現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)原理

現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)原理第1頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日Contents1.現(xiàn)代生物技術(shù)概述

2.酶工程基本原理

3.基因工程基本原理

4.微生物細胞工程第2頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日5.1現(xiàn)代生物技術(shù)概述5.1.1現(xiàn)代生物技術(shù)定義1986年國家科委制訂《中國生物技術(shù)政策綱要》時，將生物技術(shù)定義為：以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達到某種目的。第3頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)代生物技術(shù)定義

先進的工程技術(shù)手段是指基因工程、酶工程、細胞工程和發(fā)酵工程等新技術(shù)。改造生物體是指獲得優(yōu)良品質(zhì)的動物、植物或微生物品系。生物原料則是指生物體的某一部分或生物生長過程中所能利用的物質(zhì)，如淀粉、糖蜜、纖維素等有機物，也包括一些無機化合物，甚至某些礦石。第4頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)代生物技術(shù)定義為人類生產(chǎn)出所需的產(chǎn)品包括糧食、醫(yī)藥、食品、化工原料、能源、金屬等各種產(chǎn)品。目的則包括疾病的預(yù)防、診斷與治療，環(huán)境污染的檢測與治理等。第5頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日5.1現(xiàn)代生物技術(shù)概述5.1.2現(xiàn)代生物技術(shù)及應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)主要包括：基因工程、酶工程、細胞工程和發(fā)酵工程。這些技術(shù)并不是各自獨立的，而是相互聯(lián)系、相互滲透的（圖5-1）。其中基因工程技術(shù)是核心技術(shù)，它能帶動其他技術(shù)的發(fā)展，如通過基因工程對細菌或細胞改造后獲得的工程菌或細胞，必須通過發(fā)酵工程或細胞工程來生產(chǎn)有用物質(zhì)。第6頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)代生物技術(shù)及應(yīng)用圖5-1基因工程、酶工程、細胞工程與發(fā)酵工程之間的關(guān)系第7頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)代生物技術(shù)及應(yīng)用生物技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化工、食品、環(huán)境保護等眾多領(lǐng)域。生物技術(shù)的應(yīng)用過程示意圖如圖5-2所示。第8頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)代生物技術(shù)及應(yīng)用圖5-2生物技術(shù)的應(yīng)用過程示意圖第9頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日5.1現(xiàn)代生物技術(shù)概述5.1.3現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)（1）環(huán)境生物技術(shù)的產(chǎn)生由于人口的快速增長，自然資源的大量消耗，全球環(huán)境狀況目前正在急劇惡化：水資源短缺、土壤荒漠化、有毒化學(xué)品污染、臭氧層破壞、酸雨肆虐、物種滅絕、森林減少等。人類的生存和發(fā)展面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)，迫使人類進行一場“環(huán)境革命”來拯救人類自身。在這場環(huán)境革命中，環(huán)境生物技術(shù)擔(dān)負著重大使命，并且作為一種行之有效、安全可靠的手段和方法，起著核心的作用。第10頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境污染防治的一門新興邊緣學(xué)科。它誕生與20世紀80年代末期，以高新技術(shù)為主體，并包括對傳統(tǒng)生物技術(shù)的強化與創(chuàng)新。環(huán)境生物技術(shù)涉及眾多的學(xué)科領(lǐng)域，主要由生物技術(shù)、工程學(xué)、環(huán)境學(xué)和生態(tài)學(xué)等組成。它是由生物技術(shù)與環(huán)境污染防治工程及其他工程技術(shù)緊密結(jié)合形成的，既具有較強的基礎(chǔ)理論，又具有鮮明的技術(shù)應(yīng)用特點。第11頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)廣義上講，凡是自然界中涉及環(huán)境污染控制的一切與生物技術(shù)有關(guān)的技術(shù)，都可稱為環(huán)境生物技術(shù)。德國國家生物技術(shù)研究中心的K.Timmis博士將環(huán)境生物技術(shù)定義為應(yīng)用生物圈的某些部分使環(huán)境得以控制，或治理預(yù)定要進入生物圈的污染物的生物技術(shù)。

第12頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日包括以下三方面1在環(huán)境中應(yīng)用的生物技術(shù)，這是相對于一些在高度控制條件下的密閉反應(yīng)器中進行的生物技術(shù)而言；2涉及到環(huán)境中某些可以看作為一個生物反應(yīng)器部分的生物技術(shù).3作用于一些必定要進入環(huán)境的材料的生物技術(shù).第13頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)美國密歇根州立大學(xué)的J.M.Tiedje教授認為，環(huán)境生物技術(shù)的核心是微生物學(xué)過程。近年來，環(huán)境生物技術(shù)發(fā)展極其迅猛，已成為一種經(jīng)濟效益和環(huán)境效益俱佳的、解決復(fù)雜環(huán)境問題的最有效手段。國際上認為21世紀生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的十大熱點中，環(huán)境污染監(jiān)測、有毒污染物的生物降解和生物降解塑料三項屬于環(huán)境生物技術(shù)的內(nèi)容。

第14頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)嚴格地說，環(huán)境生物技術(shù)指的是直接或間接利用生物或生物體的某些組成部分或某些機能，建立降低或消除污染物產(chǎn)生的生產(chǎn)工藝，或者能夠高效凈化環(huán)境污染，同時又生產(chǎn)有用物質(zhì)的工程技術(shù)。環(huán)境生物技術(shù)作為生物技術(shù)的一個分支學(xué)科，它除了包括生物技術(shù)所有的基礎(chǔ)和特色之外，還必須與污染防治工程及其他工程技術(shù)相結(jié)合。第15頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)環(huán)境生物技術(shù)可分為高、中、低三個層次。高層次是指以基因工程為主導(dǎo)的現(xiàn)代污染防治生物技術(shù)，如基因工程菌的構(gòu)建、抗污染型轉(zhuǎn)基因植物的培育等；中層次是指傳統(tǒng)的生物處理技術(shù)，如活性污泥法、生物膜法，及其在新的理論和技術(shù)背景下產(chǎn)生的強化處理技術(shù)和工藝，如生物流化床、生物強化工藝等；第16頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)低層次是指利用天然處理系統(tǒng)進行廢物處理的技術(shù)，如氧化塘、人工濕地系統(tǒng)等。第17頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)環(huán)境生物技術(shù)的三個層次均是污染治理不可缺少的生物技術(shù)手段。高層次的環(huán)境生物技術(shù)需要以現(xiàn)代生物技術(shù)知識為背景，為尋求快速有效的污染治理與預(yù)防新途徑提供了可能，是解決目前出現(xiàn)的日益嚴重且復(fù)雜的環(huán)境問題的強有力手段。中層次的環(huán)境生物技術(shù)是當(dāng)今廢物生物處理中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，中層次的技術(shù)本身也在不斷改進，高技術(shù)也不斷滲入，因此，它仍然是目前環(huán)境污染治理中的主力軍。低層次的環(huán)境生物技術(shù)，其最大特點是充分發(fā)揮自然界生物凈化環(huán)境的功能，投資運行費用低，易于管理，是一種省力、省費用、省能耗的技術(shù)。第18頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)各種工藝與技術(shù)之間可能存在相互滲透或交叉應(yīng)用的現(xiàn)象，有時難以確定明顯的界限。某項環(huán)境生物技術(shù)可能集高、中、底三個層次的技術(shù)于一身。

為了解決日益嚴重的環(huán)境污染問題，需配合使用高、中、低三個層次的技術(shù)，針對不同的問題，采用不同的技術(shù)或不同技術(shù)的組合。第19頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)（2）環(huán)境生物技術(shù)的研究范圍現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)服務(wù)于環(huán)境保護，目前環(huán)境生物技術(shù)面臨的任務(wù)有：

①解決基因工程菌從實驗室進入模擬系統(tǒng)和現(xiàn)場應(yīng)用過程中，其遺傳穩(wěn)定性、功能高效性和生態(tài)安全性等方面的問題；第20頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)②開發(fā)廢物資源化和能源化技術(shù)，利用廢物生產(chǎn)單細胞蛋白、生物塑料、生物肥料以及利用廢物生產(chǎn)生物能源，如甲烷、氫氣、乙醇等；③建立無害化生物技術(shù)清潔生產(chǎn)新工藝，如生物制漿、生物絮凝劑、煤的生物脫硫、生物冶金等；④發(fā)展對環(huán)境污染物的生理毒性及其對生態(tài)影響的檢測技術(shù)。第21頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，給環(huán)境生物技術(shù)的縱深發(fā)展增添了強大的動力，生物技術(shù)無論是在生態(tài)環(huán)境保護方面，還是在污染預(yù)防和治理方面以及環(huán)境監(jiān)測方面，都顯示出獨特的功能和優(yōu)越性。環(huán)境生物技術(shù)也面臨許多難題，而這些難題的解決，依賴于現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展去開辟道路。人們有理由、有信心相信，最終環(huán)境問題解決的希望寄托在現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)的進展和突破上。第22頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日5.2酶工程基本原理酶工程是研究酶的生產(chǎn)和應(yīng)用的一門新的技術(shù)性學(xué)科，是利用酶的催化作用進行物質(zhì)轉(zhuǎn)化（合成有用物、分解有害物）的技術(shù)，是將酶學(xué)理論與化工技術(shù)結(jié)合而形成的新技術(shù)。酶工程的內(nèi)容包括：酶的生產(chǎn)與分離純化、酶分子修飾、酶固定化、酶反應(yīng)動力學(xué)與反應(yīng)器和酶的應(yīng)用等方面。第23頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日5.2酶工程基本原理酶工程的主要任務(wù)是：通過預(yù)先設(shè)計，經(jīng)過人工操作控制而獲得大量所需的酶，并通過各種方法使酶發(fā)揮其最大的催化功能，即利用酶的特定功能，借助工程學(xué)手段為我們提供產(chǎn)品或分解有害物質(zhì)。第24頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日5.2酶工程基本原理酶工程的目的是：為我們提供產(chǎn)品或以特定的功能來為我們服務(wù)。本節(jié)主要介紹酶固定化、固定化酶反應(yīng)動力學(xué)及酶在污染治理中的應(yīng)用等方面。第25頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念5.2.1酶固定化概念酶的固定化技術(shù)就是通過物理或化學(xué)方法將酶束縛在一定區(qū)間內(nèi)制成仍具有催化活性的酶的衍生物即固定化酶(immobilizedenzyme)。第26頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念酶是生物體為維持自身的生命活動而產(chǎn)生的，它適于在生物體內(nèi)進行化學(xué)反應(yīng)。但是，作為人類用于生產(chǎn)所需要的催化劑還不夠理想。例如，酶在一般情況下，對熱、強酸、強堿和有機溶劑等均不夠穩(wěn)定，即使給予合適的條件也會隨著反應(yīng)時間的延續(xù)，反應(yīng)速度逐漸下降最后導(dǎo)致失括。同時，酶也不能反復(fù)利用且酶只能在水溶液中使用，不能在有機溶劑中使用。而固定化酶能克服上述的缺點，它像有機化學(xué)反應(yīng)中所使用的固體催化劑一樣，同時仍具有生物體內(nèi)酶一樣強的催化活性。

第27頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念固定化酶具有下列優(yōu)點：可以使反應(yīng)過程管道化、自動化，產(chǎn)物易從反應(yīng)液中回收；酶的穩(wěn)定性有所改進；酶的使用效率提高。

第28頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念酶的固定化使酶的應(yīng)用達到新的水平，可把酶直接應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)的反應(yīng)系統(tǒng)。固定化酶的研究不僅具有實用價值，在探索酶的作用機制方面也提供了新的研究途徑。第29頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念固定化酶的研究開始于20世紀50年代。1953年格侖布霍費(Grubhofer)和施萊思(schleith)將聚氨苯乙烯樹脂重氮化，并將羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶或核糖核酸酶等結(jié)合固定到該樹脂上，第一次實現(xiàn)了酶的固定化。經(jīng)過十多年的努力，到了60年代后期，固定化酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和發(fā)酵等工業(yè)的生產(chǎn)。1978年，我國首次使用固定化5’—磷酸二酯酶生產(chǎn)5’—核苷酸。到70年代初，出現(xiàn)了固定化細胞，細胞的固定化包括微生物細胞、動物細胞、植物細胞或各種細胞器的固定化。第30頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念固定化酶和固定化細胞研究的第一階段主要是載休的開發(fā)，固定化方法的研究及其應(yīng)用技術(shù)的開發(fā)。目前，第一階段已基本完成，進入了第二階段的研究。第二階段的主要研究內(nèi)容可歸納如下：①在需要輔酶(NAD+或FAD)或ATP、ADP、AMP的酶反應(yīng)體系的固定化中，輔酶系或ATP、ADP、AMP系和其再生系的建立；②疏水體系或含水很低的體系里固定化酶的催化反應(yīng)的研究；③為了防止固定化過程中酶活力下降，添加輔助物的研究：④固定化活細胞的研究?？傊负图毎潭ɑ夹g(shù)發(fā)展迅猛，它的應(yīng)用將會引起應(yīng)用酶學(xué)及生物工程學(xué)的巨大變革。第31頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念⑴固定化酶的制備酶的催化活性依賴于酶的空間結(jié)構(gòu)及活性中心。所以在固定化時，要選擇適當(dāng)?shù)臈l件，力圖不使其活性中心的基團受到影響。操作時應(yīng)盡量在溫和條件下進行，避免高溫、強酸、強堿處理，以盡量保持酶蛋白天然的高級結(jié)構(gòu)。第32頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念酶固定化的方法很多，但沒有一種對任何酶都適用的通用方法。目前采用的固定化方法大致可分為3類，載體結(jié)合法(包括共價結(jié)合法、離子結(jié)合法、物理吸附法)、交聯(lián)法和包埋法（包括聚合物包埋法、微膠囊包埋法)。圖5-3為幾種常用的酶固定化方法示意圖。第33頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念圖5-3酶固定化方法示意圖(1)離子結(jié)合，(2)共價結(jié)合；(3)交聯(lián)；(4)聚合物包埋；(5)疏水作用i(6)脂質(zhì)體包埋；(7)微膠囊第34頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念上述幾種方法也可并用，稱為混合法。例如：交聯(lián)和包埋并用，離子結(jié)合和包埋并用，共價結(jié)合和包埋并用等?，F(xiàn)將各種方法的原理及優(yōu)缺點簡要介紹如下：第35頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念①裁體結(jié)合法載體結(jié)合法是用共價鍵、離子鍵和物理吸附法把酶固定在纖維素、瓊脂糖、左旋糖酐、甲殼質(zhì)、多孔性玻璃和離子交換樹脂等載體的固定化。第36頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念a共價結(jié)合法：利用酶蛋白分子中的氦基酸殘基與載體上的基團通過化學(xué)反應(yīng)形成共價鍵而使酶固定化的方法。共價結(jié)合的具體方法很多，可分為重氮法、肽法、烷化法和載體交聯(lián)法等。其中，重氮法最為常用。共價結(jié)合法要求控制條件較苛刻，反應(yīng)激烈，操作復(fù)雜，常常引起酶蛋白的高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并導(dǎo)致活性中心破壞，難以制得高活力的標(biāo)準品，有時會使酶原來具有的底物特異性發(fā)生變化。但此方法制得的固定化酶的酶分子和裁體間結(jié)合極牢固，即使用高濃度底物溶液或鹽溶液處理也不會使酶分子從載體上脫落。第37頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念b離子結(jié)合法：通過離子效應(yīng)，將酶固定到具有離子交換基團的非水溶性載體上。常用的載體有DEAF—纖維素、TEAE—纖維素、ECTROLA—纖維素及DEAE-交聯(lián)葡聚糖等陰離子交換性載體。與共價結(jié)合法相比較，離子結(jié)合法的操作簡便，處理條件較溫和，酶分子的高級結(jié)構(gòu)和活性中心很少改變，可得到活性較高的固定化酶。但載體和酶分子之間的結(jié)合力不夠牢固，易受緩沖液種類和pH的影響，在離子強度較大的狀態(tài)下進行反應(yīng)，有時酶分子會從載體上脫落下。第38頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念c物理吸附法：是將酶分子吸附到不溶于水的惰性載體上。常用的載體有活性炭、多孔玻璃、酸性白土、漂白土、高嶺土、礬土、硅膠、磷酸鈣凝膠、羥基磷灰石、淀粉等。其中以活性炭應(yīng)用最廣，例如把吸附有霉菌糖化酶的活性炭裝入柱內(nèi)，以適當(dāng)流速道人淀粉溶液，流出液中可以獲得葡萄糖。物理吸附法不會明顯改變酶分子的高級結(jié)構(gòu)，因此不易使酶分子活性中心受到破壞。其缺點是酶分子與載體的相互作用較弱，被吸附的酶分子極易從載體上脫落。

第39頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念②交聯(lián)法交聯(lián)法是利用雙功能試劑的作用，在酶分子之間發(fā)生交聯(lián)，凝集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而制成的固定化酶。雙功能試劑主要有戊二醛、順丁烯二酸酐和乙烯共聚物。酶蛋白中游離氨基、酚基、咪唑基及巰基均可參與交聯(lián)反應(yīng)。其中以戊二醛法最為常用。戊二醛和酶蛋白的游離氨基形成席夫(Schiff)堿而使酶分子交聯(lián)。交聯(lián)法與共價結(jié)合法一樣，反應(yīng)條件比較劇烈，固定化酶的活力較低。又由于交聯(lián)法制備的固定化酶顆粒較細，此法不宜單獨使用，如與吸附法或包埋法聯(lián)合使用好效果。又由于交聯(lián)法制備，則可達到加固的良好效果。第40頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念③包埋法包埋法是將酶包埋在聚合物凝膠的微細網(wǎng)格中或被半透性的聚合物膜所包圍，使酶分子不能從凝膠的網(wǎng)格中或膜中漏出，而小分子的底物和產(chǎn)物則可以自由通過凝膠網(wǎng)格和半透膜。第41頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念a聚合物包埋法：將酶包埋在聚合物的凝膠格中的方法。最常用的凝膠有聚丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠、明膠、海藻膠等，其中以聚丙烯酰胺凝膠為最好。制備時，在酶溶液中加入丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙酰胺，在通入氮氣的條件下，加聚合反應(yīng)催化劑四甲基二胺和聚合引發(fā)劑過硫酸鉀等進行聚合，酶分子便被包埋在聚合的凝膠內(nèi)。第42頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念b微膠囊法：微膠囊法是以半透性的高聚物薄膜包圍含有酶分子的液滴。制備方法有3類：界面聚合法、液中干燥法和相分離法。第43頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念界面聚合法是應(yīng)用親水性單體和疏水性單體在界面上發(fā)生聚合而將酶包圍起來。液中干燥法是把酶液在含有高聚物的有機溶劑中進行乳化分散，然后再把該乳化液轉(zhuǎn)移到水溶液中，使之干燥，形成高聚物半透膜而將酶分子包裹起來。相分離法是將聚合物溶解在不與水混溶的有機溶液中，然后將酶乳化分散在此溶液中，再在攪拌下徐徐加入引起相分離的非極性溶劑，聚合物的濃厚溶液將酶液包圍，聚合物相繼析出，形成半透膜，酶就被包裹在內(nèi)。第44頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念包埋法操作簡便，酶分子僅僅是包埋起來而未起化學(xué)反應(yīng)．可用來制備各種固定化酶，一般酶活力較高。但有時在化學(xué)聚合反應(yīng)時，需要在比較苛刻的條件下進行，容易導(dǎo)致酶的失話，所以要設(shè)計好包埋條件。另外，此法對作用于大分子底物的酶類不適用。第45頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念⑵固定化酶的性質(zhì)游離酶在水溶液中，酶分子與底物分子同處于液相，幾乎是十分鄰近的。酶固定化后，酶分子牢固地結(jié)合于載體，處于與游離酶不同的微環(huán)境中，因此，固定化的結(jié)果往往引起酶性質(zhì)的改變。原因主要來自兩方面：一方面是酶本身的變化，主要由于活性中心的氨基酸殘基、空間結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)發(fā)生了變化；另一方面是載體的物理和化學(xué)性質(zhì)的影響，主要由于在固定化酶的周圍，形成了能對底物產(chǎn)生立體障礙的擴散層以及靜電的相互作用等引起的。第46頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念固定化酶性質(zhì)的變化主要表現(xiàn)在以下幾方面：①底物特異性的改變②最適pH的改變③最適溫度的變化④動力學(xué)常數(shù)的變化⑤穩(wěn)定性變化第47頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念底物特異性的改變

同定化酶的活力一般比天然酶低，其底物特異性也可能發(fā)生變化。例如，用羧甲基纖維素作載體，肽法固定化的胰蛋白酶，對高分子底物酪蛋白只顯示原酶活力的3％，而對低分子底物苯酰精氨酸—對-硝基酰替苯胺的活力保持100％。所以，一般認為酶被固定到載體后可引起立體障礙，使高分子底物與酶分子表面的鄰近效應(yīng)受到干擾，從而顯著降低了酶的活性。而低分子底物則受到立體障礙的影響較小，底物分子容易接近酶分子，因而與原酶活力無顯著差別。對以低分子物質(zhì)為底物的酶，經(jīng)固定化后，多數(shù)情況下底物特異性不發(fā)生變化。第48頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念最適pH的改變由帶負電載體制備的固定化酶的最適pH比游離酶的最適pH高，而用帶正電載體制備的則情況相反，而用不帶電的載體，最適pH不變(但也有最適pH改變的例子)。這可能解釋為：當(dāng)酶分子被結(jié)合到帶負電(或帶正電)載體上時，酶蛋白的陽離子(或陰離子)數(shù)增多，從而造成固定化酶反應(yīng)區(qū)域的pH值比外部溶液的pH值偏酸(或偏堿)，這樣，造成酶的反應(yīng)是在比反應(yīng)液的pH偏酸(或偏堿)一側(cè)進行的，從而使最適pH值轉(zhuǎn)移到堿性(或酸性)一側(cè)。最適pH改變而pH活性曲線的形狀不變的現(xiàn)象，稱為最適pH的平行移動。第49頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念最適溫度的變化酶固定化后，最適溫度有時會發(fā)生變化。例如，以共價結(jié)合法固定化色氨酸酶的最適溫度比固定化前高5-15℃，而以烷化法固定化氨基?；傅淖钸m溫度則比固定化前有所降低，多數(shù)情況下，最適溫度并不發(fā)生變化。第50頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念動力學(xué)常數(shù)的變化酶固定化于電中性載體后，固定化酶的表觀米氏常數(shù)往往比游離酶的米氏常數(shù)高，而最大反應(yīng)速度變小。具有與載體電荷相反的底物由于靜電相吸，固定化酶與游離酶相比，表觀米氏常數(shù)往往減小。若載體與底物有一方不帶電，則往住表觀米氏常數(shù)不變或稍有增加。表觀米氏常數(shù)的減少，對固定化酶的實際應(yīng)用是有利的，可使反應(yīng)更為完全。第51頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日酶固定化概念穩(wěn)定性變化酶固定化后，穩(wěn)定性普遍增加，主要表現(xiàn)在對熱的穩(wěn)定性及貯藏的穩(wěn)定性增加，且在蛋白質(zhì)變性劑，如尿素、鹽酸胍及有機溶劑中仍保持相當(dāng)活性，對蛋白水解酶的抵抗性也增加等。這些特性都有利于酶的應(yīng)用。第52頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日固定化酶反應(yīng)動力學(xué)5.2.2固定化酶反應(yīng)動力學(xué)酶經(jīng)固定化后，其反應(yīng)動力學(xué)發(fā)生顯著的變化。固定化酶反應(yīng)動力學(xué)較酶反應(yīng)動力學(xué)復(fù)雜得多，影響因素也是多方面的，有些目前還處于研究探討階段。本節(jié)根據(jù)有關(guān)文獻著作的報道，進行簡要介紹。第53頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日固定化酶反應(yīng)動力學(xué)⑴固定化對酶反應(yīng)系統(tǒng)的影響通常，大多數(shù)酶在固定化后，反應(yīng)速度有所下降（個別除外）。其原因如下：①酶構(gòu)象改變：由于酶分子在固定化過程中發(fā)生了某種扭曲，影響了酶分子的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶與底物結(jié)合能力或酶催化底物轉(zhuǎn)化能力的改變。第54頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日固定化酶反應(yīng)動力學(xué)②立體障礙：酶經(jīng)固定化后，由于載體的存在，給酶的活性部位或調(diào)節(jié)部位造成了某種空間障礙，干擾與影響了酶與底物或其他效應(yīng)物的接觸。特別是當(dāng)?shù)孜锓肿恿枯^大時，影響就更大。③微擾效應(yīng)：由于載體的疏水、親水及荷電性質(zhì)，使得緊鄰固定化酶的環(huán)境區(qū)域（稱微環(huán)境）發(fā)生變化，與宏觀反應(yīng)體系不同，對酶產(chǎn)生微擾效應(yīng)，改變了酶的催化能力及酶對效應(yīng)物作出調(diào)節(jié)反應(yīng)的能力。第55頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日固定化酶反應(yīng)動力學(xué)④分配效應(yīng)：由于底物與其他各種效應(yīng)物（包括H十與OH一）和載體間產(chǎn)生了靜電、親水或疏水之類的相互作用，造成了它們在載體內(nèi)外側(cè)濃度的不等分配，從而影響酶反應(yīng)速度。⑤擴散限制：酶固定化后，底物、產(chǎn)物和其他效應(yīng)物在載體內(nèi)外之間的遷移擴散速度受到了某種限制，造成了不等分布。擴散限制與這些物質(zhì)的分子量大小、載體的結(jié)構(gòu)及酶反應(yīng)性質(zhì)有關(guān)。第56頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日固定化酶反應(yīng)動力學(xué)擴散限制分為外擴散限制和內(nèi)擴散限制。外擴散限制是指底物、產(chǎn)物和其他效應(yīng)物在宏觀體系與酶顆粒表面間的擴散受到了限制，此限制主要存在于酶顆粒周圍的處于層流狀態(tài)的液膜（Nernst）層。內(nèi)擴散限制是指在多孔性固定化載體內(nèi)，底物、產(chǎn)物和其他效應(yīng)物在載體顆粒表面與載體內(nèi)的酶活性部位間的擴散受到的限制。

第57頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日固定化酶反應(yīng)動力學(xué)就外擴散限制來說，由于催化反應(yīng)是在底物到酶活性部位以后才進行的，因此底物濃度在液膜層中的不等分布是線性梯度（產(chǎn)物濃度的不等分布也如此，但方向相反）。而就內(nèi)擴散限制來說，由于催化反應(yīng)與擴散過程幾乎是同時進行的，所以底物在多孔載體內(nèi)形成一種非線性梯度分布。

第58頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日固定化酶反應(yīng)動力學(xué)以上各種原因是相互交叉、相互關(guān)聯(lián)地存在著的，它們綜合在一起決定著固定化酶的動力學(xué)性態(tài)。其中構(gòu)象改變、立體障礙及微擾效應(yīng)是直接影響酶的因素，這些因素對動力學(xué)的影響很難加以定量分析和概括，只能通過實驗加以測定。它們的消除或改善只有依賴于選擇合適的固定化條件、方法和載體。分配效應(yīng)和擴散限制則是通過底物、產(chǎn)物和效應(yīng)物在載體內(nèi)外的不等分布來影響固定化酶的催化反應(yīng)速度。第59頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日固定化酶反應(yīng)動力學(xué)⑵固定化酶反應(yīng)動力學(xué)假定酶被均勻地固定分布于載體內(nèi)部，在穩(wěn)定狀態(tài)下進行不可逆的S→P的反應(yīng)。反應(yīng)時，外部的流動狀況不影響載體內(nèi)部，底物一邊擴散，通過載體內(nèi)的細孔，一邊進行反應(yīng)，底物在轉(zhuǎn)移過程中將逐漸消耗。因此底物濃度的分布以及單位體積載體中酶反應(yīng)速度也將隨載體表面到載體內(nèi)部的距離的增大而降低，且降低是非線性的。我們可用微分底物衡算導(dǎo)出其反應(yīng)速度方程。第60頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日5.3基因工程概述

第61頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日5.3.1基因工程概述⑴基因工程的誕生 基因工程的誕生在理論上得益于三大發(fā)現(xiàn)：①Avevy(1934)等人的研究成果證明了遺傳物質(zhì)是DNA而不是蛋白質(zhì)，從而解決了遺傳信息的來源問題；②Watson-Crick(1953)的雙螺旋結(jié)構(gòu)學(xué)說闡明了信息載體DNA的復(fù)制并解決了信息傳遞的方式問題;③Monod和Jacob（1961）提出操縱子學(xué)說，Nireberg(1966)等破譯了遺傳密碼，敘述了“中心法則”，解決了遺傳信息流向和表達的問題。第62頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

基因工程的誕生在技術(shù)理論上得益于三大發(fā)明：①Smith、Wilcox（1970）和Boyer（1972）等發(fā)現(xiàn)了限制性核酸內(nèi)切酶和Khorana(1970)等發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶，使DNA分子的切割和連接成為可能，從而為基因工程的技術(shù)操作奠定了良好的基礎(chǔ)；②Lederberg(1946)發(fā)現(xiàn)細菌的F-性因子，以后相繼發(fā)現(xiàn)和建立了其它外源基因運載體，Cohen（1973）首次將質(zhì)粒作為基因工程的運載體使用；③Baltimore和Temin(1970)等人發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，打破了中心法則，使真核基因的制備成為可能。第63頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

具備了以上的理論與技術(shù)基礎(chǔ)，基因工程誕生的條件已經(jīng)成熟。1972年Berg(伯格)等人在世界上首次進行了DNA的體外重組，得到了包含SV40和λDNA的重組DNA分子。1973年Cohen(科恩)等人將編碼卡那霉素的質(zhì)粒DNA和編碼四環(huán)素抗性的基因進行重組并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果轉(zhuǎn)化菌同時表現(xiàn)出了卡那霉素和四環(huán)素的雙重抗性，至此基因工程技術(shù)宣告誕生。隨著分子生物學(xué)基礎(chǔ)技術(shù)的發(fā)展，隨后又出現(xiàn)了雜交技術(shù)、序列測定技術(shù)、PCR技術(shù)等一系列新技術(shù)，從而使基因工程技術(shù)日臻完善，第64頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日⑵基因工程的定義基因工程（Geneticengineering)是將不同生物的基因在體外人工剪切組合并和載體（質(zhì)粒、噬菌體、病毒）DNA連接，然后轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)乃拗骷毎羞M行擴增，并使轉(zhuǎn)入的基因在細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生所需要的蛋白質(zhì)。第65頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日目前基因工程的發(fā)展極為迅速，為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)和環(huán)境科學(xué)等學(xué)科的理論研究及工業(yè)、農(nóng)業(yè)和人類日常生活都帶來了革命性的變化，其意義毫不遜色于有史以來任何一次技術(shù)革命，概括起來體現(xiàn)在以下三個方面：①用于大規(guī)模生產(chǎn)生物分子；②改造現(xiàn)有物種及設(shè)計構(gòu)建新物種；③尋找、分離和鑒定生物體的遺傳信息資源。第66頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日⑶基因工程的主要內(nèi)容一個完整的體外DNA重組過程主要包括以下步驟；①獲取目的基因并進行必要的改造；②選擇合適的載體并加以適當(dāng)?shù)男揎?③將目的基因與載體連接，獲得含有目的基因的重組載體；④將重組載體導(dǎo)入相應(yīng)細胞(稱為宿主細胞)并篩選出合重組DNA的細胞第67頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

DNA重組流程示意圖第68頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

獲得含有重組載體的細胞后，通過大量培養(yǎng)重組細胞，可以獲得目的基因的大量拷貝或目的基因的表達產(chǎn)物。通常將來自于同一始祖的一群相同分子、細菌、細胞或動物稱為克隆，獲取大量單一克隆的過程稱為克隆化，也稱無性繁殖。 廣義的重組DNA技術(shù)不僅包括DNA體外重組技術(shù)及操作過程，還包括表達產(chǎn)物的后續(xù)處理過程和技術(shù)，如：蛋白質(zhì)的分離純化、第69頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日5.3.2目的基因的獲得

(1)從基因組DNA中分離此法適用于結(jié)構(gòu)簡單的原核生物中的多拷貝基因，可直接從組織或供體中用理化方法或合適的限制性內(nèi)切酶將DNA消化后分離獲得。第70頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

①基因的隨機斷裂方法 采用一定的理化方法將基因組DNA隨機斷裂，可以得到大小基本一致的DNA片段。這些方法有用專一性核酸酶酶解，化學(xué)處理或普遍使用的機械切割法。DNA在溶液狀態(tài)是呈細長線性分子，剛性強，在受到機械剪切作用時很容易斷裂。用超聲波處理DNA溶液，可得到平均長度在一定范圍的DNA片段，使用組織搗碎，控制一定的條件，也可以使基因組DNA得到可控的剪切，如在1500rpm下，搗碎30min，可以得到平均大小為8kb的DNA片段。第71頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

②限制性內(nèi)切酶降解一般多采用“鳥槍法”，即限制性內(nèi)切酶部分酶解法。限制性內(nèi)切酶降解所產(chǎn)生的片段的長短與其識別序列的長短直接相關(guān)。理論上講，一個識別幾個堿基的限制酶位點在基因組的分布幾率為1/4n(n為限制性內(nèi)切酶所識別的特異序列中的核苷酸個數(shù))，因此采用基因組DNA進行限制酶的不完全酶解，可以得到長短不一的片段，用于構(gòu)建基因文庫。第72頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日 ⑵基因的化學(xué)合成法化學(xué)合成法是利用自動DNA合成儀直接合成基因序列的方法，適合于長度較短的基因，其前提條件是:該基因的核苷酸序列已知。對于較大的基因，可以分段合成DNA短片段，再經(jīng)過DNA連接酶作用依次連接成一個完整的基因鏈。第73頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日目前核酸的合成方法中，固相合成法是最為常用的。其原理是：首先將寡核昔酸鏈3′末端的第1個核苷酸先固定在一個不溶性的高分子(例硅膠微粒)上；然后，從此末端開始逐一加上脫氧核苷酸以延長DNA鏈，每延長1個核苷酸經(jīng)歷1個循環(huán)，合成的核苷酸被固定在固相載體上，而過量的未接上的反應(yīng)物或分解物則經(jīng)過過濾或洗滌除去；至合成所需的長度后，再將寡核苷酸鏈從固相載體上洗脫，經(jīng)分離純化后得到所需的最后產(chǎn)物。第74頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日⑶通過RNA合成cDNA以從細胞中提取的mRNA為模扳，借逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后進行基因克隆，從而獲得某種特定基因。合成cDNA技術(shù)的應(yīng)用不僅依賴于分離得到相當(dāng)純的mRNA，而且還取決于mRNA的含量。如果—種mRNA在總則RNA中的含量高，就比較容易提取純化。反之如果—種mRNA在總則RNA中的含量低，直接獲得就相當(dāng)困難。第75頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

c-DNA合成原理示意圖第76頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日⑷用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴增目的基因片段聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerasechainreaction,PCR)是一種在體外模擬天然DNA復(fù)制過程的核酸擴增技術(shù)，用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。它的基本原理是以分別位于待擴增DNA區(qū)段兩側(cè)的兩段序列互不相同并分別與模板DNA兩條鏈上的各一段互補的寡核苷酸為引物。第77頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日反應(yīng)分三步：①變性(denaturation)-通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA；②退火(annealling)-隨之將反應(yīng)混合液突然冷卻至某一溫度，反應(yīng)體系中摩爾數(shù)大大過量的引物DNA可與其互補的模板在局部形成雜交鏈；③延伸(extension)-在DNA聚合酶、4種dNTP底物及Mg2+存在下，催化以引物為起始點的5’→3’的DNA鏈延伸反應(yīng)。第78頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日聚合酶鏈式反應(yīng)示意圖第79頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

利用PCR技術(shù)可以直接從染色體DNA或cDNA快速簡便地獲得待克隆的目的基因片段，快速地進行外源基因的克隆操作。PCR技術(shù)擴增目的基因的前提是必須知道目的基因片段兩側(cè)或附近的DNA序列，并據(jù)此合成擴增引物。由PCR體外擴增的片段可經(jīng)克隆作進一步分析用，也可直接純化作各種探針用。該法也解決了微量基因片段的來源問題。第80頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日⑸基因文庫與cDNA文庫的構(gòu)建

大部分未知基因不能用上述方法獲得，需要先構(gòu)建文庫，再經(jīng)篩選獲得目的基因。文庫分為基因文庫和cDNA文庫兩種。第81頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

基因文庫(genomiclibrary)是指含有某種生物體全部基因片段的重組DNA克隆群體。構(gòu)建基因組文庫時，先將細胞染色體DNA提純，用限制性內(nèi)切酶將染色體DNA切割成大小不等的許多片段，與同一類載體拼接，繼而轉(zhuǎn)入受體菌擴增，這樣就構(gòu)建了含有多個克隆的基因組DNA文庫?；蚪MDNA文庫理論上可以涵蓋基因組的全部基因信息。第82頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

如果以細胞總mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄生成互補DNA(cDNA)，酶切后的DNA片段與合適的載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌，這樣建立的就是cDNA文庫(cDNAlibrary)。cDNA文庫理論上包含了細胞全部mRNA信息，可以利用適當(dāng)方法從cDNA文庫中篩選出目的cDNA，這是獲取結(jié)構(gòu)基因的主要方法。第83頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日基因文庫與cDNA文庫的構(gòu)建步驟第84頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日5.3.3基因工程載體

載體是指可以攜帶目的基因進入宿主細胞的運載工具?；蚬こ痰妮d體應(yīng)該符合以下條件：①具有自主復(fù)制能力，能帶動外原基因在宿主細胞內(nèi)復(fù)制和擴增；②具有較多的拷貝數(shù)，易于分離提純：⑨分子質(zhì)量相對較小，便于操作，并有足夠的接納目的基因的容量；④有供外原基因插入的多個單一限制性核酸內(nèi)切酶位點，即多克隆位點(MCS)，用于目的基因的克隆；⑥有一個或多個篩選標(biāo)記(如：對抗菌素的抗性、營養(yǎng)缺陷型或顯色表型反應(yīng)等)。第85頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日按照來源不同，可以將載體分為質(zhì)粒載體、噬菌體載體、黏粒載體、病毒載體和人工染色體載體等類型；按照用途不同，可將載體分為克隆載體和表達載體。以下簡要介紹幾類常用的載體。第86頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日⑴質(zhì)粒載體

質(zhì)粒是某些細胞中獨立于染色體以外的共價閉環(huán)的小分子雙鏈DNA，它具有獨立的復(fù)制能力，并可在細胞分裂中與染色體一道分配到子細胞中。不同質(zhì)粒的分子質(zhì)量大小不同，大的可達數(shù)百千堿基對(kb)，小的只有2—3kb。在革蘭氏陰性和陽性細菌、酵母菌以及其他一些真菌中都發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的存在。此外，質(zhì)粒往往攜帶一些抗性基因，這為重組子的選擇提供極大便利。第87頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

早期以天然質(zhì)粒作為裁體，現(xiàn)在使用的均為改造過的人工質(zhì)粒，常用的有：pBR322、pUC及pGEM等多種系列的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體不僅可以用于細菌，也可以用于酵母、哺乳動物細胞及昆蟲細胞等，既可用于目的基因的克隆，也可用于目的基因的表達。第88頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日pBR322是經(jīng)典質(zhì)粒的代表，它是由3個天然質(zhì)粒的不同部分拼接而成，全長4.36kb，是環(huán)狀雙鏈DNA分子。在細菌中的拷貝數(shù)多，便于制備：有多克隆位點，用于插入外源DNA片段;有四環(huán)素(TcR)和氨芐青霉素(ApR)兩個抗藥性基因標(biāo)記，缺失抗藥性基因的大腸桿菌被pBR322質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后便從其獲得了抗生素抗性。兩個抗生素抗性基因中均含有外源DNA克隆位點，插入外源DNA后，相應(yīng)抗性基因即失活。第89頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日質(zhì)粒pBR322的結(jié)構(gòu)圖第90頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日⑵λ噬菌體載體λ噬菌體的生活周期包括溶菌周期和溶原周期：當(dāng)λ噬菌體侵入大腸桿菌后，可以在細菌內(nèi)擴增，并使細胞裂解，釋放出大量的噬菌體顆粒；也可通過溶原途徑，使其DNA整合到大腸桿菌的染色體上，以前噬菌體的形式潛伏下來。在某些特定條件下，整合的λ噬菌體被切割下來，進入裂解周期第91頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日λ噬菌體感染途徑第92頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

λ噬菌體的基因組DNA長約48kb，在宿主體外與蛋白質(zhì)結(jié)合包裝為含有雙鏈線狀DNA分子的顆粒。由于受到包裝效率的限制，其連接目的基因后的總長度應(yīng)為λ噬菌體基因組總長度的75％一105％，超過這一范圍，重組噬菌體的活力會大大降低。第93頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

根據(jù)克隆的方式不同，λ噬菌體載體可以分為插入型載體和取代(置換)型載體兩類：插入型載體適合克隆6-8kb大小的DNA片段，常用于cDNA的克隆或cDNA文庫的構(gòu)建，如：λgt10、λgtll等；置換型載體可以允許插入長度達30kb的外派DNA片段，因而適用于基因組DNA的克隆及基因組DNA文庫和cDNA文庫的構(gòu)建，典型代表為EMBL系列和Charon系列載體。第94頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日⑶黏性質(zhì)粒與人工染色體

黏性質(zhì)粒(Cosmid)又叫柯斯質(zhì)粒，它是由質(zhì)粒和λ噬菌體的cos黏性末端構(gòu)建而成的載體系列。黏粒大小為4—6kb，兼有λ噬菌體和質(zhì)粒兩方面的優(yōu)點，可以克隆31—45kb的外源DNA片段，而且能被包裝成為具有感染能力的噬菌體顆粒。黏粒主要用于真核細胞基因組文庫的構(gòu)建。第95頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日 人工染色體是為了克隆更大的DNA片段而發(fā)展起來的新型載體，其中YAC(酵母人工染色體)是在酵母細胞中用于克隆外源DNA大片段的克隆載體。YAC可以接受100—2000kb的外源DNA的插入，是人類基因組計劃中物理圖譜繪制采用的主要載體。另外還有BAC(細菌人工染色體)以及目前正在發(fā)展的MAC(哺乳動物人工染色體)，這些載體在人類基因組計劃和其他基因組項目中起到了關(guān)鍵性作用。第96頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

上述載體主要為克隆載體，用于目的基因的克隆、擴增、序列分析及體外定點突變等。為了在宿主細胞中表達外源目的基因，獲得大量表達產(chǎn)物而應(yīng)用的載體被稱為表達載體。表達載體除了含有克隆載體中的主要元件外，還含有表達目的基因所需要的各種元件第97頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日5.3.4基因工程工具酶

⑴限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶，簡稱為限制酶，是能夠識別和切割雙鏈DNA中特定核苷酸序列的一類核酸酶。限制性內(nèi)切酶與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制—修飾體系，其功能為限制(切割)外源DNA和保護自身DNA，維持細菌自身遺傳性狀的穩(wěn)定。第98頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日限制性核酸內(nèi)切酶，按照其對輔助因子的需求和切割雙鏈DNA的特性，可以分為I、Ⅱ和Ⅲ型，三種不同的限制性核酸內(nèi)切酶具有不同的特性第99頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日基因工程技術(shù)中所用的主要是Ⅱ型限制性內(nèi)切酶，其特點為：識別與切割特定的核苷酸序列，因而產(chǎn)生特異性切口。Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的識別序列常為4—6個核苷酸的回文結(jié)構(gòu)，即同一條單鏈以中心軸對折可形成互補的雙鏈。限制性內(nèi)切酶消化后的DNA可以形成沒有單鏈突出的末端，稱為平端或鈍端，如：SmaⅠ；也可以形成有單鏈突出的所謂黏性末端。黏性末端中有5＇＇突出的黏性末端，如：BamHⅠ;也有3＇突出的黏性末端第100頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日限定性內(nèi)切酶切割DNA產(chǎn)生的DNA片段末端第101頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日⑵DNA聚合酶

DNA聚合酶催化以DNA為模板合成DNA的反應(yīng)，在基因工程技術(shù)中用于DNA的體外合成。經(jīng)常使用的DNA聚合酶有大腸桿菌DNA聚合酶I(全酶)、大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KIenow酶)、T4DNA聚合酶及耐高溫DNA聚合酶等。這些DNA聚合酶的共同特點是，它們都能夠把脫氧核糖核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3＇-羥基末端上。第102頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

該酶具有3種活性：5＇→3＇聚合酶活性、5＇→3＇外切酶活性及3＇→5＇外切酶活性。它在分子克隆中主要用于制備供核酸分子雜交用的放射性同位素標(biāo)記的DNA探針。

①大腸桿菌DNA聚合酶I第103頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

它是由大腸桿菌DNA聚合酶I(全酶)經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生出來的大片段分子。Klenow聚合酶仍具有5＇→3＇聚合酶活性和3＇→5＇外切酶活性，但是失去了5＇→3＇外切酶活性，主要用于填補經(jīng)限制酶消化所形成的DNA3＇-末端、合成cDNA的第二鏈及DNA序列的測定。②K1enow聚合酶

第104頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日③熱穩(wěn)定DNA聚合酶

aqDNA聚合酶是第一個被發(fā)現(xiàn)的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，分子質(zhì)量為65ku，最佳反應(yīng)溫度為70℃。TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶鏈反應(yīng)(pCR)。第105頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日④反轉(zhuǎn)錄酶

反轉(zhuǎn)錄酶又稱逆轉(zhuǎn)錄酶，是一類特殊的DNA聚合酶，它以RNA為模板，合成DNA。它具有5＇→3＇聚合酶活性和5＇→3＇外切酶活性。目前，已經(jīng)從許多種RNA腫瘤病毒中分離到這種酶，但最普便使用的則是來源于鳥類骨髓母細胞瘤病毒(AMV)中的反轉(zhuǎn)錄酶。在體外以mRNA模扳合成cDNA，是反轉(zhuǎn)錄酶的最主要用途。第106頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日⑶DNA連接酶DNA連接酶有兩種，一種是T4DNA連接酶(T4DNALigase)，是從噬菌體T4感染的大腸桿菌中分離純化獲得的。另一種是大揚桿菌DNA連接酶(E.coliDNALigase)，是直接從大腸桿菌中分離純化的連接酶。這兩種連接酶催化連接反應(yīng)的機制是類似的，都能把雙鏈DNA中1條單鏈上相鄰兩核苷酸斷開的磷酸二酯鍵(稱之為切口)重新閉合。第107頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日

兩種連接酶催化的反應(yīng)過程，在兩個方面有不同，一方面是T4DNA連接酶可以催化平頭末端的雙鏈DNA鏈間的連接，也能催化粘性末端的雙鏈DNA的連接。而大腸桿菌DNA連接酶對平頭末端的雙鏈DNA連接的催化效率極低，因此它一般使用于粘性末端連接。另一方面是，T4DNA連接酶催化的反應(yīng)需要能量因子ATP參與，而大腸桿菌DNA連接酶需NAD輔因子。所以，T4DNA連接酶較大腸桿菌DNA連接酶更為常用。第108頁，共121頁，2023年，2月20日，星期日⑷其他DNA修飾酶基