以下），材料太大易污染，材料太小難于成活。從生長健壯的無病蟲害的植株上選取發(fā)育正常的器官和組織。最好采用莖尖，后代性狀較穩(wěn)定，攜帶細菌較少。第59頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五二、外植體的滅菌外植體選取流水沖洗（轉(zhuǎn)入超凈工作臺）70%酒精表面消毒20~60s

無菌水沖洗

消毒劑處理無菌水充分洗凈備用三、外植體的接種（無菌操作）

外植體的接種是把經(jīng)過表面滅菌后的植物材料切碎或分離出器官、組織、細胞、轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程。整個過程均需無菌操作。（1）借助接種用工具將材料切割分離。第60頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五（2）將培養(yǎng)基放入超凈工作臺內(nèi)，火焰灼燒培養(yǎng)基瓶口，然后打開培養(yǎng)瓶口，置培養(yǎng)瓶為斜角，避免灰塵雜菌落入瓶中。（3）迅速將切割分離下的所需組織、細胞、器官，放入培養(yǎng)基上，及時蓋上瓶蓋。（4）工具用后應(yīng)及時滅菌，避免交叉污染。（5）工作人員操作時禁止不必要的談話。第61頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五四、外植體的培養(yǎng)主要因素：光照、溫度、濕度、氧氣１、光照光照強度、光質(zhì)以及光照時間，對細胞的增殖、器官的分化都有很大影響。除特殊要求外，一般都采用日光燈作光源，光照強度1000-5000Lx，根據(jù)不同植物或器官需要，可以每天連續(xù)光照12-16小時，也可每天光照16小時，8小時黑暗。２、溫度大所數(shù)植物最適溫度在23-32℃之間。培養(yǎng)室溫度是25±2℃。第62頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五３、濕度

培養(yǎng)瓶內(nèi)相對濕度常是100%，培養(yǎng)室一般要求相對濕度保持在70-80%，相對濕度過低影響培養(yǎng)物生長和分化，應(yīng)向室內(nèi)噴灑水，以提高濕度；過高雜菌滋生，大量污染，應(yīng)及時地通風(fēng)除濕。４、氧氣

接種時要有部分組織和空氣接觸。振蕩培養(yǎng)是解決通氣的良好辦法。固體培養(yǎng)中，如瓶塞不透氣，培養(yǎng)物也不能生長，要選擇通氣性好的培養(yǎng)瓶蓋，增加可利用的氧氣，迅速除去釋放出來的CO2，有利于外植體外層細胞開始分裂。５、pH值

不同的植物對培養(yǎng)基最適pH值的要求也是不同的，大多在5～6.5左右，一般培養(yǎng)基皆要求5.8，這基本能適應(yīng)大多植物培養(yǎng)的需要。第63頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五五、外植體的成苗途徑外植體的成苗途徑有三種：（一）外植體-愈傷組織-完整植株同時長芽和根-植株芽-根-植株根-芽-植株（二）外植體-胚狀體-植株器官上愈傷組織游離單細胞小孢子誘導(dǎo)胚狀體比誘導(dǎo)芽數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整（三）外植體-直接形成根與芽-植株第64頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五六、培養(yǎng)中常見問題（一）污染病原菌：細菌、真菌⑴細菌污染：菌斑呈黏液狀，接種后1-2天發(fā)現(xiàn)。污染途徑：外植體帶菌；培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底操作人員未遵守操作規(guī)程

⑵真菌污染：污染部分長有不同顏色的霉菌，接種后3-10天發(fā)現(xiàn)。污染途徑：周圍環(huán)境不清潔；超凈工作臺過濾裝置失效；培養(yǎng)瓶的口徑過大在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象第65頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五第66頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五2、污染的預(yù)防措施（6點）（１）防止材料帶菌的措施莖尖作外植體時，進行預(yù)培養(yǎng)（無糖）或暗培養(yǎng)，以新抽嫩枝作外植體。晴天取材，下午取材，經(jīng)日曬可殺死部分細菌或真菌接種時除去外部韌皮組織，只接內(nèi)部的分生組織。（2）外植體的滅菌多次滅菌法：次氯酸鈉-無菌水-次氯酸鈉多藥劑交替法：肥皂水-酒精-次氯酸鈉-無菌水第67頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五⑶器皿與金屬器械的滅菌玻璃器皿可采用濕熱滅菌或干熱滅菌金屬器皿一般火焰滅菌，也可干熱滅菌（135-140攝氏度滅菌3-5h；160-170攝氏度滅菌2-4h；180-200攝氏度滅菌0.5-1h）⑷布質(zhì)制品的滅菌濕熱滅菌⑸無菌操作室的滅菌

2%新潔爾滅或70%酒精擦拭（噴霧），紫外燈照射，定期甲醛和高錳酸鉀熏蒸。⑹嚴(yán)格按照無菌操作程序進行在干燥環(huán)境（如火焰或干熱空氣）進行滅菌的技術(shù)第68頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五（二）褐變基因型外植體的生理狀態(tài)幼年的材料、分生組織含醌類物質(zhì)較少培養(yǎng)基的成分無機鹽濃度過高生長調(diào)節(jié)物質(zhì)使用不當(dāng)，BA過多培養(yǎng)條件不適宜，溫度過高或光照過強材料轉(zhuǎn)移時間時間過長引起材料褐變外植體體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細胞內(nèi)的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類物質(zhì)，這種致死的褐變物向外擴散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，抑制其它酶的活性，影響外植體的分化，最后變褐死亡的現(xiàn)象。1、影響因素第69頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五⑴選擇適宜的外植體及最佳培養(yǎng)基⑵提高轉(zhuǎn)管率⑶加抗氧化劑（抗壞血酸、PVP、牛血清白蛋白等）⑷加活性炭

0.1-0.5%活性炭

2、褐變的防止措施第70頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五（三）玻璃化（Vitrification）組培苗外觀形態(tài)呈半透明狀的生長異常現(xiàn)象葉、嫩梢呈水晶透明或半透明水浸狀；矮小腫脹失綠；葉片皺縮卷曲、脆弱易碎葉表幾無角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織體內(nèi)含水量高，干物質(zhì)低，光合能力和酶活性降低，組織畸形，器官功能不全，分化能力降低生根困難，很難繼續(xù)培養(yǎng)和移栽成活第71頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五⑴激素：CTK濃度、比例過高（繼代次數(shù)太多）⑵瓊脂：瓊脂濃度低（培養(yǎng)基太“稀”）⑶溫度：低溫⑷光照時間：光照太多、太強⑸通風(fēng)條件：氣體交換不良(6)離子水平：無機離子種類及比例不當(dāng)主要原因第72頁，共80頁，2023年，2月20日，星期五提高蔗糖和瓊脂濃度（提高滲透勢）適當(dāng)降低細胞分裂素和赤霉素濃