功能性食品總結(jié)1

第一章蛋白類生物活性物質(zhì)本章要點(diǎn)免疫球蛋白的基本概念、分布、結(jié)構(gòu)與組成牛乳中的免疫球蛋白免疫球蛋白的生物學(xué)功能乳鐵蛋白的基本性質(zhì)、生物活性及其影響因素乳鐵蛋白的分離方法溶菌酶的基本性質(zhì)、加工適應(yīng)性及其在食品中的應(yīng)用免疫球蛋白作為重要的蛋白類生物活性物質(zhì)，目前有著比較廣泛的研究背景和應(yīng)用潛力，乳鐵蛋白和溶菌酶等作為具有抑菌蛋白已經(jīng)得到廣泛的關(guān)注，因此本章介紹了它們的基本概念、來(lái)源與分布、結(jié)構(gòu)與組成、生物活性等。第一節(jié)免疫球蛋白免疫球蛋白（Immunoglobulin簡(jiǎn)稱Ig）是一類具有抗體活性，能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白。免疫球蛋白不僅存在于血液中，還存在于體液、粘膜分泌液以及B淋巴細(xì)胞膜中。它是構(gòu)成體液免疫作用的主要物質(zhì)，與補(bǔ)體結(jié)合后可殺死細(xì)菌和病毒，因此，可增強(qiáng)機(jī)體的防御能力。目前，食物來(lái)源的免疫球蛋白主要是來(lái)自乳、蛋等畜產(chǎn)品。特別是近年來(lái)人們對(duì)牛初乳和蛋黃來(lái)源的免疫球蛋白研究開(kāi)發(fā)的較多。在牛初乳和常乳中，Ig總含量分別為50和0.6mg/mL，其中約80%?86%為IgG。人乳免疫球蛋白主要以IgA為主，含量為4.1?4.75“g/g。從雞蛋黃中提取的免疫球蛋白為IgY,是雞血清IgG在孵卵過(guò)程中轉(zhuǎn)移至雞蛋黃中形成的，其生理活性與雞血清IgG極為相似，相對(duì)分子質(zhì)量164000。其活性易受到溫度、pH的影響。當(dāng)溫度在60°C以上、pHv4時(shí)，活性損失較大。、Ig的基本概念從功能性食品角度考慮，能夠與病原微生物、毒素等許多抗原發(fā)生特異性結(jié)合的Ig,其功能性機(jī)制十分確切。Ig特殊性表現(xiàn)在：①生物合成的分子遺傳學(xué)較為特別；②異種性，即表現(xiàn)型很多；③具有極其重要的生物功能。由于這些特征，必須借助一定工具才能對(duì)它們正確定性和命名。1964年，WHO首次提出了人體免疫球蛋白的名稱,一直延用至今,并用相似體系對(duì)牛以及其他動(dòng)物的這類物質(zhì)進(jìn)行了命名。實(shí)踐上,免疫球蛋白的分類與命名在很大程度上依據(jù)免疫化學(xué),包括與參照蛋白質(zhì)（一般來(lái)源于人）的交叉反應(yīng)性。（一）Ig的分類與命名實(shí)際測(cè)定每一種免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)是難以實(shí)現(xiàn)的工作,故通常根據(jù)免疫反應(yīng)特性進(jìn)行Ig分類。免疫球蛋白通常具有抗體活性,但其本身對(duì)其他種動(dòng)物或同一種系不同個(gè)體來(lái)說(shuō),也是一種抗原物質(zhì)。免疫球蛋白產(chǎn)生的遺傳背景不同,其抗原性也有差異,它們?cè)诋惙N、同種異體和同一個(gè)體內(nèi)可引起免疫應(yīng)答,產(chǎn)生相應(yīng)的抗體（抗—抗體）。因此，可利用血清學(xué)方法測(cè)定和分析免疫球蛋白的抗性，據(jù)此可將Ig分為同種型、同種異型和獨(dú)特型三種血清型。1.同種型（Isotype）它是指同一種屬所有正常個(gè)體免疫球蛋白（Ig）分子共同具有的抗原特異性標(biāo)志。同種型免疫球蛋白抗原特異性因種而異。根據(jù)Ig重鏈或輕鏈恒定區(qū)肽鏈抗原特異性的不同，可將Ig分為若干類、亞類和型、亞型。①類和亞類：根據(jù)免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)CH區(qū)）肽鏈抗原特異性的不同，可將人免疫球蛋白分為IgG、IgA、IgM、IgD和IgE5類。這5類免疫球蛋白的重鏈分別以希臘字母Y、a、&、n和E表示。這些重鏈間恒定區(qū)內(nèi)的氨基酸組成約有60％的不同,也即有約40％相同,其含糖量也存在明顯差異。同一類免疫球蛋白，因其重鏈恒定區(qū)內(nèi)肽鏈抗原特異性仍有某些差異，所以又可將它們分為若干亞類。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，IgG有4個(gè)亞類即Igq、IgG2、IgG3、IgG4,IgA有IgA］和IgA2兩個(gè)亞類，IgM有Ig叫和IgM2兩個(gè)亞類，而IgD和IgE尚未發(fā)現(xiàn)有亞類。各類Ig不同亞類間的氨基酸組成約有10%的差異。②型和亞型：各類免疫球蛋白根據(jù)輕鏈恒定區(qū)肽鏈抗原特異性的不同，可分為K和入兩型。每個(gè)Ig分子中的兩條輕鏈都是相同的，在一個(gè)Ig單體分子上不可能同時(shí)出現(xiàn)K和入型輕鏈。由于入型輕鏈恒定區(qū)內(nèi)氨基酸仍存在微小差異，因此又可將其分為4個(gè)亞型。2.同種異型（Allotype）同種異型是指同一種屬不同個(gè)體所產(chǎn)生的同一類型Ig由于重鏈或輕鏈恒定區(qū)內(nèi)一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸不同（即遺傳標(biāo)志不同）而表現(xiàn)的抗原性差異。目前已在IgG和IgA重鏈（丫和a）恒定區(qū)及k型輕鏈恒定區(qū)中發(fā)現(xiàn)有決定同種異型抗原特異性的遺傳標(biāo)志，簡(jiǎn)稱為同種異型標(biāo)志。3.獨(dú)特型（Idiotype）獨(dú)特型是指不同B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的免疫球蛋白分子V區(qū)和T、B細(xì)胞表面抗原（識(shí)別）受體V區(qū)所具有的抗原特異性標(biāo)志。（二） Ig的定義根據(jù)上述分類和命名，免疫球蛋白Immunoglobulin簡(jiǎn)稱Ig）定義為具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白。免疫球蛋白過(guò)去也稱為Y—球蛋白，主要存在于血液和某些分泌液中。應(yīng)指出，抗體都是免疫球蛋白，而免疫球蛋白并不一定都是抗體。如骨髓瘤患者血清中濃度異常增高的骨髓瘤蛋白，雖在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與抗體相似，但無(wú)抗體活性，沒(méi)有真正的免疫功能，因此不能稱為抗體。可見(jiàn)，免疫球蛋白是化學(xué)結(jié)構(gòu)上的概念，而抗體則是生物學(xué)功能上的概念。二、Ig的分布免疫球蛋白是在人的體液中廣泛分布的一種免疫物質(zhì)。人乳中以IgA為主，牛乳中則主要以IgG含量最高。牛初乳中Ig的含量受多種因素制約，如乳牛的年齡影響乳中Ig的含量和類型，較老的乳牛初乳量少且含IgG（Ig?、IgG2）低，IgG/IgG2的比值較年齡小的乳牛高。乳中Ig的濃度不受血液中Ig濃度的影響，而與泌乳階段有關(guān)，如初乳、末乳Ig含量較高。不同動(dòng)物乳汁和血清中Ig的含量如表1一1所示。各種體液中免疫球蛋白的含量如表1－2所示。三、 Ig的結(jié)構(gòu)和組成（一）基本結(jié)構(gòu)1962年，Porter首先提出IgG分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)模式。后來(lái)證實(shí)，其他幾類Ig也都具有與IgG相似的基本結(jié)構(gòu)。圖1－1為免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖。總體上看，所有Ig的基本結(jié)構(gòu)均由4條多肽鏈，即2條相同的重鏈和2條相同的輕鏈借二硫鍵連接組成的對(duì)稱結(jié)構(gòu)?；钚訧g可以是這種基本結(jié)構(gòu)單位的單體或聚合體。對(duì)于聚合態(tài)免疫球蛋白IgA和IgM而言，比IgG基本結(jié)構(gòu)多了附加的多肽鏈。此外，Ig為糖蛋白，糖基連接于重鏈。Ig的基本組成：①2條重鏈，每條均有1個(gè)由310?500個(gè)氨基酸殘基（因類別不同而異）組成的恒定區(qū)（constantregion）和1個(gè)由107?115個(gè)殘基（因可變區(qū)亞群不同而異）組成的可變區(qū)（variableregion）構(gòu)成；②2條輕鏈，每條也分別含有1個(gè)恒定區(qū)（107?110個(gè)氨基酸殘基）和1個(gè)可變區(qū)（107?115個(gè)殘基）。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈之間依靠二硫鍵以及其他非共價(jià)鍵結(jié)合，形成一個(gè)整體?？乖Y(jié)合部位正是在重鏈和輕鏈的可變區(qū)內(nèi)，故這些區(qū)域的結(jié)構(gòu)決定了抗體結(jié)合抗原的特異性。IgG的重鏈（H鏈）分子質(zhì)量約49893，由440個(gè)Aa殘基組成。其中N端1/4區(qū)域因氨基酸組成及排列順序多變，稱重鏈可變區(qū)（VH區(qū)），特別是其中第31?35，49?66，86?91和101?110位置上的氨基酸具有更大的變異性，稱之為超變區(qū)（HV區(qū)）。重鏈可變區(qū)中非HV區(qū)部分稱為骨架區(qū)。重鏈?zhǔn)Ｓ?/4區(qū)域因氨基酸組成和排列順序變化較小且相對(duì)穩(wěn)定，稱重鏈恒定區(qū)CH區(qū)）。IgG輕鏈（L鏈）分子質(zhì)量較小，約24974,由214個(gè)Aa殘基組成。其中近N端1/2區(qū)域因氨基酸組成及排列多變，稱為輕鏈可變區(qū)VL區(qū)），其中第26?34,50?56,89?93位置上的氨基酸具有更大變異性，稱之為超變區(qū)。輕鏈?zhǔn)Ｓ?/2區(qū)域因氨基酸組成及排列順序相對(duì)穩(wěn)定，故稱輕鏈恒定區(qū)CL區(qū)）。如圖1—1所示，Ig分子中兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過(guò)鏈間二硫鍵維系構(gòu)成,其中每條肽鏈又可被鏈內(nèi)二硫鍵連接折疊成幾個(gè)球形結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)使一系列對(duì)于Ig生物功能有貢獻(xiàn)的氨基酸彼此靠近，集中在一個(gè)部位，稱為Ig的功能區(qū)（domain）。IgG、IgA和IgD的重鏈有4個(gè)功能區(qū)，即VH、CH、CH和CH；123IgM和IgE的重鏈還有第5個(gè)功能區(qū)（CH4）；輕鏈則有VL和CL兩個(gè)功能區(qū)。各區(qū)主要功能如下：①VH和VL為抗原特異性結(jié)合部位；②CH】-和CL為Ig遺傳標(biāo)1?3志；③IgG的CH2和IgM的CH3是補(bǔ)體（Clq）結(jié)合部位，參與補(bǔ)體激活；^gG的CH3和IgE的CH4有親細(xì)胞活性，能使Ig結(jié)合固定于具有相應(yīng)受體的組織細(xì)胞表面。介于CH］和CH2功能區(qū)之間的區(qū)域稱為較鏈區(qū)（hingeregion）,此區(qū)含大量脯氨酸和二硫鍵，富有柔性，張合自如，可伸展180°。此種結(jié)構(gòu)有利于補(bǔ)體結(jié)合部位的暴露，為補(bǔ)體活化創(chuàng)造條件。此外，該區(qū)對(duì)木瓜蛋白酶和胃蛋白酶敏感，經(jīng)酶處理后可從該處斷裂成幾個(gè)不同的片段。免疫球蛋白的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)僅僅用于定性、分類，借以區(qū)分成各種類、亞類或者型、亞型。重、輕鏈的恒定區(qū)幾乎決定了整體Ig分子的全部抗原性。（三） IgG的氨基酸組成蛋黃IgG（即IgY）、雞血IgG和牛乳IgG的氨基酸組成見(jiàn)表1—3。牛IgG與雞IgG顯著不同，前者的Asp、Thr和Ser含量較高，而Gly、Ala和Leu的含量較低。用于制造功能性食品，為提高IgG對(duì)特定抗原的效果，常對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫處理，它對(duì)IgG氨基酸組成一般無(wú)影響。四、牛乳中的Ig乳牛或其他物種通過(guò)乳腺分泌的免疫球蛋白并非乳腺獨(dú)有的產(chǎn)物，乳腺局部合成與機(jī)體其他部位合成的免疫球蛋白完全相同。然而，乳腺分泌物，尤其是初乳，獨(dú)到之處在于富集了各種Ig,總濃度高于血液或者其他外分泌液?，F(xiàn)已經(jīng)證實(shí)，牛初乳中存在IgG、IgA、IgM、IgE和lgD等5類Ig,其中IgD尚未發(fā)現(xiàn)具有作為功能性食品的潛力。人乳及牛乳之間、初乳與常乳之間各類Ig的含量差別很大（表1—4）。表1—5為牛乳Ig主要理化性質(zhì)和生物學(xué)活性。IgG是牛初乳和常乳中含量最高的Ig,例如牛初乳中IgG占Ig總量的55%以上。IgG占血清Ig總量的75%?80%，多以單位形式存在，分子質(zhì)量為149680。IgG也是血清半衰期（約23天）最長(zhǎng)的Ig,主要由脾臟和淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞合成，是機(jī)體重要的抗菌、抗病毒和抗毒素抗體。牛初乳Ig在乳牛體內(nèi)半衰期約21天，但牛犢持續(xù)攝入初乳在4?6個(gè)月內(nèi)均有較強(qiáng)的抗病能力。IgG更是惟一能通過(guò)胎盤的抗體,故對(duì)哺乳動(dòng)物新生幼仔、新生兒抗感染起重要作用,通常嬰兒出生后3個(gè)月內(nèi)不能合成IgG。牛乳IgG至少包括兩個(gè)亞類Igq和IgG2，它們與相應(yīng)抗原結(jié)合后可激活補(bǔ)體，但各亞類與補(bǔ)體結(jié)合的能力不同，一般認(rèn)為IgG1>IgG2。在牛初乳和分娩前乳腺分泌物中，IgG］占總?cè)榍宓鞍椎慕?0%，在初乳乳清中濃度超過(guò)100mg/mL。牛IgM通常以四鏈單體的五聚物形式存在，沉降系數(shù)為19S,IgM單體經(jīng)J鏈連接予以IgM較高的抗原結(jié)合效價(jià)，在補(bǔ)體和吞噬細(xì)胞參與下，其殺菌、溶菌、激活補(bǔ)體和促吞噬等作用均顯著強(qiáng)于IgG。脾臟是IgM的主要合成部位。IgM分子質(zhì)量大，不能通過(guò)血管壁，幾乎全部分布于血液中，占血清Ig總量的5%?10%。機(jī)體感染后血液中最早產(chǎn)生的Ig是IgM。鑒于IgM在血清中的半衰期（5天左右）比IgG短，所以血清中特異性IgM含量增高提示有近期感染，臨床上測(cè)定血清特異性IgM含量有助于早期診斷。目前已知天然血型抗體、類風(fēng)濕因子和冷凝集素等均為IgM類抗體。1965年前后，一些研究者在牛體和血清中發(fā)現(xiàn)了分泌型IgA。牛IgA最有趣的特性在于它在乳汁中相對(duì)濃度較低。在大多數(shù)其他牛外分泌物中，IgA均為一種主要的免疫球蛋白，但在牛初乳和常乳中含量相對(duì)較低。分泌型IgA為人初乳中含量最高的Ig,初產(chǎn)、年輕婦女乳汁IgA濃度以較快速度下降。牛初乳中IgG可部分替代IgA的生物功能。血清型IgA和分泌型IgA不能通過(guò)胎盤。嬰兒在出生4?6個(gè)月后才能自身合成IgA,需從母親乳汁中獲得分泌型IgA,這對(duì)嬰兒抵抗呼吸道和消化道病原微生物的感染具有重要意義。這是大力提倡母乳喂養(yǎng)的重要原因之一。五、Ig的生物學(xué)功能Ig的生物學(xué)功能和抑菌特性如表1—6、表1—7所示。以下簡(jiǎn)要介紹Ig的幾個(gè)主要生物學(xué)功能。（一） 與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合免疫球蛋白最主要的功能是能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合,在體外引起各種抗原-抗體的反應(yīng)。抗原可以是侵入人體的菌體、病毒或毒素，它們被Ig特異性結(jié)合后便喪失破壞機(jī)體健康的能力。需指出，若Ig發(fā)生變性，空間構(gòu)象發(fā)生變化便可能無(wú)法與抗原發(fā)生特異性結(jié)合,即喪失了相應(yīng)的抗病能力。（二） 活化補(bǔ)體IgG和IgM與相應(yīng)抗原結(jié)合后，可活化補(bǔ)體經(jīng)典途徑（Classicalpathway,CP）,1?3即抗原一抗體復(fù)合物刺激補(bǔ)體固有成分C1-C9發(fā)生酶促連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，最終發(fā)生細(xì)胞溶解作用的補(bǔ)體活化途徑。通常Ig分子呈“T”型，與抗原結(jié)合后發(fā)生構(gòu)型改變而呈Y”型，此時(shí)IgG分子中原來(lái)被掩蓋的CH2功能區(qū)即補(bǔ)體結(jié)合點(diǎn)所在處得以暴露,從而使C19與該區(qū)補(bǔ)體結(jié)合點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)活化途徑oIgGi—3的補(bǔ)體結(jié)合點(diǎn)位于CH2功能區(qū)，而IgM的補(bǔ)丄D 乙體結(jié)合點(diǎn)則位于ch3功能區(qū)。兩類Ig活化補(bǔ)體的能力也有所不同，一般地，一個(gè)IgM分子就可活化補(bǔ)體經(jīng)典途徑。IgA和IgE不能通過(guò)經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體，但它們的凝聚物能活化補(bǔ)體旁路途徑（AlternativepathwayAP）。（三） 結(jié)合細(xì)胞產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)免疫球蛋白（Ig）能夠通過(guò)其FC段與多種細(xì)胞（表面具有相應(yīng)FC受體）結(jié)合，從而產(chǎn)生多種不同的生物效應(yīng)。（四） 通過(guò)胎盤傳遞免疫力Ig的轉(zhuǎn)移方式，不同類型的Ig在不同的動(dòng)物的母體和幼體間有不同的Ig轉(zhuǎn)移方式，對(duì)于在多種病原菌中出生的幼體，母親傳遞給幼體多種抑菌物質(zhì),Ig是其中最主要的一種。第二節(jié)乳鐵蛋白近年來(lái)，乳鐵蛋白（Lf）的研究受到廣泛重視。1993年在日本召開(kāi)了第一屆乳鐵蛋白（Lf）的結(jié)構(gòu)與功能的國(guó)際會(huì)議,會(huì)上研究者就Lf的鐵結(jié)合機(jī)制、生物功能、醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用和食品中的應(yīng)用進(jìn)行了探討，這標(biāo)志著Lf特有的生物學(xué)意義已受到世界范圍的廣泛重視。一、Lf的基本性質(zhì)（一） Lf的基本結(jié)構(gòu)和組成乳鐵蛋白是一種天然蛋白質(zhì)的降解物，存在于牛乳和母乳中。乳鐵蛋白晶體呈紅色，是一種鐵結(jié)合性糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為77100±1500。牛乳鐵蛋白的等電點(diǎn)（pl）為8,比乳鐵蛋白高2個(gè)pH單位。在1分子乳鐵蛋白中，含有2個(gè)鐵結(jié)合部位。其分子由單一肽鍵構(gòu)成，谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和丙氨酸的含量較高除含少量半胱氨酸外,幾乎不含其他含硫氨基酸；終端含有一個(gè)丙氨酸基團(tuán)。1939年，Sorensen等人在分離乳清蛋白時(shí)得到一種紅色蛋白,Polis等人在分離Lp時(shí)也得到部分純化的紅色蛋白，但直到1959年Groves用色譜法得到純的紅色物質(zhì)后，才確認(rèn)這種紅色物質(zhì)是一種含鐵蛋白質(zhì)，稱之為乳鐵蛋白LactoferrinLf）,又稱紅蛋白。通過(guò)Lf的組成和氨基酸順序分析，證明它是由轉(zhuǎn)鐵蛋白（TransferrinTf）演變而來(lái)。各種哺乳動(dòng)物（如人、羊、牛）的乳鐵蛋白在氨基酸排列上有較小的差異。Lf的相對(duì)分子質(zhì)量是77000±2000,它是一種鐵結(jié)合糖蛋白，1分子Lf能結(jié)合兩個(gè)Fe3+離子，含15?16個(gè)廿露糖，5?6個(gè)半乳糖，10?11個(gè)乙酰葡萄糖胺和1個(gè)唾液酸,其中中性糖8.5％,氨糖2.7％。乳清Lf和初乳L(zhǎng)f有相同的性質(zhì)。X光衍射實(shí)驗(yàn)（XRD）表明，其主體呈無(wú)柄銀杏葉并列狀結(jié)構(gòu)，鐵離子結(jié)合在兩葉的切入部位，F(xiàn)e離子的間隔為0.28?0.43|Jm,橢圓形葉的大小為0.55|JmX0.35|JmX0.35pm。乳鐵蛋白由乳腺合成，分娩后乳腺合成Lf的能力減弱，故其含量在分娩幾天后迅速下降。乳鐵蛋白是由血清中轉(zhuǎn)移而來(lái)?，F(xiàn)已證明乳鐵蛋白有兩種分子形態(tài),相對(duì)分子質(zhì)量為86000和82000,其主要差別在于它們所含的糖類不同,經(jīng)溴化氰切斷和脫糖化實(shí)驗(yàn)證實(shí)Lf是以復(fù)相分子形式存在，它們的生理功能的差別尚不清楚。（二） Lf的金屬結(jié)合性質(zhì)1分子飽和Lf中含兩個(gè)Fe3+離子。乳鐵蛋白不僅能結(jié)合Fe3+,且對(duì)CW+也有結(jié)合作用，其結(jié)合能力也是每個(gè)Lf分子含兩個(gè)CW+。在乳鐵蛋白和Fe或Cu形成絡(luò)合物的過(guò)程中有碳酸氫鹽的參與，F(xiàn)e或Cu和碳酸氫鹽的比例為1:1,碳酸氫鹽的存在對(duì)絡(luò)合物的生成有催化作用。維生素C對(duì)缺鐵Lf的飽和過(guò)程也有催化作用,維生素C的存在有利于飽和Lf的形成，Tf也有類似的性質(zhì)。用XRD實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Tf的鐵結(jié)合2個(gè)酪氨酸，1個(gè)組氨酸，1個(gè)天冬氨酸和碳酸根，碳酸根上連接1個(gè)精氨酸和水分子，這種模式是否和Lf一樣，尚需實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)。（三）Lf的熱力學(xué)性質(zhì)對(duì)加熱Lf的抗原性和其它生物活性進(jìn)行分析的結(jié)果表明：缺鐵乳鐵蛋白pH>7時(shí)膠凝，pH<7時(shí)不沉淀，pH=4.0時(shí)90°C?100°C、5min的加熱，對(duì)Lf的鐵結(jié)合能力、抗菌性沒(méi)有影響；在pH2.0?3.0,100C?120°C，加熱5min后，Lf明顯地降解,但其抑菌活性反而增強(qiáng)。對(duì)多種乳清蛋白的熱變性溫度的研究表明，飽和Lf有兩個(gè)變性峰（69.0C和83.5C）,不飽和Lf有一個(gè)變性峰（64.7C）。第一個(gè)峰是一鐵離子Lf,第二個(gè)峰是二鐵離子Lf；一鐵Lf和二鐵Lf的變性焓分別是2100kJ/mol和2900kJ/mol。二、Lf的生物活性及其影響因素（一）Lf的生物活性乳鐵蛋白具有結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的能力,到達(dá)人體腸道的特殊接受細(xì)胞中后再釋放出鐵,這樣就能增強(qiáng)鐵的吸收利用率,降低有效鐵的使用量,減少鐵的負(fù)面影響。乳鐵蛋白對(duì)鐵的結(jié)合，避免了人體內(nèi)OH?有害物質(zhì)的生成。超氧離子O2-?和抗壞血酸鹽或H2O2反應(yīng)能產(chǎn)生高反應(yīng)活性的OH?,這種OH?被認(rèn)為是一種對(duì)人體有害的物質(zhì)，O2-?和H2O2的反應(yīng)稱之為Haber—Weiss反應(yīng)，它在過(guò)渡元素（如Fe）的催化下進(jìn)行反應(yīng)。該反應(yīng)的產(chǎn)物OH?能殺死幾乎所有的微生物生物分子和誘導(dǎo)脂氧化。乳鐵蛋白還有多種生物活性，歸納起來(lái)有以下幾個(gè)方面：刺激腸道中鐵的吸收。抑菌作用，抗病毒效應(yīng)。調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞功能。調(diào)節(jié)發(fā)炎反應(yīng)，抑制感染部位炎癥。抑制由于Fe2+引起的脂氧化，F(xiàn)e2+或Fe3+的生物還原劑（如抗壞血酸鹽）是脂氧化的誘導(dǎo)劑。（二） Lf生物活性的影響因素乳鐵蛋白的生物活性受多種因素的制約，鹽類、鐵含量、pH、抗體或其他免疫物質(zhì)、介質(zhì)等均有影響。它的鐵含量對(duì)其抑菌作用有決定性作用，碳酸鹽的存在可明顯增強(qiáng)其抑菌能力，而檸檬酸鹽的增加卻明顯減弱其抑菌能力。另外，它的抑菌效果還與pH密切相關(guān)，在pH7.4時(shí)效果明顯高于pH6.8,pH<6基本無(wú)抑菌作用。鐵飽和程度的影響：乳鐵蛋白的鐵含量對(duì)抑菌有決定性作用，如從乳房炎中分離的大腸桿菌、葡萄球菌和鏈球菌類在一定的合成介質(zhì)中均被缺鐵乳鐵蛋白抑制，這種抑制作用因加入Fe3+使其飽和而消失，說(shuō)明了乳鐵蛋白抑菌作用的鐵依賴性，它的抗脂氧化有類似結(jié)果。鹽類作用：在上述實(shí)驗(yàn)中，碳酸鹽的存在可明顯增強(qiáng)乳鐵蛋白的抑菌能力，檸檬酸鹽的增加明顯減弱了缺鐵乳鐵蛋白對(duì)三種菌的抑制。乳汁的實(shí)際抑菌作用和其分泌的乳鐵蛋白與檸檬酸鹽的比例有關(guān)，其實(shí)質(zhì)仍是二者競(jìng)爭(zhēng)Fe3+使微生物可對(duì)鐵利用，因而減弱了抑制能力。pH的影響：乳鐵蛋白的抑菌效果和pH密切相關(guān)，在pH7.4時(shí)效果明顯高于pH6.8，pH<6基本無(wú)抑菌作用。抗體或其它免疫物質(zhì)間的協(xié)同作用：研究表明乳鐵蛋白和IgA抑菌有協(xié)同作用，Sarllson等人也得出相同結(jié)論。介質(zhì)的作用：金黃色葡萄球菌用1125示蹤蛋白實(shí)驗(yàn)表明：85%能和Lf穩(wěn)定結(jié)合，其它部分很少或不能結(jié)合，其介質(zhì)以血液、胨—瓊脂較好，鹽汁或富鹽脫脂乳較差，最適pH為4.0?7.0。形態(tài)：Lf的生物活性和其形態(tài)有關(guān)，如10%水解的Lf有最好的抑菌效果，HPLC法分析有8種Lf的降解肽存在。動(dòng)物的種類：Lf的活性和動(dòng)物的種類相關(guān)，人、牛、羊等乳汁中Lf的含量和結(jié)構(gòu)稍有不同，在許多體液、組織液（如唾液、鼻汁、膽汁、精液、淚等）均有Lf存在，它們?cè)谶@些部分參與生物調(diào)解作用。Lf對(duì)多種病原菌有抑制作用，服用含Lf的食品或制劑，對(duì)抑制腸道的病原菌，增加有益菌類和平衡腸道菌群，均有較好的作用。三、Lf的分離方法目前報(bào)道的Lf分離方法很多，主要有色譜法（吸附色譜法、離子交換色譜法、親合色譜法、固定化單系抗體法等）和超濾法。色譜法的優(yōu)點(diǎn)是分離效果好、純度高，抗體被固定化可重復(fù)使用，其缺點(diǎn)是柱的制備工藝復(fù)雜，抗體成本昂貴，難以工業(yè)化生產(chǎn)。超濾法操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用相對(duì)較低，易于形成工業(yè)化規(guī)模，其缺點(diǎn)是乳鐵蛋白純度較低，膜需經(jīng)常清洗。超濾法是生產(chǎn)食品用乳鐵蛋白最具實(shí)現(xiàn)工業(yè)化潛力的方法之一。第三節(jié)溶菌酶溶菌酶(LysozymeLz,EC(321.17))又稱胞壁質(zhì)酶(Muramidase)或N—乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶(N—Acetylmuramideglycanohydralase)，它于1922年由英國(guó)細(xì)菌學(xué)家Fleming在人的眼淚和唾液中發(fā)現(xiàn)并命名。它廣泛存在于鳥(niǎo)、家禽的蛋清,哺乳動(dòng)物的眼淚、唾液、血漿、尿、乳汁和組織(如肝腎)細(xì)胞中，其中以蛋清中含量最為豐富，而人的眼淚、唾液中的Lz活力遠(yuǎn)高于蛋清中Lz的活力。一、Lz的基本性質(zhì)Lz是一種堿性球蛋白，廣泛存在于鳥(niǎo)和家禽的蛋清中。其酶蛋白性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)熱穩(wěn)定性很高。母乳中的Lz活力比雞蛋清Lz高3倍，比牛乳L(zhǎng)z高6倍。Lz是由129個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量14200,等電點(diǎn)為pH10.7?11.0,分子內(nèi)有4個(gè)二硫鍵交聯(lián)，對(duì)熱極為穩(wěn)定。Shahani等人報(bào)告牛乳的Lz相對(duì)分子質(zhì)量為18000一級(jí)結(jié)構(gòu)尚未確定。人乳L(zhǎng)z和a—乳白蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)有74%是相同的，a—乳白蛋白是人乳中含量較多的蛋白質(zhì),它對(duì)于乳腺中乳糖的合成是必不可少的,是乳糖合成酶的輔酶。溶菌酶和a—乳白蛋白在生物學(xué)上是同源的，但它們的三級(jí)結(jié)構(gòu)有著很大的差異。Lz通過(guò)其肽鍵中第35位的谷氨酸和第52位的天門冬氨酸構(gòu)成的活性部位，水解破壞組成微生物細(xì)胞壁的N—乙酰葡萄糖胺與N—乙酰胞壁質(zhì)酸間的卩一(1,4)糖苷鍵，使菌體細(xì)胞壁溶解而起到殺死球菌的作用。Lz在人血清中含量平均為0.6?l.Omg/100mL，人初乳中達(dá)40mg/100mL,牛乳中的含量約為人乳的1／3000,目前在人、豬、貓、兔、馬、驢、猴乳中均發(fā)現(xiàn)有Lz存在，羊、山羊的乳中僅有微量的Lz。二、Lz的加工適應(yīng)性（一）熱穩(wěn)定性Lz在酸性pH下是穩(wěn)定的，此時(shí)100°C的加熱對(duì)Lz僅有很小的活力損失。在pH4.5（100C，3min）、pH5.29（100C，3min）下加熱Lz是穩(wěn)定的。一般認(rèn)為L(zhǎng)z在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件不穩(wěn)定。Genentech和Genoneor兩公司用遺傳工程的方法生產(chǎn)出一種改性溶菌酶，此酶中有一種新的二硫鍵，這個(gè)鍵通過(guò)穩(wěn)定酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)而增加了溶菌酶的熱力學(xué)穩(wěn)定性，使其在食品防腐方面更為有效。糖和聚烯烴類能增加Lz的熱穩(wěn)定性，NaCl對(duì)Lz也有抗熱變性作用，而且鹽溶液的存在對(duì)Lz的活力是十分必要的。在低鹽濃度時(shí)，Lz的活化和離子強(qiáng)度密切相關(guān)，在高鹽濃度時(shí)Lz的活力受到抑制，陽(yáng)離子的價(jià)態(tài)愈高則其抑制作用愈強(qiáng)。具有一COOH和一SH3OH基的多糖對(duì)Lz活力有抑制作用。（二）加工過(guò)程中的化學(xué)反應(yīng)蛋白質(zhì)和過(guò)氧化的脂類作用對(duì)食品的貯藏有著重要影響，自由基使不飽和脂肪酸過(guò)氧化產(chǎn)生h2O2,導(dǎo)致產(chǎn)品的損壞，這類反應(yīng)后的一個(gè)特征是產(chǎn)品的溶解性下降。溶菌酶和過(guò)氧化甲基亞油酸鹽一起培養(yǎng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度的下降和增加了溶解部分的分子質(zhì)量。這是由于在Lz中產(chǎn)生了游離基，而導(dǎo)致其和過(guò)氧化的甲基亞油酸作用，研究表明Lz中游離基濃度隨水分活度的上升而下降。在150C?300C焙烤對(duì)溶菌酶和酪蛋白的作用，溶菌酶被作為一個(gè)純蛋白質(zhì)樣品，在250C幾乎所有溶菌酶的氨基酸被分解，色氨酸、含硫氨基酸、堿性氨基酸和“一OH氨基酸，較酸性氨基酸、脯氨酸、芳香族氨基酸（除色氨酸外、有烷側(cè)鏈的氨基酸容易分解，這在氨基酸和還原糖間形成風(fēng)味和有色物質(zhì)的美拉德反應(yīng)中是很重要的。絡(luò)合作用溶菌酶和許多物質(zhì)形成絡(luò)合物導(dǎo)致其失活。人們發(fā)現(xiàn)等量蛋清和蛋黃的混合物其溶菌酶無(wú)活力；脫水全蛋中僅保留部分溶菌酶活力；蛋黃污染的蛋清僅有兩個(gè)離子交換色譜峰，而不是無(wú)污染的三個(gè)峰；對(duì)全蛋的色譜分離無(wú)溶菌酶。據(jù)此研究者認(rèn)為抑制機(jī)理是在溶菌酶和蛋黃化合物間形成靜電相互作用的絡(luò)合物所致。三、Lz在食品中的應(yīng)用由于Lz對(duì)多種微生物有抑制作用，因此可以用于食品保藏。目前已經(jīng)用于香腸、魚(yú)片、火腿、蔬菜和水果的防腐劑。在日本，Lz還用于豆腐的保存。Lf、Lz有防止腸道炎和變態(tài)反應(yīng)的作用，因此可用于嬰幼兒食品。而且Lz可以使腸道Bifidusbacillus增殖，對(duì)嬰幼兒的腸道菌群有平衡作用。人們對(duì)Lz添加于干酪等乳制品的影響進(jìn)行了廣泛研究。Lz加入乳中，可引起酪蛋白的水解。Lz的添加可以使用CaCl2進(jìn)行乳凝的時(shí)間縮短。Edam干酪易受到丁酸菌的污染，用氣。?、硝酸鹽或用Lz對(duì)丁酸菌可以進(jìn)行抑制。在加工Edam干酪時(shí)加入Lz不但對(duì)加工工藝無(wú)任何影響，而且還可以明顯改善干酪的感官質(zhì)量。意大利干酪、Edam干酪和Gouda干酪后期膨脹產(chǎn)氣主要是Clostridumtyrobutyricum所致。用500單位/mL的Lz能殺死99%的Clostridumtyrobutyricum(5X105),為此，Lz可替代硝酸鹽防止干酪產(chǎn)氣。特別是添加干酪中的Lz還可以回收使用，添加于酸乳清、乳、皺胃酶乳清和干酪中的Lz的回收率分別為97%?100%、75%?80%、88%?93%和87%?91%。Lz還可以用于各種肉腸類食品起防腐作用。將Lz、NaCl和NaNO?三者相結(jié)合的防腐效果比單獨(dú)使用Lz或NaCl+NaNO2的效果好。此外，溶菌酶還可用于保存海產(chǎn)品。第四節(jié)其它蛋白類生物活性物質(zhì)一、金屬硫蛋白(MetallothioneinMT)金屬硫蛋白，是一種含有大量Cd和Zn、富含半胱氨酸的低相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)。相對(duì)分子質(zhì)量6000-10000每摩爾金屬硫蛋白含有60?61個(gè)氨基酸，其中含一SH的氨基酸有18個(gè)，占總數(shù)的30%。每3個(gè)一SH鍵可結(jié)合1個(gè)2價(jià)金屬離子。金屬硫蛋白的生理功效，體現(xiàn)在：參與微量元素的貯存、運(yùn)輸和代謝。清除自由基，拮抗電離輻射。重金屬的解毒作用。參與激素和發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)各種應(yīng)激的反應(yīng)。參與細(xì)胞DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分解以及能量代謝的調(diào)節(jié)過(guò)程。全世界接受治療的癌癥患者中，50%?70%曾接受過(guò)放射性與化學(xué)治療。放射性與化療在傷害癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞有嚴(yán)重的損傷，導(dǎo)致出現(xiàn)白細(xì)胞減少癥，使患者生存質(zhì)量惡化。應(yīng)用特異活性成分防止放療的副作用，保護(hù)正常人體細(xì)胞，已成為提高癌癥放療治愈率、改善患者生存質(zhì)量的重要方面。金屬硫蛋白就是這樣一種有效的活性成分，它具有很強(qiáng)的抗輻射、保護(hù)細(xì)胞損傷及修復(fù)損傷細(xì)胞的功能。某些行業(yè)的工作人員，長(zhǎng)期與重金屬(如Hg、Pb)接觸，可引起中毒，出現(xiàn)四肢疼痛、口腔疾病、