發(fā)光法測(cè)定菌體ATP含量課件

發(fā)光法測(cè)定菌體ATP含量1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.實(shí)驗(yàn)原理3.試劑4.實(shí)驗(yàn)材料與儀器5.操作步驟及結(jié)果

一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.理解ATP的理化特性和生理功能;2.學(xué)會(huì)用熒火蟲(chóng)素-熒火蟲(chóng)素酶生物發(fā)光法定量測(cè)定ATP含量的方法;3.理解ATP生物發(fā)光原理及應(yīng)用研究。二.實(shí)驗(yàn)原理

生物發(fā)光(bioluminescence)在希臘語(yǔ)中表示活著的意思,在拉丁語(yǔ)中表示發(fā)光、發(fā)亮的意思。目前，生物發(fā)光應(yīng)用最廣最主要的是熒光素-熒光素酶反應(yīng)發(fā)出的熒光，熒光素酶存在于熒火蟲(chóng)、水母一上些細(xì)菌中，它是生物內(nèi)產(chǎn)生的一種生物反應(yīng)蛋白質(zhì)。

當(dāng)細(xì)胞受損或死亡時(shí)，其ATP值迅速下降或消失，基于這一原理，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ATP含量，即可反應(yīng)細(xì)胞的存活狀況，ATP濃度與活細(xì)胞數(shù)密切相關(guān)。檢測(cè)時(shí)先將ATP與提取劑充分混合，使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜裂解，釋放ATP，再加入熒光素-熒光素酶，ATP在熒光素和熒光素酶的作用下，使其釋放磷酸基團(tuán)同理發(fā)出熒光，用生物熒光儀檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度（relativelightunits,RLU）,由此測(cè)出ATP含量，進(jìn)而反映活細(xì)胞數(shù)。3.應(yīng)用研究檢測(cè)環(huán)境是否被有害的微生物污染，食品衛(wèi)生的檢測(cè)和生產(chǎn)環(huán)境實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)（HACCP）等。用于乳制品的檢測(cè)、調(diào)味品如脫水蔬菜的細(xì)菌學(xué)的測(cè)定。新藥篩選及療效評(píng)價(jià)：廣泛應(yīng)用于需要進(jìn)行大量快速初選工作的新藥篩選中。細(xì)胞免疫活性檢測(cè)應(yīng)用：ATP生物發(fā)光法還可測(cè)定T細(xì)胞的免疫活性。三.試劑

1.熒光素-熒光酶試劑將解凍后的12mlReocnstiuttoinBueffr與熒光素酶-熒光素粉劑混合，輕輕搖晃（不能振蕩）使其溶解。第一次使用前在室溫下放置1h，以后只需20min左右。不用時(shí)要放置在-20oC下保存。

3.緩沖液

以Tris-Acetate作為緩沖液。稱取一定量的Tris堿，使定容后的濃度為0.05mol/l，定容前需要先調(diào)節(jié)PH值。將PH計(jì)插入TrisI溶液中，慢慢滴加乙酸溶液，直到PH值為7.8，然后定容，在4oC下保存。

4.ATP提取液

采用三氯醋酸（TCA）作為ATP提取劑，濃度為0.03g/ml，在4oC下保存。對(duì)于不同的微生物，采用不同的濃度進(jìn)行提取，細(xì)菌和真核細(xì)胞的提取濃度一般為0.005-0.025g/ml，酵母真菌類則適當(dāng)高一些。提取結(jié)束后，要用緩沖液將TCA的濃度稀釋到一定的濃度，再進(jìn)行測(cè)量，以減少TCA對(duì)反應(yīng)的影響。四.實(shí)驗(yàn)材料與儀器TD-20/20熒光光度計(jì)抽濾器及真空泵（過(guò)濾微生物進(jìn)，采用0.22微米的濾膜）PH計(jì)。TCA法TCA法是目前最常用的ATP提取方法。TCA對(duì)活細(xì)胞有兩種作用：一是破裂細(xì)胞，釋放ATP，二是ATP水解酶失活。提取普通微生物中的ATP時(shí)，TCA濃度為0.015g/m此濃度下，TCA對(duì)ATP與熒光素酶的生物發(fā)光反應(yīng)較強(qiáng)的抑制作用，必須在反應(yīng)前對(duì)提取液進(jìn)行中和，稀釋。使TCA濃度小于或等于0.001g/ml，此時(shí)TCA對(duì)反應(yīng)的影響基本可以忽略。一般采用PH7.8左右的Tris-Aectate緩沖液進(jìn)行稀釋。具體操作

取樣品（如河水等，如果是固體樣品需用水懸浮后取上清或勻漿）2ml置于試管中

↓↓加入2mlTCA溶液，震蕩提取得3min取1ml提取液置于50ml容量瓶中，用PH7.8的Tris-Aectate緩沖液定容稀釋后的提取液置于4oC下保存待測(cè)?！藭r(shí)TCA的濃度為0.0003g/ml，不會(huì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生影響

加熱煮沸法加熱煮沸法是前期研究中采用較多的ATP提取方法。該方法先將樣品中的微生物過(guò)濾出來(lái)，再將其置于緩沖液中加熱煮沸提取ATP。

抽濾裝置包括真空泵、濾瓶、緩沖瓶

濾膜采用0.22μm孔徑的醋酸纖維濾膜

高溫加熱的作用主要是破碎細(xì)胞同時(shí)使細(xì)胞內(nèi)ATP水解酶失活

2.ATP的檢測(cè)1)先用標(biāo)準(zhǔn)ATP試劑作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)量得到樣品的相對(duì)發(fā)光值.2)測(cè)定樣品發(fā)光值,與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，得到樣品中的ATP含量,ATP含量可以轉(zhuǎn)化為微生物的濃度.

測(cè)量熒光所用的儀器是TD-20/20熒光光度計(jì)，一般將儀器的設(shè)置延遲時(shí)間設(shè)為60s

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

在測(cè)定管中加入50μl一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和50μl緩沖液，測(cè)定管置于樣品室中，加入100μl熒光素-熒光酶反應(yīng)劑后迅速蓋上樣品室的蓋子，開(kāi)始檢測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)液濃度分別為10-7mol/l、10-8mol/l、10-9mol/l、10-10mol/l、10-11mol/l

空白值用去ATP水代替不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3次取平均值。以ATP濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，熒光反應(yīng)值RLUS的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可見(jiàn)，在一定的范圍內(nèi)，ATP濃度與熒光反應(yīng)發(fā)光值之間有較好的線性關(guān)系，樣品中ATP濃度與相對(duì)發(fā)光值對(duì)應(yīng)。樣品測(cè)定及結(jié)果用50μl樣品提取液代代替標(biāo)準(zhǔn)ATP試劑，具體操作與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線一樣。最后ATP濃度與微生物濃度之間的轉(zhuǎn)化，是基于每個(gè)微生物包含5x10-16gATP。

注意:熒光素酶的活性衰減很快，在室溫下熒光素酶試劑只能保存8h，如果測(cè)定過(guò)程8h則應(yīng)將熒光素酶反應(yīng)劑健壯在多支小管中