緒論細胞工程CellEngineering課件

細胞工程(CellEngineering)課程初步安排：

第一章緒論

第二章植物細胞工程的理論基礎

第三章實驗室配置及基本技術：

第四章植物組織器官培養(yǎng)技術

第五章植物細胞培養(yǎng)及次生代謝產物生產

第六章原生質體培養(yǎng)和體細胞雜交

第七章人工種子

第八章植物種質資源離體超低溫保存

第九章動物組織培養(yǎng)

第十章動物細胞融合與單克隆抗體

第十一章動物組織與胚胎工程

第十二章試管動物與克隆動物

第十三章微生物細胞工程教材與參考書植物細胞工程原理與技術，中國農業(yè)大學出版社，2001組織工程，楊志明，化學工業(yè)出版社，2002植物細胞工程，朱至清，化學工業(yè)出版社，2002動物細胞工程，徐永華，化學工業(yè)出版社，2002細胞工程，李志勇，科學出版社，2003植物細胞工程謝從華柳俊主編,高等教育出版社，2004細胞工程安利國主編，科學出版社出版，2005一定義

細胞工程是指應用細胞生物學和分子生物學的方法，通過類似于工程學的步驟，在細胞整體水平或細胞器水平上，按照人們的意愿來改變細胞內的遺傳物質以獲得新型生物或一定細胞產品的一門綜合性科學技術。廣義的細胞工程包括所有的生物組織、器官及細胞離體操作和培養(yǎng)技術，狹義的細胞工程則是指細胞融合和細胞培養(yǎng)技術。

根據研究生物類型不同，細胞工程可分為動物細胞工程、植物細胞工程、微生物細胞工程。

動物細胞工程包括：細胞培養(yǎng)技術（包括組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)）；細胞融合技術；胚胎工程技術（核移植、胚胎分割等）；克隆技術（單細胞系克隆、器官克隆、個體克?。?/p>

植物細胞工程包括：植物組織、器官培養(yǎng)技術；細胞培養(yǎng)技術；原生質體融合與培養(yǎng)技術；亞細胞水平的操作技術等。

根據實驗操作對象可分為：

細胞與組織培養(yǎng)

細胞融合

細胞核移植

染色體操作

轉基因生物等

1、細胞與組織培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)（cellculture）和組織培養(yǎng)（tissueculture）都屬于體外培養(yǎng)（invitroculture），是指生物細胞和組織在離體條件下的生長和增殖。是細胞工程的最基本技術。

試管植物3、細胞核移植(nucleartransplantation)

利用顯微操作技術將細胞核與細胞質分離，然后再將不同來源的核與質重組，形成雜種細胞。

體細胞克隆羊——多莉全球首只克隆貓ＣＣ和“媽媽”在一起世界第一只克隆寵物

北京第2頭克隆牛誕生生命源于牛耳細胞

（1）既然綿羊的體細胞可以被成功地克隆成一個新的個體，是否意味著人類也可以克隆自己呢？（2）是否應該允許進行克隆人的實驗？

《時代》封面故事“爭論克隆人”

多利于1996年7月5日出生，2003年2月14日死亡。維爾穆特領導培育的世界上第一只體細胞克隆動物-克隆羊“多利”于2003年2月因肺部感染而死亡患關節(jié)炎時的多利

4、染色體工程(chromosomeengineering)

把單個的染色體或染色體組轉入或移出受體細胞，從而形成新的染色體組合和遺傳構成。

世界首例冷凍克隆牛胚胎移植犢牛在萊陽農學院降生6、干細胞與組織工程

干細胞（stemcell）是動物體內具有分化潛能，并能自我更新的細胞，分為胚胎干細胞和組織干細胞。

胚胎干細胞來自囊胚期的細胞團，屬于全能干細胞，每個細胞可以發(fā)育成為完整的個體。組織干細胞存在于成體組織中，屬單能或多能干細胞，可以定向分化為一種或幾種不同的組織。

組織工程是在干細胞的基礎上發(fā)展起來的，將干細胞與材料科學相結合，將自體或異體的干細胞經體外擴增后種植在預先構建好的聚合物骨架上，在適宜的生長條件下干細胞沿聚合物骨架遷移、鋪展、生長和分化，最終發(fā)育具有特定形態(tài)及功能的工程組織。

人工培養(yǎng)的肌肉曹誼林教授在小鼠身上培育的人耳如果能夠消除體細胞的“記憶”，它們就有可能恢復到胚胎細胞的狀態(tài)——科學家稱之為把細胞“重編程”。把通過“重編程”得到的干細胞在不同的環(huán)境條件下進行培養(yǎng)，就能得到各種分化細胞。人們通常把這種利用體細胞制造胚胎干細胞，分化后再移植回人體的技術稱作“治療性克隆”。

盛慧珍教授（右二）正在指導學生做實驗二.植物細胞工程的發(fā)展

1、植物細胞工程的概念

植物細胞工程是一門以植物組織和細胞的離體操作為基礎的實驗性學科。它是以植物組織細胞為基本單位，在離體條件下進行培養(yǎng)、繁殖或人為的精細操作，使細胞的某些生物學特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而改良品種或創(chuàng)造新物種，或加速繁殖植物個體，或獲得有用物質的過程統稱為植物細胞工程。

2、植物細胞工程的發(fā)展歷史

探索階段（1902-1929）

1902年，德國植物學家Haberlandt提出了高等植物的器官和組織可以不斷分割，直至分到單個細胞的觀點。他認為，如果每個細胞都有植物個體一樣的性質和能力，那么可以通過植物細胞培養(yǎng)，把單個細胞培養(yǎng)成一個新個體。

在此思想指導下，許多科學家從事組織培養(yǎng)研究.1904年，德國植物胚胎學家Hanning用蘿卜和辣根的胚進行離體培養(yǎng)，提早長成了小植株，首次獲得胚培養(yǎng)成功。

成熟發(fā)芽

常規(guī)，幼胚―→種子―→植物

培養(yǎng)

組織培養(yǎng)幼胚―→植株

1922年，Knudson對蘭花幼胚進行培養(yǎng)獲得幼苗，克服了蘭花種子發(fā)芽難的困難。

1922，Kotte和Robbins對豌豆、玉米、棉花等的莖尖、根尖進行了離體培養(yǎng)。發(fā)現了培養(yǎng)的分生組織只能進行有限的生長。

1925年，Laibach進行亞麻種間雜種幼胚培養(yǎng)，成功地得到了雜種植物。證明了胚培養(yǎng)在植物遠源雜交中利用的可能性。

培養(yǎng)技術建立階段（1930-1959）

作為一門技術，它必須具有一定的程序性。也就是說，它應該具有一定的技術模式。在這一階段，植物組織培養(yǎng)建立了兩個與培養(yǎng)技術有關的重要模式，一是培養(yǎng)基模式，二是激素調控模式。

1934年，White等用番茄根尖的組織培養(yǎng)，建立了第一個活躍生長的無性繁殖系。1934年，Gautheret培養(yǎng)山毛柳、黑楊的形成層組織，獲得愈傷組織形成。

1937年，White和Went等分別發(fā)現B族維生素和吲哚乙酸（IAA）對培養(yǎng)的離體根生長具有重要作用。

1937-1938年，Gautheret在1934年培養(yǎng)山毛柳、黑楊成功獲得愈傷組織的基礎上，在培養(yǎng)柳樹的培養(yǎng)基中，加入IAA和B族維生素等，使形成層的生長大為增加。

1937-1938年，Nobecourt培養(yǎng)胡蘿卜根和馬鈴薯的塊莖薄壁組織，獲得愈傷組織。將愈傷組織置于瓊脂培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，可無限發(fā)生細胞增殖，形成愈傷組織。首次從液泡化的薄壁細胞建立愈傷組織培養(yǎng)物。

White、Gautheret、Nobecourt等科學家被譽為植物組織培養(yǎng)的奠基人。在此基礎上建立了植物組織培養(yǎng)的綜合培養(yǎng)基，包括無機鹽成分、有機成分和生長刺激因素。這是隨后創(chuàng)立的各種培養(yǎng)基的基礎，同時也建立了植物組織培養(yǎng)的基本方法，成為當今各種植物組織培養(yǎng)的技術基礎。

40年代末開始，進行從脫分化細胞組織培養(yǎng)進入探討器官再分化的研究。

脫分化

細胞（組織、器官）—→

再分化

愈傷組織不定芽—→植株

不定根

脫分化：離體培養(yǎng)條件下，一個已分化的細胞回復到原始無分化狀態(tài)或分生組織細胞狀態(tài)或胚性細胞的狀態(tài)的過程就是細胞脫分化

再分化：脫分化后的分生細胞（愈傷組織）在特定的條件（離體培養(yǎng)）下，重新恢復細胞分化能力，并經歷器官發(fā)生形成單極性的芽或根，或經歷胚胎發(fā)生形成雙極性的胚狀體，進一步發(fā)育成完整生物體，這一過程稱為細胞再分化。

1957年Skoog和Miller提出了植物激素控制器官形成的概念，指出通過改變培養(yǎng)基中生長素和細胞分裂素的比率，可以控制器官的分化，即生長素和細胞分裂素高促進根的分化，低促進莖和芽的分化。

1958年，Steward和Reinert以胡蘿卜根的懸浮細胞誘導分化成完整的小植株，發(fā)現了體細胞胚，為細胞離體培養(yǎng)中研究形態(tài)發(fā)生機制開拓了新的領域。

應用研究階段（1960-）

1、原生質體培養(yǎng)和細胞融合。

1971年，Takebe等從煙草原生質體得到再生植株，首次獲得原生質體植株再生成功。

1972年，Carlson等通過兩個煙草物種之間原生質體的融合，獲得了第一個體細胞雜種植株。

1978年，Melchers進行了馬鈴薯和番茄的融合實驗，獲得了第一個屬間雜種植株

到目前為止，組織培養(yǎng)、原生質體培養(yǎng)、細胞融合已在許多植物上獲得再生成功。

2、微繁技術

1960年，Morel提出了利用莖尖離體快速繁殖蘭花的方法，在此基礎上，國際上建立了蘭花工業(yè)，取得了巨大的經濟效益和社會效益。

3、花藥培養(yǎng)技術

1973年，Nitch采用花藥預培養(yǎng)的方法，首次獲得了煙草花粉植株。

4、次生產物生產

3、植物細胞工程的任務

（1）研究植物器官、組織和細胞在離體培養(yǎng)條件下，所需要的有機營養(yǎng)、無機營養(yǎng)、植物激素等培養(yǎng)條件和刺激因素。

（2）研究植物器官、組織和細胞，在離體培養(yǎng)條件下，所需的溫度、濕度和光照等環(huán)境條件。

（3）研究植物的不同生理年齡、遺傳組成（基因型）在離體培養(yǎng)條件下，形態(tài)發(fā)生的規(guī)律。

（4）研究離體培養(yǎng)條件下再生植株群體的遺傳穩(wěn)定性和變異性。

三、動物細胞工程發(fā)展史

細胞融合現象的發(fā)現

19世紀30年代，Muller,Schwann,Virchow等相繼在肺結核、天花、水痘、麻疹等病理組織中觀察到多核細胞現象；

1849年Lobing在骨髓中也發(fā)現了多核現象的存在；

1855年～1858年，科學家們在肺組織和各種正常組織及發(fā)尖和壞死部位都發(fā)現了多核細胞；

1859年，A.Barli在研究黏蟲的生活史時發(fā)現，某些黏蟲存在著由單個細胞核融合形成多核的原生質團的情況。

據此，他認為多核細胞是由單個細胞彼此融合而形成的。至此，自然界中廣泛存在著多核細胞的事實，才被生命科學工作者接受。

動物細胞培養(yǎng)技術的建立

1907年，Harrison首先培養(yǎng)了蛙胚神經管區(qū)細胞，并觀察到從中長出的軸突細胞（神經纖維），他的工作被認為是動物細胞培養(yǎng)開始的標志；

1911年，Carrel發(fā)現了雞胚浸出液對于培養(yǎng)細胞的生長促進作用，并首次把無菌技術引入組織培養(yǎng)技術中。

1914年，Thomson建立了器官培養(yǎng)技術。

1940年，1951年，Earle和Gay分別建立了c3H小鼠結締組織細胞系的L系和人體細胞系－人體宮頸癌Hela細胞系。

A.Carrel細胞融合技術的建立和雜交瘤技術的誕生

1958年,Okada發(fā)現紫外滅活仙臺病毒可引起艾氏腹水瘤細胞彼此融合。

60年代，Harris(1965)誘導不同動物體細胞融合獲得成功并培養(yǎng)存活。

Lifflefield(1964)根據親本細胞的酶缺陷型，利用HAT選擇性培養(yǎng)基能使親本細胞死亡而只留下異型融合細胞，并能不斷地增殖，從此形成了細胞融合到雜種細胞選擇、培養(yǎng)的一整套技術。

1975年，免疫學家Kohler和Milstein利用仙臺病毒誘導綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，選擇到能分泌單一抗體的雜種細胞。該雜種細胞具有在小鼠體內和體外培養(yǎng)條件下大量繁殖的能力，并能長期地分泌單克隆抗體，從而建立了小鼠淋巴細胞雜交瘤技術。

動物克隆技術的建立

首例克隆動物成功的報道是在1962年，英國學者Grudon把非洲爪蟾小腸上皮細胞的核注入同種或異種非洲爪蟾未受精卵(經紫外線照射殺死卵細胞核)中，約有1％的重組卵發(fā)育成為成熟蛙。

這一成功開創(chuàng)了由體細胞培育動物個體的新型實驗途徑，其貢獻在于：實驗證明了完全分化的腸細胞仍然具有未分化細胞的全部遺傳信息，并能在一定的條件下發(fā)育成動物個體，從而證明了動物細胞仍然具有全能性；初步建立了體細胞核移植的實驗體系，證明在體細胞核轉至胚胎發(fā)育方向的早期，卵細胞質對體細胞核的發(fā)育功能起著關鍵性的調節(jié)作用，其作用因子可能是細胞質中的mRNA與有關的蛋白質。

四、重要應用

植物細胞工程的應用

（一）、脫毒和快速繁殖

許多植物，特別是無性繁殖植物，帶有病毒，并直接傳給子代，嚴重影響產量和質量。一般莖尖生長點不帶病毒。所以，利用莖尖培養(yǎng)再生的植株，可能不帶病毒，再進行大量繁殖生產脫毒苗。脫毒苗用于生產可明顯提高產量、質量和商品價值。目前已在許多植物上得到應用，如甘薯、馬鈴薯、草莓、果樹、花卉等。

許多名貴植物，之所以名貴，是因為繁殖系數太低，種子結實率低或者不結種