生物選修三第一章基因工程的原理和技術(shù)

生物選修三第一章基因工程的原理和技術(shù)第1頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一基因工程的基本操作步驟：1、獲得目的基因2、形成重組DNA分子3、將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞4、篩選含有目的基因的受體細(xì)胞5、目的基因的表達(dá)第2頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子2、獲取目的基因的方法（1）、從基因文庫中獲取目的基因。（2）、化學(xué)合成例:利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因----適用于目的基因的序列為未知的----適用于目的基因的序列為不是很大且已知的第3頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一獲取目的基因的方法1）鳥槍法：供體細(xì)胞中的DNA許多DNA片段運(yùn)載體限制酶載入受體細(xì)胞產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入外源DNA擴(kuò)增目的基因分離受體細(xì)胞(直接分離法)第4頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一2）反轉(zhuǎn)錄法：

目的基因的mRNA單鏈DNA雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成(人工合成法)獲取目的基因的方法第5頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一3）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成(人工合成法)獲取目的基因的方法第6頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一總結(jié):如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。

如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。第7頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子2、獲取目的基因的方法（1）、從基因文庫中獲取目的基因。（2）、化學(xué)合成例:利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因----適用于目的基因的序列為未知的----適用于目的基因的序列為不是很大且已知的第8頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一

KaryB.MullisPCR是由美國科學(xué)家穆利斯提出的一種體外簡化條件下模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的DNA快速擴(kuò)增的方法，此技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。第9頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________、___________.前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制模板(已知基因的核苷酸序列)四種脫氧核苷酸一對(duì)引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增必須對(duì)目的基因有一定的了解，需要設(shè)計(jì)引物第10頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一⑥過程：a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第11頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一PCR原理第12頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一PCR原理１變性第13頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一PCR原理１退火第14頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一PCR原理１延伸第15頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一PCR原理２變性第16頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一PCR原理２退火第17頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一PCR原理２延伸第18頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一PCR原理３變性第19頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一PCR原理３復(fù)性第20頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一PCR原理３延伸第21頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一

PCR反應(yīng)曲線第22頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一

PCR反應(yīng)曲線

理論上，PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)增長，但這種增長形式在擴(kuò)增25-30個(gè)循環(huán)以后便放慢直至停止，達(dá)到反應(yīng)平臺(tái)。此時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長。第23頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一人工合成：若基因_____，核苷酸序列又

______，則可用此法。較小已知第24頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一①用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。②用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。2、形成重組DNA分子③將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同第25頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一表達(dá)載體應(yīng)包括：啟動(dòng)子目的基因終止子標(biāo)記基因轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的終點(diǎn)第26頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一3、將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞方法將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞基因工程的受體細(xì)胞有哪些？如何選擇？如何導(dǎo)入？第27頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一3.不同受體細(xì)胞導(dǎo)入的方法不同：（1）植物細(xì)胞：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法基因槍第28頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。第29頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應(yīng)用。

第30頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一基因槍法：將直徑4um的鎢粉或金粉在供體DNA中浸泡，然后用基因槍將這些粒子打入細(xì)胞、組織或器官中，具有一次處理多個(gè)細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，但轉(zhuǎn)化效率較低，另外這種方法也用于基因治療和抗體制備，并已取得初步成效。這一方法是依靠一種基因槍來幫助導(dǎo)入外源基因?；驑尭鶕?jù)動(dòng)力系統(tǒng)可分為火藥引爆、高壓放電和壓縮氣體驅(qū)動(dòng)三類。其基本原理是通過動(dòng)力系統(tǒng)將帶有基因的金屬顆粒（金?；蜴u粒），將DNA吸附在表面，以一定的速度射進(jìn)植物細(xì)胞，由于小顆粒穿透力強(qiáng)，故不需除去細(xì)胞壁和細(xì)胞膜而進(jìn)入基因組，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的目的。它具有應(yīng)用面廣，方法簡單，轉(zhuǎn)化時(shí)間短，轉(zhuǎn)化頻率高，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于農(nóng)桿菌不能感染的植物，采用該方法可打破載體法的局限?；驑尩霓D(zhuǎn)化頻率與受體種類、微彈大小、轟擊壓力、制止盤與金顆粒的距離、受體預(yù)處理、受體轟擊后培養(yǎng)有直接關(guān)系。

第31頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一花粉管通道法:在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，并進(jìn)一步地被整合到受體細(xì)胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個(gè)體。該方法于80年代初期由我國學(xué)者周光宇提出，我國目前推廣面積最大的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來的。該法的最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡單，不需要裝備精良的實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)育種工作者易于掌握。第32頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一（2）動(dòng)物細(xì)胞：顯微注射法在顯微鏡下，用一根極細(xì)的玻璃針(直徑1～2微米)直接將DNA注射到胚胎的細(xì)胞核內(nèi)，再把注射過DNA的胚胎移植到動(dòng)物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常的幼仔，使用這種方法進(jìn)行外源基因整合成功率約為10％第33頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一顯微注射法:

動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)。在顯微鏡下，用一根極細(xì)的玻璃針(直徑1～2微米)直接將DNA注射到胚胎的細(xì)胞核內(nèi)，再把注射過DNA的胚胎移植到動(dòng)物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常的幼仔，使用這種方法進(jìn)行外源基因整合成功率約為10％第34頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一（3）以大腸桿菌為受體細(xì)胞：將細(xì)菌用CaCl2處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌經(jīng)Ca離子處理后可攝取外源DNA,處于這種狀態(tài)的細(xì)胞即感受態(tài)細(xì)胞常以微生物作為受體細(xì)胞的原因：

繁殖快、結(jié)構(gòu)簡單第35頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌經(jīng)Ca離子處理后可攝取外源DNA,處于這種狀態(tài)的細(xì)胞即感受態(tài)細(xì)胞（competentcells）。感受態(tài)細(xì)胞的用途光泛，可應(yīng)用于基因重組、基因建庫、基因克隆等領(lǐng)域。?；a(chǎn)的感受態(tài)細(xì)胞是采用大腸桿菌經(jīng)特殊工藝處理得到的，可用于DNA的化學(xué)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到108-109cfu/μg質(zhì)粒，不僅可以轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，而且非常適合于轉(zhuǎn)化普通的連接產(chǎn)物，特別適合于平端連接等需要高轉(zhuǎn)化效率的轉(zhuǎn)化要求。第36頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一通過標(biāo)記基因，進(jìn)行篩選和檢測導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少。4、篩選含有目的基因的受體細(xì)胞怎樣進(jìn)行檢測？舉例說明第37頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一檢測—①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)鑒定——抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交抗原抗體雜交5、目的基因的檢測和表達(dá)個(gè)體水平的檢測：

性狀的表達(dá)分子水平的檢測：第38頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一核酸分子雜交技術(shù)：

具一定同源性的兩條(DNA或RNA)單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下,可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則特異性地復(fù)性，形成雙鏈探針(序列已知，單鏈)待測核苷酸序列(單鏈)第39頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一變性復(fù)性DNA-DNA雜交雙鏈分子關(guān)鍵步驟：變性—雜交（復(fù)性）--檢測信號(hào)—結(jié)論

信號(hào)的采集與處理結(jié)論第40頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一DNA分子雜交示意圖兩種生物的DNA單鏈之間互補(bǔ)程度越高，通過分子雜交形成雙螺旋片段的程度也就越高，二者的親緣關(guān)系就越近；反之，親緣關(guān)系就越遠(yuǎn)。所以，可以通過DNA分子雜交技術(shù)來鑒定物種之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

。第41頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一檢測—①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)鑒定——抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交抗原抗體雜交5、目的基因的檢測和表達(dá)個(gè)體水平的檢測：

性狀的表達(dá)分子水平的檢測：第42頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。通過基因工程得到抗蟲棉，怎樣證明抗蟲基因已經(jīng)在棉花細(xì)胞中表達(dá)？第43頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一總結(jié)：基因工程的操作流程及要點(diǎn)第44頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一篩選含有目的基因的受體細(xì)胞四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因某研究所的研究人員將生長激素基因通過質(zhì)料介導(dǎo)進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，以表達(dá)產(chǎn)生生長激素。已知質(zhì)粒中存在兩個(gè)抗性基因，如圖所示。目的基因不插入到氨芐青霉素抗性基因中，而大腸桿菌不帶有任何抗性基因。如何篩選含有生長激素基因的大腸桿菌？第45頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一第46頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一1為了培育節(jié)水高產(chǎn)品種，科學(xué)家將大麥中與抗旱節(jié)水有關(guān)的基因?qū)胄←?，得到轉(zhuǎn)基因小麥，其水分利用率提高了20%。這項(xiàng)技術(shù)的遺傳學(xué)原理是A．基因重組B．基因突變C．基因復(fù)制D．基因分離鞏固練習(xí)【答案：A】第47頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一2利用蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因培育的抗蟲棉是否成功，最好檢測A．是否有抗生素產(chǎn)生B．是否