MTT實(shí)驗(yàn)操作流程

MTT實(shí)驗(yàn)操作流程MTT實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作流程1.原理瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測(cè)得的吸光度值(即OD值)，來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)(如果是測(cè)藥物毒性，則表示藥物毒性越小)。2.試劑及耗材3.注意事項(xiàng)，小劑量分裝，用避光袋或錫箔紙包住避光以免分解，當(dāng)MTTDMSO準(zhǔn)曲線制作la)每孔加入10μLMTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6h；b)小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；c)每孔加入150μLDMSO，使結(jié)晶物充分溶解；d)加DMSO后10min內(nèi)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔波長(zhǎng)μl570nm的吸光值；細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整其濃度至5-10×104/ml，藥物毒性實(shí)驗(yàn)一般每孔細(xì)胞數(shù)量5000—10000個(gè)(具體數(shù)目根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)判斷)。此外，還應(yīng)根據(jù)細(xì)胞本身特性，如生長(zhǎng)快慢，來決定細(xì)胞數(shù)量。比如：生長(zhǎng)較快l度為5000—10000/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)。5%CO2，37C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物。(原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩h，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下l釋好的藥物體積應(yīng)略按照藥物作用時(shí)間點(diǎn)，每24h取出一塊96孔板檢測(cè)：a)每孔加入10μLMTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6h；b)小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；c)每孔加入150μLDMSO，置上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解；d)加DMSO后10min內(nèi)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔波長(zhǎng)570nm的吸光值；同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解分別收集各組對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度；取4塊96孔板，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，鋪板使待測(cè)細(xì)胞為5×103cell/孔(邊緣孔用無菌PBS填充以消除邊緣效應(yīng))，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；5%CO2，37C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每24h取出一塊96孔板檢測(cè)：a)每孔加入20μLMTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)細(xì)