制備柱注意事項(xiàng)

HPLC的常用術(shù)語1、 色譜圖(chromatogram)：色譜柱流出物通過檢測器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間或流動(dòng)相流出體積的曲線圖，或者通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ^察到的紙色譜或薄層色譜斑點(diǎn)、譜帶的分布圖。2、 (色譜)峰(chromatographicpeak)：色譜柱流出組分通過檢測器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的微分曲線。此主題相關(guān)圖片如上：3、 峰底(peakbase)：峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間的連接的直線(圖1中的CD)。4、 峰高(h，peakheight)：色譜峰最大值點(diǎn)到峰底的距離(圖1中的BE)。5、 峰寬(W，peakwidth)：在峰兩側(cè)拐點(diǎn)(圖1中的F,G)處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)的距離(圖1中的KL)。6、 半高峰寬(Wh/2，peakwithdathalfheight)：通過峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離(圖1中的HJ)。7、 峰面積(A，peakarea)：峰與峰底之間的面積(圖1中的CHEJDC)。8、 拖尾峰(tailingpeak)：后沿較前沿平緩的不對(duì)稱的峰。9、 前伸峰(leadingpeak)：前沿較后沿平緩的不對(duì)稱的峰。(又叫伸舌峰、前延峰)10、 假峰(ghostpeak)：除組分正常產(chǎn)生的色譜峰外，由于儀器條件的變化等原因而在譜圖上出現(xiàn)的色譜峰，即并非由試樣所產(chǎn)生的峰。這種色譜峰并不代表具體某一組分，容易給定性、定量帶來誤差。(又叫鬼峰)11、畸峰(distrortedpeak)：形狀不對(duì)稱的色譜峰，前伸峰、拖尾峰都屬于這類。12、 反峰(negativepeak)：也稱倒峰、負(fù)峰，即出峰的方向與通常的方向相反的色譜峰。14、 原點(diǎn)(origin)：紙或薄層板上滴加試樣部位的中心點(diǎn)(圖2)。15、 斑點(diǎn)(spot)：平面色譜法中，組分在展開和顯譜后呈現(xiàn)近似圓形或橢圓形的色區(qū)(圖2)。16、 區(qū)帶(zone)：在色譜柱、紙或薄層板上被分離組分所占的區(qū)域。17、 復(fù)斑(multiplespot):一種組分展開后形成兩個(gè)或多個(gè)清晰斑點(diǎn)。18、 區(qū)帶拖尾(zonetailing):由于物理、化學(xué)等作用的影響，一種組分在展開后形成的彗星形狀斑點(diǎn)。19、 基線(baseline):在正常操作條件下，僅有流動(dòng)相通過檢測器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)曲線。20、 基線漂移(baselinedrift):基線隨時(shí)間定向的緩慢變化。21、 基線噪聲(N，baselinenoise):由于各種原因而引起的基線波動(dòng)。22、 統(tǒng)計(jì)矩(moment):色譜流出曲線是組分在檢測器中濃度或質(zhì)量依時(shí)間的統(tǒng)計(jì)分布曲線，響應(yīng)值對(duì)應(yīng)于分布密度。組分在柱內(nèi)遷移時(shí)間r次冪的數(shù)學(xué)期望稱為流出曲線的r階原點(diǎn)矩。而組分在柱內(nèi)遷移時(shí)間與平均遷移時(shí)間差的r次冪的數(shù)學(xué)期望稱為流出曲線的r階中點(diǎn)矩。23、 一階原點(diǎn)矩(firstoriginmoment):組分在柱內(nèi)遷移時(shí)間的數(shù)學(xué)期望。當(dāng)流出曲線為對(duì)稱峰時(shí)，即為組分的保留時(shí)間。24、二階中心矩( µ2，secondcentralmoment):二階中心矩為流出曲線的方差。定義為：µ2=E(t-Et)2式中，E代表平均。25、 三階中心矩(µ3，thirdcentralmoment)：定義為：µ3=E(t-Et)3可以表示流出曲線的不對(duì)稱程度。峰形對(duì)稱時(shí)µ3=0，前伸峰µ3<0 ，拖尾峰µ3>0。第二部分分離模式1、 液相色譜法(liquidchromatography，LC)：用液體作流動(dòng)相的色譜法。2、 液液色譜法(liquidliquidchromatography，LLC)：將固定液涂漬在載體上作為固定相的液相色譜法。3、 液固色譜法(liquidsolidchromatography，LSC)：用固體(一般指吸附劑)作為流動(dòng)相的液相色譜法。4、 正相液相色譜法(normalphaseliquidchromatography，NPLC):固定相的極性較流動(dòng)相的極性強(qiáng)的液相色譜法。5、 反相液相色譜法(reversedphaseliquidchromatography,RPLC)：固定相的極性較流動(dòng)相的極性弱的液相色譜法。6、 柱液相色譜法(liquidcolumnchromatography)：在柱管內(nèi)進(jìn)行組分分離的液相色譜法。7、 高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)：具有高分離效能的柱液相色譜法。8、 尺寸排除色譜法(sizeexclusionchromatography,SEC)：用化學(xué)惰性的多孔性物質(zhì)作為固定相，試樣組分按分子體積(嚴(yán)格來講是流體力學(xué)體積)進(jìn)行分離的液相色譜法。9、凝膠過濾色譜法：(gelfiltrationchromatography)：水或水溶液作為流動(dòng)相的體積排除色譜法。10、 凝膠滲透色譜法：(gelpermeationchromatography,GPC)：有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相的體積排除色譜法。11、 親和色譜法(affinitychromatography)：用連接在基體上的配位體做固定相，使其與蛋白質(zhì)或其他大分子發(fā)生可逆的高選擇性的相互作用，利用不同親和力進(jìn)行分離的液相色譜法。12、 離子交換色譜法(ionexchangechromatography,IEC)：以離子交換作用分離離子型化合物的液相色譜法。13、 離子色譜法(ionchromatography)：以含有某種特定離子的水溶液作為流動(dòng)相，流出液通過抑制柱(或不通過抑制柱)，在降低流動(dòng)相背景信號(hào)的條件下用于分離離子的液相色譜法。14、 離子抑制色譜法(ionsuppressionchromatography)：通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的PH值來抑制試樣組分的電離，以分離離子型化合物的液相色譜法。15、 離子對(duì)色譜法(ionpairchromatography)：用形成離子對(duì)化合物進(jìn)行分離的液相色譜法。16、疏水作用色譜法(hydrophobicinterationchromatography):用適度疏水性的固定相，以含鹽的水溶液作為流動(dòng)相,借疏水作用分離生物大分子化合物的液相色譜法。17、 制備液相色譜法(preparativeliquidchromatography):用能處理較大量試樣的色譜系統(tǒng)，進(jìn)行分離、切割和收集組分，以提純化合物的液相色譜法。18、 平面色譜法(planarchronatography):在平面介質(zhì)上進(jìn)行組分分離的色譜法，也叫平板色譜法。<<常用術(shù)語>>A：吸收度(式3.1,3.2)；也作面積ACN：乙腈(acetonitrile)B(%B)：二元流動(dòng)相中的強(qiáng)溶劑(％v/v)C8,C18:烷基鍵合相的鍵長度(八烷基或十八烷基)CD：環(huán)糊精(cyclodextrin)CV：變異系數(shù)(通常以％表示)；式15.3dC：色譜柱內(nèi)徑(cm)dP：顆粒直徑(um)DAD：二極管陣列檢測器EC：電化學(xué)(檢測器)F：流速(ml/min)FL：熒光(檢測器)GS：梯度斜度參數(shù)(式8.2a)；k*=20/GSh'：峰咼HPLC：高效液相色譜ID：內(nèi)徑，dCIEC：離子交換色譜(ion-exchangechromatography)IPC:離子對(duì)色譜(ion-pairechromatography)k：保留因子(式2.4)k*:梯度洗脫中,k的有效值或平均值(式8.1)ka,kZ：色譜圖中，首峰(a)和末峰(z)的k值L：色譜柱長度(cm)LC-MS:液相色譜-質(zhì)譜M：分子量MC：二氯甲烷(methylenechloride)MeOH:甲醇(methanol)MS:質(zhì)譜MTBE:甲基-叔-丁醚(methyl-t-butylether)N：色譜柱塔板數(shù)(式2.82.8b)N'：噪音(式3.3,圖3.3)NARP:非水反相HPLCNPC：正相色譜P：色譜柱壓力降(通常以psi表示)(式2.9)pKa:酸或供質(zhì)子堿的酸性常數(shù)PAH：多環(huán)芳烴(polyaromatichydrocarbon)RS：分離度(式2.1)RI：折光指數(shù)RPC：反相色譜S：信號(hào);式3.3;圖3.3;以及由式6.1定義的參數(shù)tD：延遲或滯留時(shí)間(min，用于梯度洗脫中);等于VD/FtG：梯度時(shí)間(min)tR：保留時(shí)間(min)(圖2.2);等于tO(1+k)tRa,tRz:色譜圖中首峰(a)與末峰(z)的保留時(shí)間，tR(min)(圖8.6a)tO：色譜柱死時(shí)間(min)(式2.5)tl,t2:相鄰譜峰1與譜峰2的保留時(shí)間(min)TEA:三乙胺(triethylamine)THF:四氫咲喃(tetrahydrofuran)UV：紫外光譜VD：延遲或滯留體積(mL);為梯度混合器與色譜柱人口之間的體積(包括混合器的體積)Vm：色譜柱死體積(mL)(式2.6);Vm為色譜柱內(nèi)部的流動(dòng)相體積，不包括附于固定相上的溶劑Vmax:最大樣品體積(mL)(式13.1)Va：樣品體積(mL)w：重量(mg);也作半峰高處的峰寬(min)wmax:不超載色譜柱的最大進(jìn)樣量(mg)(式2.17)wS：色譜柱的飽和容量(mg)(式13.4)W：峰底寬(min)(圖2.2)Wth:大進(jìn)樣量對(duì)峰底寬的貢獻(xiàn)(min)(式13.2)WO：小進(jìn)樣量的峰底寬(min)W1/2:半峰高處的峰寬(min)(圖1.1)a：分離因子，等于k2/k1,其中k2與k1分別為相鄰譜峰2和譜峰1的k值△tR：tRz-tR(min)△%B：梯度洗脫期間,％B的變化￡:摩爾吸收系數(shù)￡0：正相HPLC中溶劑或溶劑混合液的強(qiáng)度n粘度(CP)<<不常有符號(hào)>>A,B,C：式2.11中的常數(shù);數(shù)值A(chǔ),B與C隨k值而變化,但改變其它條件或溶質(zhì)時(shí)基本不變A',B',C':式2.10中的常數(shù);數(shù)值A(chǔ)',B'與C'隨條件和樣品而變化A”,B”,C”：式2.10a中的常數(shù);數(shù)值A(chǔ)”,B'與C”隨條件和樣品而變化C：譜峰最大值處的濃度(mol/L)CO：注入樣品中溶質(zhì)的濃度(mol/L)GI：化學(xué)電離(MS)DGA：N,N-二甲基-1-萘酰胺;(也作二甲基苯胺dimethylaniline)EI：電子電離(MS)ELS:蒸發(fā)光散射擊(Evaporativelightscattering)EtOAc:乙酸乙酯(ethylacetate)FAB：快速原子轟擊(MS)FD：場解吸附(MS)h：折合板高，等于H/dP(式2.11)HB：羥基苯甲酸(hydrxybenzoicacid)(圖7.8,7.17與7.19)HFBA：七氟丁酸(hyptafluorobutyricacid)IPA：異丙醇(isopropanol)kW：以水作為流動(dòng)相的k值(式6.1)LCEC:液相色譜電化學(xué)檢測器LD：激光解吸(MS)LSIMS:液態(tài)二級(jí)離子質(zhì)譜MALDI：基質(zhì)輔助激光解吸電離MP：對(duì)羥苯甲酸甲酯[P-]m:流動(dòng)相中離子對(duì)試劑P-的濃度(mmol/L)PAD：脈沖電流分析檢測器PBP：極性鍵合相PD：等離子解吸(MS)PP：對(duì)羥苯甲酸丙酯PTH：乙內(nèi)酰苯硫脲R+,R-:分別為陰離子與陽離子離子交換色譜柱中的荷電功能基困(式7.4和7.5[如-N(CH3)3+和-SO3-]RF：響應(yīng)因子TBA+:四丁基銨離子tBME：見MTBETMS：三甲基硅烷(trimethylsilyl;也為C1)TNB：1,3,5-三硝基苯(1,3,5-trinitrobenzene)TOFMS：時(shí)間飛行質(zhì)譜TSP：熱噴霧(MS)u：流動(dòng)相通過色譜柱的速度(cm/s);等于L/toV：峰底寬(mL)Vc：色譜柱內(nèi)峰展寬對(duì)V的貢獻(xiàn);也作小樣品量峰底寬(mL)(式2.16)VR：保留體積(mL)W：峰寬(min)(式2.12)Wc，WS,：分別為色譜柱，進(jìn)樣器，連續(xù)管和流通池對(duì)W的貢獻(xiàn)(min)Wlc,Wfc：（式2.12）X,X1,：無特征結(jié)構(gòu)的溶質(zhì)（圖7.8,7.17和7.19）X2,X3XB：流動(dòng)相中的B溶劑的摩爾分?jǐn)?shù)V：折合速度，等于udp/Dm（式2.11）6：高斯曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差;等于峰底的1/4I：檢測器響應(yīng)時(shí)間常數(shù)（S）申：流動(dòng)相中B溶劑的體積分?jǐn)?shù);等于0.0制備色譜技術(shù)與操作及實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)制備色譜到底是什么？（1） 分析色譜的目的,是分析出混合物中一個(gè)（或者幾個(gè)）純物質(zhì)的含量。制備色譜的目的,是從混合物中得到純物質(zhì)。為了加快分離的時(shí)間與提高分離的效率,制備色譜的的進(jìn)樣品量很大,導(dǎo)致制備色譜柱子的分離負(fù)荷的相應(yīng)加大,也就必須加大色譜柱填料,增大制備色譜的直徑和長度,使用的相對(duì)多的流動(dòng)相。然而,當(dāng)色譜柱上樣品負(fù)載加大的時(shí)候,往往導(dǎo)致柱效急劇下降而得不到純的產(chǎn)品。制備色譜,要解決容量與柱子效果之間的矛盾,對(duì)重現(xiàn)性也要考慮。從經(jīng)濟(jì)上來說。制備色譜要爭取少用填料,少用溶劑,要盡可能多的得到產(chǎn)品。（2） 樣品的前處理：制備色譜柱子由于處理的樣品多,比分析柱子更容易受污染,所以,必要的前處理就顯得非常的必要。萃取、過濾、結(jié)晶、固相萃取等簡單的分離方法,如果用得上,而且還不是很麻煩,就要盡可能多的采用以去掉雜質(zhì)。（3） 制備色譜柱的材質(zhì)及其特點(diǎn)下面介紹一下,制備色譜柱常用的材質(zhì)及其特點(diǎn)。各種規(guī)格的玻璃柱子在實(shí)驗(yàn)室里頭很容易得到,而且價(jià)格低廉,但玻璃柱子致命的弱點(diǎn)是它能承受的壓力很小,且非常容易破碎。當(dāng)由于壓力太小而導(dǎo)致流動(dòng)相流速很慢的時(shí)候,高位液面或加高壓空氣（或者氮?dú)猓┑牟捎檬且粋€(gè)簡單的解決辦法。在底下加真空,也能在一定程度上解決這個(gè)問題。不銹鋼柱子具有良好的耐腐蝕、抗壓力性能,但其價(jià)格相對(duì)很貴。如果,只有很小的分離任務(wù)且經(jīng)費(fèi)也允許，市面上直徑為1cm的小型制備柱就是首選。有機(jī)玻璃柱子也能抗壓力耐腐蝕,相對(duì)不銹鋼柱子而言,它是半透明的,可以看到液體的運(yùn)行狀態(tài),對(duì)有色的物質(zhì)其特點(diǎn)就更為突出。（4） 固定相的選擇硅膠、鍵合固定相（如C18）、離子交換樹脂、聚酰胺、氧化鋁、凝膠等都可以作為色譜柱的填料。有不少文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)填料可以進(jìn)行一下處理提高了分離效果，如，對(duì)硅膠進(jìn)行的硝酸銀（或緩沖液）處理。（5） 裝柱方法的選擇根據(jù)固定相顆粒度和柱子的尺寸，采用不同的裝柱方法，往往裝填越好分離效果越好。裝柱效果跟填料的顆粒度關(guān)系很大，顆粒度的減少會(huì)導(dǎo)致裝柱的難度。一般來說，顆粒直徑小于20－30um的固定相采用濕法裝填。所謂“敲擊一裝填”技術(shù)適用于顆粒直徑大于25um的固定相。濕法的目的是迫使相對(duì)稀松的固定相懸漿以高速裝入色譜柱子，從而減少空隙的形成。然而，當(dāng)柱直徑大于20mm，所加壓力為30—40bar時(shí)，高壓懸漿裝填技術(shù)就變得十分復(fù)雜。為將小顆粒固定相裝入更大得制備型色譜柱,可采用柱長壓縮技術(shù)。這種方法，先將固定相懸漿（或偶爾是干填充物）裝入柱中加壓，利用物理方法將其壓緊。壓緊的方法有兩種：徑向壓縮和軸向壓縮。濕法裝柱需要一定的設(shè)備，在柱子填完后，應(yīng)用有柱效的測量，對(duì)柱效低的柱子應(yīng)該重填。（6） 流動(dòng)相的選擇除了和分析色譜同樣的考慮外，在選用流動(dòng)相時(shí)，要考慮色譜分離后面加有旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等二次分離操作。一般來說，不宜采用高毒性溶劑，對(duì)多元溶劑要盡可能的少用。如果產(chǎn)品中含有大量溶劑，溶劑的純度也要考慮在其中。（7） 加樣的方法可以采用以下方法之一進(jìn)樣?！米⑸淦鬟M(jìn)樣—用旋轉(zhuǎn)閥進(jìn)樣—通過六通閥進(jìn)樣—通過主泵進(jìn)樣—通過輔泵進(jìn)樣—固體上樣（8） 泵的選用生產(chǎn)制備色譜泵的廠商很多。根據(jù)有無脈沖、能承受的最大壓力、控制的精度、售后服務(wù)等來選擇泵。（9）檢測器的選用一般的分析池的最大允許流速僅為 5mL/min或者10mL/min。而專門的制備池的最大允許流速可為150mL/min。有時(shí)，采用旁路分離管，將少量流體導(dǎo)入分析池進(jìn)行檢測，是一個(gè)不錯(cuò)的辦法，但其濃度的誤差會(huì)相對(duì)較大。（10） 組分保留時(shí)間的估計(jì)用分析柱子在同等色譜條件下（同樣的固定相和流動(dòng)相）測定保留時(shí)間后，按照單一組分的線流速（不是體積流速）一定，通過計(jì)算可以知道組分的大致保留時(shí)間區(qū)域。分析譜圖的峰形狀，對(duì)確定保留時(shí)間也有很大的參考價(jià)值。（11） 產(chǎn)品的收集手工餾分收集費(fèi)時(shí)費(fèi)力，自動(dòng)餾分收集器有很大的方便。許多實(shí)驗(yàn)室和工廠都采用了餾分收集器。（12） 超載、邊緣切割、中心切割、放大技術(shù)與非線性效用在制備色譜中，因?yàn)闆]有必要達(dá)到分析色譜那樣的分離度，可以在一定范圍內(nèi)大大加大進(jìn)樣的濃度和體積。在做分離的時(shí)候，也有一些分析色譜的時(shí)候，不能用到的技巧。因?yàn)槠P(guān)系，不在這里敘述。（13） 柱轉(zhuǎn)換技術(shù)通過接頭或者閥門，實(shí)現(xiàn)柱子的簡單延長，或者比較方便地實(shí)現(xiàn)對(duì)其中一個(gè)（或幾個(gè)）組分的精制。（14） 比較新的制備色譜技術(shù)模擬移動(dòng)床可以連續(xù)進(jìn)樣，并可以利用邊緣切割效用，而且采用了柱切換技術(shù)，能更好的利用溶劑和填料，已經(jīng)應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。其理論和技術(shù)也日益完善。迎頭色譜、超臨界流體色譜、逆流色譜環(huán)形色譜、氣相制備色譜等在科研和工業(yè)生產(chǎn)中也得到了應(yīng)用。問:我想購買waters600用于分析和制備，對(duì)于其配備有什么好的建議。答：[vihig][davvy]可以配一個(gè)PDA,另外加一個(gè)示差折光410,另外買幾根制備柱就可以了。waters600的流速最大為20mL/min，一般可以配20mmID的制備柱，一次分離10-100mg的樣品，如果樣品量更大，可以通過配件擴(kuò)展到45mL/min，使用30mmID的制備柱。另外為了保證餾分收集的準(zhǔn)確性，最好配上FractionII餾分收集器。如果樣品數(shù)量很大，可以配2767samplemanager和ZQMS,同時(shí)做自動(dòng)進(jìn)樣并通過MS或UV信號(hào)自動(dòng)收集餾分。這樣可以過夜自動(dòng)運(yùn)行。最大通量每天可以處理100-200個(gè)樣品。問：如何用制備色譜柱制備低含量的雜質(zhì)？制備色譜柱為ZorbaxSB-C189.4*250mm及gilson餾分收集器，色譜儀為Agilent1100或LC-6A。想用其制備面積歸一化法含量為0.05%左右的雜質(zhì)，初步提純后用高分辨的LC-MS進(jìn)行定性分析。如何設(shè)定色譜條件，如流量，進(jìn)樣量，樣品的濃度，切割點(diǎn)的設(shè)置，是否要濃縮，要求將95%以上的主峰切除。（主峰后有二個(gè)雜質(zhì)靠得很近。)答：[vihig][davvy][云帆]1制備用的流動(dòng)相最好等級(jí)高一點(diǎn)，否則流動(dòng)相中的雜質(zhì)會(huì)影響LC-MS分析。2使用餾分收集器時(shí)，延遲體積一定要計(jì)算精確，檢測器的響應(yīng)時(shí)間設(shè)到最小，否則都會(huì)影響收集的純度和回收率。制備柱的流速一般與直徑的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速為ImL/min,9.4mm制備柱用1*(9.4/4.6)2,大約為4ml/min。進(jìn)樣量設(shè)到幾個(gè)mg應(yīng)該基本沒有過載。進(jìn)樣樣品濃度越高越好。假如進(jìn)樣10mg，理論計(jì)算0.05%的雜質(zhì)大約只有5ug,顯然濃度太低，最好是多做幾次，合并餾分然后濃縮后做LC-MS分析。問：我想用hplc分離一個(gè)簡單的多肽,我應(yīng)該選用什么樣的流動(dòng)相,還有他的梯度,還有選用什么樣的柱子答：[yingmw][zyh]RP-HPLC,C18柱可以制備很少量的肽。如果用RP-HPLC,首先應(yīng)該用同類型的分析柱子分析一下多肽含多少雜質(zhì)，設(shè)置緩緩的梯度的分離樣品，在根據(jù)分析柱子跑出的峰形，逐漸放大純化的方法。4問：TFA在緩沖液中是不是只起到調(diào)節(jié)pH的作用呢？TFA的濃度越高基線的漂移越厲害，那是不是說它的濃度在緩沖液pH允許的情況下越低越好呢？答：[zyh][skywalker]TFA起到類似離子對(duì)的作用，一般濃度在0.05-0.1%，過高的濃度，會(huì)使溶液偏酸，長時(shí)間使用可能影響柱子壽命。同時(shí)TFA可以抑制硅膠表面硅醇基，改善堿性化合物的峰型。有時(shí)0.1%TFA分離不好的話?？梢钥紤]加大濃度到0.2%。但要注意用完后及時(shí)沖洗色譜柱。走梯度時(shí)，因?yàn)樽叱苫€漂移，但對(duì)制備的影響不大。問：樣品如果溶解度太低如何上制備HPLC？答：[aaron][云帆][skywalker][natura]了解一下樣品的性質(zhì)，根據(jù)其酸堿性，極性等性質(zhì)，通過調(diào)節(jié)溶劑的pH值等，以達(dá)到較好的溶解度樣品可能某種晶型難溶，這樣可以加入其他溶劑(如丙酮等)以助溶。不是一定要用流動(dòng)相來溶解樣品，對(duì)溶解度差的樣品，可以選擇甲醇，THF或DMSO等溶解樣品。特別是DMSO,對(duì)一般的化合物溶解度都很好。并且在反相柱上不保留，不會(huì)造成干擾。而且DMSO的洗脫能力很弱，一般不會(huì)影響峰型?？梢怨腆w上樣。問：多肽的分離制備,如何上量？如何增大分離度?答：[xia][888wym]反相HPLC應(yīng)當(dāng)是很好的分離小肽方法，用CH3CN或CH3OH：H2O(95：5)做流動(dòng)相，看保留如何，若無保留，建議改用其他色譜方法進(jìn)行分離。關(guān)于多肽的分離，首先要知道它的分子量大小，然后選擇不同類型的填料，如孔徑的大小。我們先在分析柱(4.6MM內(nèi)徑)上做一下實(shí)驗(yàn)，找到最大的分離度，這一過程的難度是最大的，要不斷地改變流動(dòng)相和固定相,然后再線性或非線性放大到制備,放大的倍數(shù)按分析柱的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。分離后可以通過冷凍干燥得到固體。還可以考慮離子交換來分l離7問：做柱層析時(shí)(國產(chǎn)大孔吸附樹脂)，怎么才能把洗脫液中的樹脂殘留物處理干凈？答：[supu][richies][郭峰]大孔吸附樹脂在上使用前，一般需要進(jìn)行處理，方法包括用色譜純的甲醇或乙睛洗到?jīng)]有吸收；或樹脂用乙醇浸泡2天，丙酮浸泡2天，然后用常規(guī)的酸，堿洗。再用丙酮回流二小時(shí)就可以用了。問：由分析型液相轉(zhuǎn)為制備型液相，其色譜系統(tǒng)需作多大調(diào)整？是否可以按照柱體積折算只改變流速？其上樣量多大為宜？答：[zqingyi][clitonzhou]泵要換，流量要加大，壓力可不變或減少；流通池要換體積更大的。（2）整個(gè)系統(tǒng)的管路要更換更粗的，否則壓力太大,而且特別容易發(fā)生堵塞。對(duì)流通池后的管路，最好增加反壓調(diào)節(jié)器，否則管路太短的話，反壓小會(huì)導(dǎo)致流通池氣泡，管路長的話會(huì)導(dǎo)致峰展寬。（3）檢測器的響應(yīng)時(shí)間和峰寬要設(shè)置合適，否則會(huì)導(dǎo)致收集時(shí)延遲體積的計(jì)算不準(zhǔn)（4）上樣量主要根據(jù)柱子的大小、樣品的濃度、制備是否根據(jù)分析條件放大（例如制備柱是否還用分析用填料）；一般上樣量與柱子直徑的平方以及長度成正比。問：流動(dòng)相中含有鹽時(shí)，收集液該如何除鹽？選用揮發(fā)性酸，堿或鹽（如醋酸銨）是否會(huì)在揮干溶劑或凍干過程中直接除去？答：[半透膜][zqingyi]一般可以采用離子吸附的辦法去掉（可以參考離子吸附有關(guān)技術(shù)）。但也是稍微麻煩的事情，最好，不加加酸堿鹽，如果要加的話最好，要加揮發(fā)性的或者對(duì)產(chǎn)品或者檢測沒有干擾的?？捎肎25脫鹽，它是安馬西亞出的一種葡聚糖凝膠。交聯(lián)度大孔徑小,對(duì)小分子的無機(jī)鹽保留較大,而對(duì)分子量較大的有機(jī)物沒有保留從而可以將鹽份脫除。另外采用揮發(fā)性的酸，堿時(shí)，一般會(huì)在干燥過程中直接除去，但如果樣品也有酸堿性，可能會(huì)與這些揮發(fā)性酸堿形成一定比例的鹽。問：制備型柱子柱壓上升柱效下降怎么辦？答：[songlankun][yaozhaobing][hqwd][wu_pass]對(duì)高價(jià)值的制備柱來講，延長柱子壽命是很重要的。一般要注意保護(hù)柱子，一般來說，制備柱子一般需要保護(hù)柱配套。下面是可能堵塞柱子的原因（1） 如果您所分離的樣品中雜質(zhì)較多而您在上樣前沒有經(jīng)過過濾（0.45微米），一些顆粒性雜質(zhì)會(huì)積聚在柱頭造成柱壓升高，（2） 也有可能是因?yàn)槟褂玫牧鲃?dòng)向中含有緩沖鹽的原因，結(jié)晶或發(fā)生化學(xué)變化而堵塞。可以把柱子沖一沖。（3） 流動(dòng)相是否符合液相色譜的要求？是否過濾處理？。柱子再生處理辦法如下：（1）依次用水，甲醇，四氫呋喃，氯仿，甲醇來沖洗柱子，每種溶劑5-10個(gè)柱體積。（2）如果效果不明顯，將柱子按以上順序反沖，一般將大大降低柱子效果，不到不要沒有辦法才采用。（3）如果效果還是不好，就需要打開色譜柱，超聲波清洗篩片（這樣也會(huì)使柱子效果下降）。必要時(shí)挖掉色譜柱內(nèi)受污染部位，填入新的填料，還可用3個(gè)月。（填的時(shí)候小心，別重新污染柱子）問：制備柱柱跑干了影響柱效嗎?答：[胖丁丁][enzyme110][閑云]如果時(shí)間不長的話,可以用流動(dòng)相多沖幾個(gè)小時(shí).柱效不一定變化很大.如果時(shí)間太久,柱效一定變低.具體造成影響有多大，要靠柱效測定來確定，而不是干柱時(shí)間的長短。如果跑干了，對(duì)于PUMP的影響可能還大些，所以最好先把管路中的空氣抽走再說。一般說來，制備柱子跑干，屬于操作失當(dāng)。柱子閑置不用時(shí)，最好沖入甲醇或其他有機(jī)溶劑，一定要把兩頭堵住密封，這樣保留的時(shí)間會(huì)較長。12問：分析HPLC如何放大到制備型HPLC答：[clitonzhou][frankgao]在分析液相中色譜柱的典型進(jìn)樣量是微克級(jí)，甚至更低。樣品量和固定相之比有的甚至小于1:10000。進(jìn)樣體積一般來說都大大小于色譜柱體積（小于1:100）。在這種條件下，會(huì)達(dá)到很好的分離效果，峰形尖銳并且很對(duì)稱。分析系統(tǒng)線形放大到制備型HPLC意味著使用直徑更大的制備柱、更高的流速和根據(jù)色譜柱的長度增加進(jìn)樣量并保持樣品濃度不變。峰形仍會(huì)保持尖銳而對(duì)稱。這種方法需要大型的色譜柱和大量的溶劑來分離較少的樣品，但這種方法從經(jīng)濟(jì)上一般不合適。在制備液相中，最大的區(qū)別就是超量進(jìn)樣。制備的分離峰形一般不可能仍會(huì)保持尖銳而對(duì)稱，分析和制備是不同的概念。制備的首要概念是在達(dá)到純化的基礎(chǔ)上，降低成本，加快時(shí)間（提高效率）。一般說來，純化的成本要高于生產(chǎn)粗產(chǎn)品的成本，所以，可以加大上樣量，甚至過載，出現(xiàn)平頭峰，而收集只集中在峰的一小部分，以來保證純度，主要為了節(jié)省流動(dòng)相和提高設(shè)備利用率。13問：制備純化蛋白、多肽，耗用流動(dòng)相驚人，請問這些用過的流動(dòng)相（乙腈，甲醇）可以重蒸使用嗎？答：[sya][zwc][haode0864][jianjun_he]流動(dòng)相用一般減壓方法重蒸后，往往會(huì)形成有機(jī)溶劑和水會(huì)共沸，另外，由于減壓蒸餾屬于單次平衡，往往得不到100%純度的溶劑，這會(huì)使溶劑的配置有一定困難，從而使色譜的重現(xiàn)性和分離度會(huì)發(fā)生一定的變化。如果要求不是很高的話，一般可以分析重蒸后餾分中的各組分含量，計(jì)算后再使用。要通過重蒸得到純物質(zhì)是極其困難的，必須采用精餾塔多級(jí)蒸發(fā)，單就設(shè)備投資和能耗來講，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模或生產(chǎn)規(guī)模的廢液回收處理已經(jīng)是得不償失。其實(shí)，我們沒有必要得到純的物質(zhì)。14問：反相色譜分離純化后，怎樣除去流動(dòng)相產(chǎn)品中的TFA和乙腈或其他雜質(zhì)？答：[jianjun_he]TFA是反相色譜分離中常用的添加劑?？梢杂脙龈傻霓k法去除，國外許多文獻(xiàn)是這樣報(bào)道的。還可以試試離子交換、凝膠層析、甚至透析和超濾，其中，離子交換層析效果比較好，還可以起到濃縮樣品的作用。首先，凍干的辦法應(yīng)該可以幾乎徹底地除去TFA和乙腈，藥物實(shí)驗(yàn)前最好先檢測一下凍干品中的殘留量，只要不超過允許范圍，這種辦法是最最簡單、有效的。其次，如果你的藥物的分裝量不大的話（＜100ug），建議你用離子交換層析，最好裝一個(gè)小