植物細(xì)胞凋亡研究概況

植物細(xì)胞凋亡研究概況摘要：細(xì)胞凋亡（programmedcelldeath）簡稱PCD，是一種由細(xì)胞內(nèi)部控制的主動死亡行為。普遍存在于動植物生長發(fā)育過程中，在個體發(fā)育、環(huán)境壓力以及與環(huán)境互作過程中起著極其重要的作用。植物細(xì)胞凋亡具有染色質(zhì)固縮和邊緣化、DNA片斷化、核的降解、質(zhì)膜內(nèi)縮、大量囊泡的出現(xiàn)、細(xì)胞壁的修飾等特征，是由相關(guān)的基因、蛋白酶以及細(xì)胞色素c介導(dǎo)和調(diào)控的。本文概述了植物細(xì)胞凋亡的分子機理、凋亡特征和檢測技術(shù)，并對植物細(xì)胞凋亡存在的問題進(jìn)行分析和展望。Abstract:Apoptosis(programmedcelldeath)referredtoasPCD,isanactivedeathbehaviorcontrolledbythecell'sinternal.Generallyexistsinthegrowthprocessofanimalandplant,whichplaysaveryimportantroleintheprocessoftheindividualdevelopment,environmentalpressureandtheenvironmentinteraction.Plantcellapoptosiswithchromatincondensationandmarginalization,DNAfragmentation,nucleardegradation,plasmamembraneretraction,alargenumberofvesiclesappeared,cellwallmodificationandothercharacteristics,ismediatedandregulatedbytherelatedgene,proteaseandcytochromec.Thispapersummarizesthemolecularmechanismofplantapoptosis,apoptoticfeaturesanddetectiontechnology,andcarriesontheanalysisandprospectontheexistingproblemsofplantcellapoptosis.細(xì)胞凋亡(細(xì)胞編程性死亡)是細(xì)胞的重要生命活動特征，對于多細(xì)胞生物個體發(fā)育的正常進(jìn)行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用，平衡及多種病理過程具有極其重要的意義。細(xì)胞凋亡的概念由Kerr[1]于1972年提出，當(dāng)時用來描述某些類型細(xì)胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，主動地結(jié)束其生命，最終脫落離體或裂解為若干凋亡小體而被其它細(xì)胞所吞噬的過程。細(xì)胞凋亡的主要特征包括：染色質(zhì)凝集、質(zhì)膜出芽、核裂解及凋亡小體的形成。二十世紀(jì)九十年代，在世界范圍內(nèi)廣泛興起對于細(xì)胞凋亡的研究，并在動物細(xì)胞凋亡的機理研究中取得了重大進(jìn)展。人們對植物細(xì)胞凋亡的研究起步較晚。Greenberg(1994)[2]等最早提出植物中存在程序性死亡的現(xiàn)象，即植物受病原體侵染時，自身的抗病基因被激活，同時促使感病部位的細(xì)胞死亡，抑制病原體的擴(kuò)散，這一現(xiàn)象稱過敏反應(yīng)(HypersensitiveReaction，HR)。在過敏反應(yīng)中可觀察到某些與動物細(xì)胞凋亡類似的特征。近來已有不少證據(jù)表明植物細(xì)胞中存在凋亡的現(xiàn)象。許多植物在發(fā)育過程中發(fā)生的死亡現(xiàn)象，如葉、心皮、花瓣的衰老、木質(zhì)部的發(fā)生、濕地植物通氣組織的形成、糊粉層的消失等實際上都是程序性死亡。通過研究人們也發(fā)現(xiàn)許多誘導(dǎo)植物細(xì)胞凋亡的因素，如病原體感、熱激、維生素K3、乙烯利、外源細(xì)胞色素c、羥自由基、高鹽等。人們發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞的凋亡具有某些與動物細(xì)胞凋亡相似的機制[3]。1植物細(xì)胞凋亡的特征細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征主要表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮；染色體凝集；大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)DNA片段化（fragmentation），經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)梯形條帶（DNALadder）；細(xì)胞骨架紊亂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)起泡，并與細(xì)胞膜融合，形成細(xì)胞質(zhì)氣泡；染色體段片、細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)被細(xì)胞膜包裹，形成凋亡小體。凋亡小體很快被巨噬細(xì)胞和鄰近的細(xì)胞所吞噬，由于死亡細(xì)胞的溶酶體酶無活性，因此凋亡細(xì)胞的清除不會產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。凋亡細(xì)胞表面皺縮并出現(xiàn)卷曲，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張并出現(xiàn)火山口樣的空腔，空腔與細(xì)胞膜相融合。細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞的生化特性也發(fā)生改變，例如一些蛋白酶被激活或抑制，核酸內(nèi)切酶激活等[4]。2細(xì)胞凋亡的分子機理2.1CaspaseCaspase蛋白酶(cysteineasparticacidspecificprotease)是一類半胱氨基酸蛋白酶。它在動物細(xì)胞程序性死亡(PCD)中既是水解蛋白質(zhì)的參與者，也是細(xì)胞程序性死亡的啟動因素。是動物PCD執(zhí)行階段的核心酶。它的活化直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞的解體。在植物衰老的早期，一些衰老相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物與Caspase有一定的同源性。已有證據(jù)表明植物細(xì)胞凋亡過程中也發(fā)生類似caspase的活化[5]。Olga等[6]用caspase特異性抑制劑Ac—YVAD—CMK(caspase一1抑制劑)和Ac—DEVD—CHO(caspase～3抑制劑)消除了煙草的細(xì)胞凋亡，第一次在細(xì)菌誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞中檢測到類似caspase的活性，表明caspase的活化對細(xì)胞死亡起了重要的作用。Anke等[7]在化學(xué)物質(zhì)喜樹堿、星形孢菌素、串珠鐮孢菌素誘導(dǎo)的番茄懸浮細(xì)胞凋亡中也發(fā)現(xiàn)了caspase一1和3的活性。酸蛋白酶大量特異表達(dá)。在衰老過程中。植物半胱氨酸蛋白酶在蛋白質(zhì)的水解和氮的重復(fù)方面可能起著重要的作用，植物半胱氨酸蛋白酶參與了植物的衰老、生物和非生物脅迫引起的細(xì)胞程序性死亡．植物半胱氨酸蛋白酶在功能上均類似于動物細(xì)胞中的Caspase家族蛋白酶。動物細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞色素C由線粒體向細(xì)胞質(zhì)中釋放，是Caspase-3活化的必要條件。研究發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞凋亡的早期，同樣也發(fā)生細(xì)胞色素C從線粒體中釋放。在凋亡誘導(dǎo)因子作用下，植物和動物細(xì)胞的線粒體均釋放出細(xì)胞色素C，表明這條源自原始單細(xì)胞死亡的途徑在進(jìn)化過程中是保守的。2.2活性氧植物被病原菌感染后，活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)在植物被侵染位點急劇增加，稱為氧爆發(fā)，這種氧爆發(fā)現(xiàn)象在對病原菌敏感或抗性的植物體內(nèi)都存在。但在抗性植物體內(nèi)，植物被感染后一定時間內(nèi)活性氧持續(xù)增加．并伴隨超敏反應(yīng)(HR)和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。另外，當(dāng)植物生長的環(huán)境條件如溫度、濕度、土壤中的水分、鹽濃度等發(fā)生急劇變化，或當(dāng)大氣污染、紫外線輻射等。均會使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，形成氧化損傷，在某一特定條件下產(chǎn)生細(xì)胞凋亡。這些比氧活潑的含氧化合物包括：超氧陰離子(O:一)、氫氧根離子(OH一)、自由基(·OH)、H2O：等。許多資料表明O2一是引細(xì)胞死亡的關(guān)鍵性活性氧．其在細(xì)胞死亡之前和死亡區(qū)域的周圍細(xì)胞中大量積累。O2一在細(xì)胞死亡之前先在某一位點積累．隨后向相鄰的活細(xì)胞擴(kuò)散，引起周邊HR細(xì)胞損傷[8]。用超氧化物歧化酶處理TMV感染的煙草葉片能抑制HR的發(fā)展．則進(jìn)一步證明了O2一的清除作用。外源病菌入侵后，導(dǎo)致植物體中氧化態(tài)物質(zhì)突發(fā)性釋放，大量產(chǎn)生O2一和H2O2等活性氧中間體，從而引發(fā)防御基因的表達(dá)及限制細(xì)胞的死亡。病原體還能激發(fā)遠(yuǎn)處未感染組織細(xì)胞發(fā)生次級氧化態(tài)突發(fā)，產(chǎn)生低頻系統(tǒng)微過敏發(fā)應(yīng)。初級和次級氧化態(tài)物質(zhì)突發(fā)性釋放激活植物的防御性反應(yīng)，對于植物的系統(tǒng)抗性是必需的。這與動物中巨噬細(xì)胞通過吞噬泡中高濃度的活性氧殺死入侵細(xì)菌的方式相似。目前，人們普遍認(rèn)為，活性氧與植物細(xì)胞的程序性死亡有關(guān)：在植物的PCD過程中活性氧可能起到三方面的作用：一是低濃度時作為信號分子傳遞環(huán)境脅迫信號；二是中等濃度時能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生PCD；三是高濃度時細(xì)胞發(fā)生壞死。[9]2.3乙烯乙烯在高等植物葉、花的衰老、果實成熟等過程中起著重要調(diào)控作用。最近的研究顯示，乙烯在植物PCD中也起重要作用，雖然也可能存在著不依賴于乙烯的PCD。例如，缺氧誘導(dǎo)的玉米根皮質(zhì)部氣生組織形成過程中，乙烯通過增高胞內(nèi)Ca2+濃度，引起細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致氣生組織的形成。Young等[10]也發(fā)現(xiàn)在小麥胚乳中，乙烯的濃度能夠部分地調(diào)節(jié)核內(nèi)DNA的降解。提高乙烯濃度能夠使DNA降解提早出現(xiàn)，而抑制乙烯的濃度可以降低或延緩DNA降解。因此乙烯誘導(dǎo)Ca2+重新分布可能是誘發(fā)植物PCD的機制之一。另外，由于GA也能刺激PCD．乙烯和GA的聯(lián)合效應(yīng)又可被CTK及ABA所逆轉(zhuǎn)，因此，乙烯很可能與其他信號分子協(xié)同作用來控制PCD發(fā)生。2.4與凋亡相關(guān)的基因2.4.1BEN1和ZEN1基因BEN1是大麥中分離的編碼一個35KD的核酸酶的基因，其產(chǎn)物含有288個氨基酸殘基，推測含有23個氨基酸的信號肽。BEN1蛋白可能與胚乳退化過程中發(fā)生的PCD有關(guān)。ZEN1是從百日草（zinnia）分離的編碼一個43KD核酸酶的基因。其產(chǎn)物由303個氨基酸組成，推測含有一個25氨基酸殘基的信號肽。ZNK1可能在導(dǎo)管的分化中發(fā)揮作用[11]。BEN1與ZEN1的氨基酸順序同米曲霉（Aspergillusoryzae）的S1核酸酶有很高的同源性。2.4.2Pto基因Pto基因是番茄中的抗病基因，編碼一類絲/蘇氨酸蛋白酶，屬于一個多基因家族，通過識別病原體Pseudomonassyringaepvtomato上相應(yīng)的avrPto，激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而起到抗病的作用。用酵母雙雜交系統(tǒng)，以Pto的ORF為引誘基因，發(fā)現(xiàn)了作用于其下游的另一個絲/蘇氨酸蛋白激酶Pti。Pti含370個氨基酸殘基，在體內(nèi)可被Pto磷酸化。將全長的PticDNA在35S啟動子的帶動下，通過TMV導(dǎo)入煙草中，其過度表達(dá)可加速煙草中由帶有avrPto基因的Pseudomonassyringae誘導(dǎo)的HR[12]2.4.3hsr203、Lehsr203基因hsr203是煙草基因，其活性出現(xiàn)于煙草與病原體相互作用之時。Hsr203啟動子與GUS的融合基因在煙草中可被細(xì)菌或病毒病原體誘導(dǎo)表達(dá)，表明它與煙草HR中的PCD有關(guān)[13]。Lehsr203是hsr203在番茄中的同源體。2.4.4lls1lls1(lethalleafspot1)是植物成熟葉片中能夠抑制細(xì)胞死亡擴(kuò)展的基因。玉米中的lls1編碼一個在植物中高度保守的58KD的蛋白[14]。推測的lls1蛋白含有兩個保守的結(jié)構(gòu)基序：一個硫鐵結(jié)合位點，一個不含血紅素的鐵結(jié)合位點。這兩種結(jié)構(gòu)基序也存在于芳環(huán)羥化過氧化物酶中，因此推測lls1編碼產(chǎn)物可能作為過氧化物酶，通過降解介導(dǎo)細(xì)胞死亡的酚類物質(zhì)而起作用。2.4.4mlo大麥中的抗病基因mlo(mutation-in-ducedrecessivealleles)，對真菌Erysiphegraminisf.sp.hordei的侵染具有抗性。等位基因能夠使真菌侵染的植物在侵染部位形成細(xì)胞壁基質(zhì)沉積。mlo1、mlo3、mlo5突變體即使在無真菌侵染的情況下，也能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞壁沉積。mlo基因含有12個外顯子，有一個1599bp的開放閱讀框架，推測的編碼產(chǎn)物為60KD，是至少含有6個跨膜螺旋的跨膜蛋白[15]。mlo蛋白在植物葉片死亡及病原體防御中起負(fù)調(diào)控作用。3檢測技術(shù)3.1多聚ADP核糖聚合酶降解情況檢測法多聚ADP核糖聚合酶（PRPP）在DNA修復(fù)中起著重要作用，它是caspase-3的底物，近年來有不少證據(jù)證明PRPP的降解是植物細(xì)胞凋亡的特征之一。PRPP被caspase-3水解后形成相對分子質(zhì)量分別為85000及25000的2個片段，用運載相對分子質(zhì)量為85000片段的抗體可以觀察細(xì)胞是否發(fā)生凋亡[16]。3.2酶聯(lián)免疫吸附法本方法基于凋亡細(xì)胞內(nèi)裂解的DNA片段含組蛋白（核小體），而DNA與組蛋白結(jié)合緊密而不被核酸內(nèi)切酶切割。在微量板上吸附抗組蛋白抗體，加入細(xì)胞裂解后離心所得的含有核小體的上清液，核小體上的組蛋白與被包被的抗組蛋白抗體結(jié)合；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體，與核小體上的DNA結(jié)合[17]；加酶的底物，測光吸收值。該法敏感性高，所需細(xì)胞少，可檢測到5×102/ml的凋亡細(xì)胞，但缺點是不能定位。3.3細(xì)胞色素C釋放的檢測法在動物細(xì)胞凋亡中，線粒體的細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，在ATP或dATP作用下可特異地與胞質(zhì)接頭蛋白APaf-1結(jié)合并促進(jìn)APaf-1寡聚化，APaf-1可選擇性地直接結(jié)合caspase-9，形成凋亡體復(fù)合體，并引起caspase-9的活化，從而激活下游分子誘導(dǎo)凋亡。在植物細(xì)胞凋亡的初期也檢測到細(xì)胞色素C的釋放，因此也可以用細(xì)胞色素C的釋放情況作為檢測細(xì)胞凋亡的手段。首先提取細(xì)胞質(zhì)和線粒體的蛋白質(zhì)，在SDS-聚丙烯酰胺凝電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與細(xì)胞色素C的初級抗體進(jìn)行雜交，洗去非特異性結(jié)合的抗體后再與二級、三級抗體雜交，最后通過堿性磷酸酶顯色反應(yīng)顯示該蛋白的存在[18]。向擬南芥根和懸浮培養(yǎng)的玉米細(xì)胞培養(yǎng)基中添加D-甘露糖，細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時發(fā)生細(xì)胞色素C從線粒體中的釋放。3.4caspase活性檢測法caspase(胱冬酶）是一類半胱氨酸蛋白酶，同時具有半胱氨酸和天冬氨酸裂解位點，它已被證明在動物的細(xì)胞凋亡中起著極其重要的作用，在植物中有可能也存在此類物質(zhì)。因此，可以把檢測caspase的活性作為檢測細(xì)胞凋亡的輔助手段。Thornberry等建立了caspase活性的測定方法，底物Ac-YVAD-AMC在該酶作用下被分解釋放出7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)，產(chǎn)生黃綠色熒光，可通過熒光分光光度計于460nm處進(jìn)行檢測。4展望細(xì)胞凋亡是植物生長發(fā)育的一個基本組成部分。如，根、莖、葉、花、果等的死亡注定會在生活史的特定階段發(fā)生。植物某器官的凋亡對植物體有著重要的生物學(xué)意義。從個體發(fā)育的角度來說，葉片衰老是適應(yīng)營養(yǎng)重新分配的生物現(xiàn)象，但是這個過程卻對農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)。Gan等建立的植物衰老抑制體系為提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量提供了重要思路。另外，了解植物生長發(fā)育過程中正常的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，并且將其在谷物、蔬菜的貯存和果實、鮮花的保鮮中加以利用，對提高農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)和質(zhì)量有深遠(yuǎn)意義。部分細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白具有保守性說明它們在高等植物進(jìn)化與起源上有重要意義。研究表明，有些動植物細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白具有多個保守的結(jié)構(gòu)域，如TNFR(腫瘤壞死因子受體)、Ap—ATPases(凋亡ATP酶)、CDK(依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶)、CKI(CDK抑制子)和Caspase(一種半胱氨酸蛋白酶，植物中也存在類似Caspases的蛋白酶)，這些保守的結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化引起細(xì)胞凋亡的起源和進(jìn)化[19]。細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化向兩個方向進(jìn)行①垂直遺傳(verticalinheritance)，如哺乳動物TRAF(TNFR相關(guān)因子)的結(jié)構(gòu)域在網(wǎng)柄菌屬(Dietyostelium)中存在同樣的結(jié)構(gòu)域，以保證同種反應(yīng)(homophilicinteraction)的準(zhǔn)確性；②水平遺傳(horizontalinheritance)，如Ap—ATPase家族的結(jié)構(gòu)域在動植物、放線菌中均各自獨立進(jìn)化，出現(xiàn)反應(yīng)的多樣化，但其主要功能保持不變[20]。因此，研究這些保守結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化對于徹底弄清動植物細(xì)胞凋亡進(jìn)化具有重要意義。參考文獻(xiàn)：[1]潘建偉，董愛華，朱睦元.高等植物的PCD研究進(jìn)展(一)[J].遺傳，2000,22:189[2]李杰，朱碧巖，張銘光.植物發(fā)育過程中的細(xì)胞程序性死亡[J].植物學(xué)通報，2005,22(增刊)：22[3]孫英麗，趙允，劉春香等.細(xì)胞色素C能誘導(dǎo)植物細(xì)胞編程性死亡[J].植物學(xué)報，1999,41:87[4]BowenD，MorganSM，MullarbyK．CellBiolInter，1993，17(1)：13—33j[5]HideeKttriyama，HiroeFukuda．CurrentOpinioninPlantBiology。2002，5：568—573．[6]JonesAM．PlantPhysiol，2001，125：94—97．[7]Pons，W．eta12000，B．B．R．C．273：1015一1018．[8]Emerv，D．W．eta1．，2000．PNAS．USA．27：9150一9155．[9]翟中和，王喜忠，丁明孝．細(xì)胞生物學(xué)[M]．北京：高等教育出版社，2000[10]LeuK，HsuB．AprogrammedcelldisintegrationofChlorellaafterheatstmss[J]．PlantScience．2005，(168)：145—152[11]xuY，HansonMR．Programmedcelldeathduringpollination—inducedpetalseneacenceinPetunia[J]．PlantPhysiol，2000，122：1323—1333[12]支立峰，余濤，朱英國，等，鎘脅迫引起煙草懸浮細(xì)胞程序性死亡[J]．武漢植物學(xué)研究，2006，(5)：19-23[13]PedretmMC，MagalhaesJR，DurzanD．Anitricoxideburstprecedesapoptosisinangiospermandgynmospennealluscellsandfoliartissues[J]．J，Exp．Bot，2000，51：11027～1036[14]PedrosoMC，MagalhaesJR，DuramD．NitricoxideinducescelldeathinTaxuscells[J]．PlantSCi，2000，157：173—180[15]LevineA，PennellRI，Al