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MTT實(shí)驗(yàn)操作流程MTT實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作流程1.原理瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測(cè)得的吸光度值(即OD值),來(lái)判斷活細(xì)胞數(shù)量,OD值越大,細(xì)胞活性越強(qiáng)(如果是測(cè)藥物毒性,則表示藥物毒性越小)。2.試劑及耗材3.注意事項(xiàng),小劑量分裝,用避光袋或錫箔紙包住避光以免分解,當(dāng)MTTDMSO準(zhǔn)曲線(xiàn)制作la)每孔加入10μLMTT溶液(5mg/ml),繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6h;b)小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液;c)每孔加入150μLDMSO,使結(jié)晶物充分溶解;d)加DMSO后10min內(nèi),用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔波長(zhǎng)μl570nm的吸光值;細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整其濃度至5-10×104/ml,藥物毒性實(shí)驗(yàn)一般每孔細(xì)胞數(shù)量5000—10000個(gè)(具體數(shù)目根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)判斷)。此外,還應(yīng)根據(jù)細(xì)胞本身特性,如生長(zhǎng)快慢,來(lái)決定細(xì)胞數(shù)量。比如:生長(zhǎng)較快l度為5000—10000/孔(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)。5%CO2,37C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞單層鋪滿(mǎn)孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物。(原則上,細(xì)胞貼壁后即可加藥,或兩h,或半天時(shí)間,但我們常在前一天下l釋好的藥物體積應(yīng)略按照藥物作用時(shí)間點(diǎn),每24h取出一塊96孔板檢測(cè):a)每孔加入10μLMTT溶液(5mg/ml),繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6h;b)小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液;c)每孔加入150μLDMSO,置上低速振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解;d)加DMSO后10min內(nèi),用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔波長(zhǎng)570nm的吸光值;同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜),對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解分別收集各組對(duì)數(shù)期的細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度;取4塊96孔板,每孔加入100μL細(xì)胞懸液,鋪板使待測(cè)細(xì)胞為5×103cell/孔(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充以消除邊緣效應(yīng)),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔;5%CO2,37C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),每24h取出一塊96孔板檢測(cè):a)每孔加入20μLMTT溶液(5mg/ml),繼續(xù)細(xì)
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