生物科學細胞生物學實驗課

生物科學細胞生物學實驗課第1頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一課程要求實驗室規(guī)則（服裝整潔、秩序井然、前后清點、節(jié)約與賠償、清潔衛(wèi)生）實驗報告（實驗報告及時完成，有所思考）繪圖要求（鉛筆、清晰、突出典型特征、不抄繪、引線、注字及放大倍數(shù)）第2頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一實驗內(nèi)容實驗一普通顯微鏡及特殊顯微鏡的使用實驗二

細胞膜的通透性觀察實驗三死活細胞的鑒別實驗四人微量外周血淋巴細胞培養(yǎng)實驗五

人染色體標本的制備實驗六人染色體分帶技術(shù)——G帶第3頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一實驗目的實驗原理試劑與器材實驗步驟注意事項作業(yè)與思考實驗一普通顯微鏡及特殊顯微鏡的使用第4頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一一.實驗目的了解生物顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和倒置顯微鏡的構(gòu)造原理，并掌握其使用方法。熟悉光鏡下細胞的基本形態(tài)與結(jié)構(gòu)。掌握顯微鏡暗視野的簡易制作。第5頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一二.實驗原理顯微鏡的工作原理成像原理照明原理主要性能參數(shù)第6頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一顯微鏡成像原理顯微鏡的工作原理第7頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一暗視野顯微鏡以丁達爾現(xiàn)象為原理。

特點：利用拋物型聚光器進行斜射照明顯微鏡的工作原理第8頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一顯微鏡照明原理顯微鏡的工作原理臨界照明科勒照明第9頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一正置顯微鏡倒置顯微鏡倒置熒光顯微鏡三目暗視野顯微鏡第10頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一倒置激光共聚焦顯微鏡第11頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一顯微鏡主要性能參數(shù)分辨率（分辨力）指在25cm的明視距離處能區(qū)分開被檢物體上兩個相近質(zhì)點間的最小距離。放大率與有效放大倍數(shù)放大率/放大倍數(shù)(M)=目鏡放大倍數(shù)(Mob)×物鏡放大倍數(shù)(Moc)有效放大倍數(shù)：物鏡數(shù)值孔徑的500-1000倍。清晰度

指顯微鏡形成輪廓明顯的物象的能力。焦點深度

當顯微鏡對標本的某一點或平面聚焦時，焦點平面上下物象清晰的距離或深度。第12頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一三.試劑與器材

材料：柿胞間連絲裝片、動物細胞分裂裝片和浮游生物等。試劑：香柏油、二甲苯等器材：生物顯微鏡、暗視野顯微鏡、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、載玻片、蓋玻片等。第13頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一四、實驗內(nèi)容普通生物顯微鏡的構(gòu)造及使用方法。觀察標本，熟悉細胞的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)。暗視野顯微鏡的簡易制作及浮游生物的觀察。第14頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一三.實驗步驟顯微鏡的構(gòu)造及使用暗視野顯微鏡的制作及使用第15頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一亮度調(diào)節(jié)開關(guān)鏡筒目鏡目鏡鏡臂物鏡載物臺物鏡轉(zhuǎn)換器聚光鏡底座調(diào)焦器聚光鏡升降輪顯微鏡的構(gòu)造頭部固定螺釘?shù)?6頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一顯微鏡的使用柿細胞胞間連絲動物細胞有絲分裂過程第17頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一注意事項任何旋鈕轉(zhuǎn)動有困難時，絕不能用力過大，而應查明原因，排除障礙。如果自己不能解決時，要向老師說明，幫助解決。保持顯微鏡的清潔，盡量避免灰塵落到鏡頭上；盡量避免試劑或溶液沾污或滴到顯微鏡上。顯微鏡用過后，應用清潔棉布輕輕擦拭；鏡頭有灰塵，必須用擦鏡紙擦。每次實驗結(jié)束，把顯微鏡以拿出時的樣子放回到鏡盒里（即轉(zhuǎn)動物鏡頭，使之“八”字形向外；降低鏡筒至底部）。制作暗視野紙片空隙大小適中才能取得較好的觀察效果。注意根據(jù)動物細胞有絲分裂特征來辨別細胞分裂的各個時相。第18頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一作業(yè)思考繪出你所觀察到的柿胞間連絲、動物細胞有絲分裂及暗視野下浮游生物圖片。為什么在觀察動物細胞有絲分裂標本時，同一標本中會出現(xiàn)細胞分裂的不同時相？在制作暗視野時，應注意哪些關(guān)鍵環(huán)節(jié)？第19頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一End，ThankS！第20頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一實驗二細胞膜的通透性觀察實驗目的實驗原理試劑與儀器實驗內(nèi)容注意事項作業(yè)與思考第21頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一一.實驗目的觀察細胞膜的通透性。了解溶血現(xiàn)象及其發(fā)生機制。掌握普通光學顯微鏡下細胞及細胞碎片的形態(tài)。第22頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一細胞膜是細胞與環(huán)境進行物質(zhì)交換的選擇通透性屏障。溶血現(xiàn)象：將紅細胞放在低滲鹽溶液中，水分子大量滲到細胞內(nèi)，可使細胞脹破，血紅蛋白釋放到介質(zhì)中，由不透明的紅細胞懸液變?yōu)榧t色透明的血紅蛋白溶液的現(xiàn)象。將紅細胞放在某些等滲鹽溶液中，由于紅細胞膜對各種溶質(zhì)的通透性不同，膜兩側(cè)的滲透壓平衡會發(fā)生改變，也會發(fā)生溶血現(xiàn)象。因此，發(fā)生溶血現(xiàn)象所需時間長短可作為測量物質(zhì)進入紅細胞速度的一種指標。二.實驗原理第23頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一三.試劑和儀器材料：雞血細胞器材：普通顯微鏡、試管、試管架、滴管、載玻片、蓋玻片、擦鏡紙、記號筆等。試劑：0.17mol/LNaCl、0.17mol/LNH4Cl、0.17mol/L醋酸銨、0.17mol/L硝酸銨、0.12mol/L草酸銨、0.12mol/LNaSO4溶液、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、

0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮、蒸餾水。第24頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一雞紅細胞懸液的制備。低滲溶血的觀察。顯微鏡檢查細胞的完整性。四.實驗內(nèi)容第25頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一五.注意事項膠頭滴管不可混用，以免造成溶液間的交叉污染。試管中有紅細胞和測試溶液時，不應強力搖晃，以免造成人為的紅細胞破裂。注意組實驗過程的同步性，尤其滴加血液的操作要迅速。第26頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一六.作業(yè)與思考記錄各種溶液所發(fā)生的溶血現(xiàn)象及溶血時間。比較并分析各種溶液發(fā)生溶血現(xiàn)象的原理。為什么同一種溶液，有的同學會得出不同的結(jié)論？思考溶血實驗在研究中應用的可能性。試管編號所加試劑是否溶血溶血時間結(jié)果分析第27頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一End，ThankS！第28頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一溶血實驗在研究中的應用1.溶血空斑實驗

溶血空斑實驗是體外檢測單個抗體形成細胞（B淋巴細胞）的一種方法，即將經(jīng)綿羊紅細胞（SRBC）免疫過的家兔淋巴結(jié)或小鼠脾臟制成細胞懸液，與一定量的SRBC結(jié)合，于37℃作用下，免疫活性淋巴細胞能釋放出溶血素，在補體的參與下，使抗體形成細胞周圍的SRBC溶解，從而在每一個抗體形成細胞周圍，形成肉眼可見的溶血空斑。每個空斑表示一個抗體形成細胞，空斑大小表示抗體生成細胞產(chǎn)生抗體的多少。由于溶血空斑實驗具有特異性高，篩選力強，可直接觀察等優(yōu)點，故可用做判定免疫功能的指標，觀察免疫應答的動力學變化，并可進行抗體種類及亞類的研究。

2.有時在提紅細胞膜蛋白時要用到，先用低滲溶液讓紅細胞脹破，高速離心收集、純化膜蛋白。第29頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一實驗三死活細胞的鑒別實驗目的實驗原理

材料、試劑與器材

方法與步驟注意事項

作業(yè)與思考第30頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一一實驗目的學習并掌握死活細胞鑒別的原理及方法。第31頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一二實驗原理死活細胞的鑒別方法：質(zhì)壁分離法

、染色法和儀器分析法染色法（化學染色和熒光染色）其原理是：許多酸性染料不容易穿過活細胞的質(zhì)膜進入胞內(nèi)，卻能滲入死亡的細胞內(nèi)，使其著色，以此來鑒別死活細胞。臺盼藍染色法、甲基藍染色、伊紅Y。微電極技術(shù)（利用死活細胞膜兩側(cè)電位的差異）、全自動分析細胞記數(shù)儀和流式細胞儀。儀器分析法中性紅染色、美藍染色、熒光素雙醋酸酯染色、二丙酸脂熒光素染色、

Hoechst、碘化丙啶（PI）。其原理是：許多堿性染料能夠滲入到活細胞內(nèi)，由于活細胞的代謝作用而是其顯色。死細胞染色活細胞染色死活細胞鑒定原理依據(jù)死活細胞在生理機能和性質(zhì)上的差異不同。第32頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一圖1.血球計數(shù)板示意圖A：血球計數(shù)板正面；B：血球計數(shù)板側(cè)面1.血球計數(shù)板；2.蓋玻片；3.計數(shù)室圖2.血球計數(shù)板1mm25個中格：1mL培養(yǎng)液中細胞數(shù)=N/5x25x10000x稀釋倍數(shù)16個中格：1mL培養(yǎng)液中細胞數(shù)=N/4x16x10000x稀釋倍數(shù)第33頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一材料：血細胞試劑：0.4％臺盼藍溶液（生理鹽水配制）、PBS。器材：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、滴管等。三材料、試劑與器材第34頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一四方法與步驟血細胞懸液的制備取一定量的新鮮血液加入20等份的PBS。染色制片取0.5ml細胞懸液放入干凈試管中，加入1-2滴臺盼藍染液，混合，2min后制成臨時裝片，鏡檢。3.細胞存活率的計算

細胞存活率=（細胞總數(shù)-死細胞數(shù)）/細胞總數(shù)×100%第35頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一五注意事項計數(shù)時應多選擇幾個視野，以多個視野內(nèi)的平均值作為細胞的存活率。以臺盼藍排除法在顯微鏡下計數(shù)死活細胞數(shù)目需注意染色時間。第36頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一六作業(yè)與思考計數(shù)死活細胞數(shù)，計算出細胞存活率。討論細胞存活率在研究中的應用和意義。第37頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一①中性紅染色：常用染料之一，是細胞器的專有染料。利用細胞膜的通透性差異，用來染原生動物和顯示動植物組織中活細胞的內(nèi)含物等。中性紅無毒，常做活體染色的染料。②臺盼藍染色：當細胞損傷或死亡時，臺盼藍可穿透變性的細胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色。而活細胞能阻止染料進入細胞內(nèi)。故可以鑒別死細胞與活細胞。嚴格來說，臺盼藍染色檢測的是細胞膜的完整性，通常認為細胞膜喪失完整性，即可認為細胞已經(jīng)死亡。通過顯微鏡很容易就能識別出死亡的被臺盼藍染色的細胞，并可使用細胞計數(shù)器進行計數(shù)。③美藍染色法：美藍是一種無毒性染料，它的氧化型是藍色的，而還原型是無色的，用它來對活細胞進行染色，由于細胞中新陳代謝的作用，使細胞內(nèi)具有較強的還原能力，能使美藍從藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，所以活細胞無色，而對于死細胞或代謝緩慢的老細胞，則因它們無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍染成藍色或淡藍色。因此，用美藍水浸片不僅可觀察酵母的形態(tài)，還可以區(qū)分死、活細胞.④甲基藍染色法：甲基藍染色與臺盼藍類似的染色機理。第38頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一每個血球計數(shù)板上有兩個計數(shù)室（圖1）。血球計數(shù)板上的符號和數(shù)字（圖1）的含義是：XB-K-25為計數(shù)板的型號和規(guī)格，表示此計數(shù)板中計數(shù)室分25個中格；0.1mm為蓋上蓋玻片后計數(shù)室的高；1/400mm2表示計數(shù)室面積是1mm2（計數(shù)室邊長1mm），分400個小格，每小格面積是1/400mm2（圖2），9個大方格中只有中間的有小方格的中央大方格才是計數(shù)室。不要認為9個大方格都是計數(shù)室。

計數(shù)室通常也有兩種規(guī)格：一種是16x25型，即大方格內(nèi)分為16中格，每一中格又分為25小格（圖2）；另一種是25x16型，即大方格內(nèi)分為25中格，每一中格又分為16小格。但是不管計數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同的特點，即每一大方格都是由16x25=25x16=400個小方格組成。

計數(shù)時，若計數(shù)室是由16個中方格組成，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個中方格（即100個小方格）的菌數(shù)。如果是由25個中方格組成的計數(shù)室，除數(shù)上述4個中方格外，還需數(shù)中央1個中方格（即80個小格方）的菌數(shù)（圖3）。計數(shù)時對壓在中格四條線上的細胞只計數(shù)相鄰兩邊及其夾角上的細胞（一般選左邊和上邊的線）。

第39頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一死活細胞的鑒定在生物學和醫(yī)學上具有很重要的意義。細胞培養(yǎng)過程中要隨時記錄細胞的生長情況，需要經(jīng)常測定細胞的存活率；在腫瘤細胞的研究中，為了檢驗各種藥物對腫瘤細胞的殺傷力，也需要測定腫瘤細胞的存活率。在臨床醫(yī)學中死活細胞的鑒定也有很大的應用，例如為了檢測某一男子的生育能力，測定精子細胞的存活力是比較常用的辦法。第40頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一實驗四人微量外周血淋巴細胞培養(yǎng)實驗目的實驗原理

試劑與器材

操作方法

注意事項

作業(yè)與思考第41頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一一實驗目的掌握無菌培養(yǎng)技術(shù)。熟悉人外周血淋巴細胞培養(yǎng)過程。并掌握人外周血淋巴細胞培養(yǎng)培養(yǎng)方法。第42頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一二實驗原理在活體情況下，進入外周血的小淋巴細胞不能進行增殖，存活一定時間即死亡。在人工培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基中的PHA有刺激小淋巴細胞轉(zhuǎn)化并進行分裂的能力，此時如加入秋水仙素，可使許多細胞停滯于分裂中期。采用常規(guī)制片技術(shù)，即可獲得大量含染色體的標本。第43頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一三試劑與器材

材料：人指血。試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、肝素、PHA、

雙抗、PBS，2μg/ml的秋水仙素、酒精等。器材：超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、注射器、燒杯、

量筒、細胞培養(yǎng)瓶、酒精燈等。第44頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一四實驗內(nèi)容采樣接種

在無菌條件下，用采血針刺破無名指，采血4~5滴，接種至培養(yǎng)瓶，塞緊瓶塞后輕搖均勻，盡量避免與瓶蓋接觸。采血后，用膠布密封瓶口并作好標記。第45頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一四、實驗內(nèi)容培養(yǎng)將標記好的培養(yǎng)瓶置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，每隔12小時左右輕遙1次，以促進細胞生長增殖。第46頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一四實驗內(nèi)容加秋水仙素終止培養(yǎng)前6小時以注射器向培養(yǎng)瓶中加入秋水仙素3-4滴，使其終濃度為0.01-0.02μg/ml，振蕩混勻后于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6小時。第47頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一五注意事項嚴格注意采血過程的無菌操作。采血時，采血針不可混用。采血后，各自的培養(yǎng)瓶應做好標記。第48頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一六作業(yè)與思考簡述人外周血淋巴細胞的培養(yǎng)過程。肝素和PHA在人外周血淋巴細胞培養(yǎng)中的作用是什么？影響人外周血淋巴細胞培養(yǎng)的主要因素有哪些？如何控制？第49頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一End，ThankS！第50頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一RPMI1640

培養(yǎng)基中由多種氨基酸、維生素、生物素、無機鹽等按不同比例配置而成，再加入酚紅作指示劑是細胞體外培養(yǎng)的必要營養(yǎng)素。10.4gRPMI1640干粉溶于900ml三蒸水中，磁力攪拌2h，充分溶解，用NaHCO3調(diào)pH=7.2，然后定容至1000ml，無菌室內(nèi)抽濾滅菌、分裝，4℃保存，長時間存放英防御-20℃.抗凝劑抗凝劑常采用肝素，肝素鈉。肝素：一種多糖，能阻止白細胞和淋巴細胞與紅細胞集結(jié)在一起而影響培養(yǎng)的質(zhì)量，但肝素濃度過大會導致溶血。一般劑量是100單位肝素液可抗凝5ml外周血液。肝素鈉為粉劑，每毫克130單位。第51頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一植物凝集素：PHA

從豆子中提取出來的，其化學成分為糖蛋白，具有刺激淋巴細胞進行有絲分裂的作用。用量不足影響分裂細胞的數(shù)量；用量過高則使培養(yǎng)的外周血凝集而影響淋巴細胞生長。秋水仙素

是從地中海的一種名叫秋水仙的鱗莖中提取的一種植物堿，他的作用是：

（1）抑制細胞紡錘死的形成，使細胞分裂停止在中期，從而起到積累大量中期細胞的作用。

（2）是染色體單體縮短分開，呈現(xiàn)明顯的外形。秋水仙素的使用濃度范圍比較寬，可差幾十倍之多，一般終濃度為1.2-1.5微克/毫升。處理4-6小時。秋水仙素作用時間越長，被阻止的中期細胞越多，但染色體也會收縮，收縮過度會影響形態(tài)。

第52頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一實驗五人染色體標本的制備實驗目的實驗原理

試劑與器材

操作方法

注意事項

作業(yè)與思考第53頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一一實驗目的了解染色體制備原理。掌握染色體制備方法。第54頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一二實驗原理被秋水仙素處理后停滯于中期的大量分裂細胞，用低滲液處理使樣品中的紅細胞膜破裂，并使分裂細胞和轉(zhuǎn)化的淋巴母細胞膨脹，結(jié)合離心技術(shù)，即可去掉紅細胞碎片。再用固定液使已膨脹的分裂細胞和轉(zhuǎn)化的淋巴細胞膜破裂，隨著分裂細胞膜破裂，染色體被釋放出來，并且將其形態(tài)固定下來，然后制片即可得到滿意的染色體標本。第55頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一三試劑與器材材料

終止培養(yǎng)前6小時加入秋水仙素的人外周血淋巴細胞。試劑

低滲液（0.075%KCl溶液）、

固定液（甲醇：冰醋酸=3：1，現(xiàn)用現(xiàn)配）等。器材

離心機、離心管、倒置顯微鏡、水浴鍋、天平、酒精燈、載玻片和蓋玻片等。第56頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一四操作方法收集細胞取出培養(yǎng)瓶，上下顛倒均勻，將細胞移至離心管內(nèi)，1000r/min離心8min收集細胞，棄上清。低滲處理

加入已經(jīng)預熱的低滲液6-8ml，吹打成細胞懸液，37℃水浴中低滲20min。固定

①預固定；②固定；③再固定。制片

預冷的玻片，立即吹干。染色1:10Giemsa染液染色10min，流水沖洗，晾干。鏡檢，拍照。第57頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一五注意事項從培養(yǎng)箱中取培養(yǎng)瓶時，注意觀察培養(yǎng)液顏色，根據(jù)顏色變化判斷細胞有無污染。用吸管吸棄上清液時，勿用力過猛導致部分細胞丟失。固定液需現(xiàn)用現(xiàn)配。載玻片需干凈且保持濕冷狀態(tài)。第58頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一六作業(yè)與思考簡述人外周血淋巴細胞染色體標本制備的過程。秋水仙素處理、低滲和固定處理在染色體標本制備過程中的作用是什么？固定液為什么要現(xiàn)用現(xiàn)配？第59頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一End，ThankS！第60頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一低滲溶液：0.075MKCl低滲溶液使細胞膨脹，便于染色體分散而易于觀察和計數(shù)。（1）染色體輪廓較清楚。（2）染色性增強，可縮短染色時間。（3）用于G帶技術(shù)更能顯示其優(yōu)越性。固定液

穩(wěn)定染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，清除染色體外層物質(zhì)對染色體在玻片上展開的影響，通過更換固定液2-3次，清除紅細胞的碎片，使標本片的背景更為清晰，廣泛使用的固定液為Carnoy固定液，即甲醇與冰醋酸3:1混合液。第61頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗表明培養(yǎng)物生長發(fā)育良好，但制成的標本質(zhì)量不佳時，其原因為：秋水仙素處理不當：一般秋水仙素溶液的濃度與處理時間有一定關(guān)系，若處理時間太短，則標本中分裂細胞就少，相反，雖然標本中的分裂細胞雖多，若處理時間太長，染色體縮得太短，以致形態(tài)特征模糊，不容易觀察。低滲處理不當：低滲處理細胞時間過長，細胞膜旺旺過早破裂，以致分裂細胞或染色體丟失；若處理時間不足，細胞膨脹不夠，則染色體分散不佳，難以進行染色體計數(shù)分析。離心速度不合適：若從培養(yǎng)瓶收集細胞后進行離心時的速度太低，細胞可能被丟失；如果細胞被低滲后離心速度過高，旺旺使分裂細胞過早破裂，分散良好的分裂相丟失，以致制出的標本分裂相較少或大部分為剩余的分散不好的分裂相。標本固定不充分：若固定液不新鮮，甲醇、冰醋酸的質(zhì)量不佳，此時染色體形態(tài)模糊、不分散，其周圍有細胞漿的藍色背景。載玻片清洗不徹底：玻片有油跡，致使滴在在玻片上的細胞懸液不能均勻分散，且細胞隨液體流動而丟失。載玻片冷凍不夠：合適的冰濕玻片，從低溫中拿出時，其表面有一層霜雪。如冷凍不夠則無此現(xiàn)象，此時細胞難以貼附在在玻片上。第62頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一實驗六人染色體分帶技術(shù)—G帶實驗目的實驗原理試劑與器材操作方法注意事項作業(yè)與思考第63頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一一實驗目的

掌握制備G帶染色體方法。了解G帶染色體在細胞遺傳學分析中的重要意義。第64頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一二實驗原理染色體顯帶技術(shù)

將染色體標本經(jīng)過一定程序處理，并用特定染料染色，使染色體沿其長軸顯現(xiàn)明暗或深淺相間的橫行帶文，這些橫行帶紋為染色體帶。如果染色體上某一區(qū)域的DNA為重復序列，轉(zhuǎn)錄活性低，相應地包裝它們的蛋白質(zhì)也較穩(wěn)定，可能通過較強的二硫鍵形成很穩(wěn)定的疏水的a-螺旋結(jié)構(gòu)，成為染料沉淀物積累的環(huán)境，從而顯示出陽帶(暗帶)。反之，如果染色體上某一區(qū)域的DNA富含具轉(zhuǎn)錄活性的結(jié)構(gòu)基因，則功能上相對活躍，包裝它們的蛋白質(zhì)也較疏松，構(gòu)象上類似b-折疊結(jié)構(gòu)，經(jīng)處理后二硫鍵斷裂，還原為巰基，成為親水性蛋白，不利于染料沉淀物的積累，所以著色淺，顯示陰帶(明帶)。第65頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一Giemsa染料是噻嗪-曙紅燃料，著色之一取決于染色體原位形成噻嗪-曙紅沉積物，兩個噻嗪分子和DNA結(jié)合，在此基礎(chǔ)之上再結(jié)合1個曙紅分子；其次取決于一個疏水環(huán)境，以利于燃料沉淀而著色。G帶顯帶在用Gimsa染色以前，要用胰蛋白酶進行預處理，將染色體陰性G帶區(qū)的疏水蛋白除去或使它們的構(gòu)型變?yōu)楦鼮橛H水狀態(tài)，以利于著色。G帶區(qū)含有較豐富的A-T對，在間期核呈固縮狀態(tài)，是DNA晚復制區(qū)之一。Giemsa燃料在G帶區(qū)與DNA結(jié)合，而且與結(jié)合DNA的染色質(zhì)非組蛋白有關(guān)。其特性是顯帶方法簡單恒定，帶型穩(wěn)定，保存時間長。二實驗原理第66頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一三試劑與器材材料

人染色體標本。試劑GKN液、胰蛋白酶液、Gimsa染液、香柏油等。器材

恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、顯微鏡、染色缸、量筒、燒杯等。第67頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一四實驗內(nèi)容置70℃烤箱中處理2小時，然后轉(zhuǎn)入37℃培養(yǎng)箱中備用，一般在第3-7天進行顯帶。將染色體標本投入胰酶液中，以15s、30s、1min、1.5min、2min不同時間進行預試片，選擇最佳時間。（隨著片齡的增長、時間也隨之增長）。在GKN液內(nèi)漂洗30s。Gimsa染液中染色8-10min，流水沖洗。鏡檢。質(zhì)量較好的染色體標本可用二甲苯透明，D.P.X(中性樹脂)封片。第68頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一男性G顯帶(10××100×)女性G顯帶(10××100×)第69頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一人類23對染色體的G顯帶記憶口訣一禿二蛇三蝶飄，四像鞭炮五黑腰；六號像個小白臉，七蓋八下九苗條；十號長臂近帶好，十一低來十二高；十三、四、五、四二一；十六長臂縊痕大；十七長臂帶腳鐐，十八白頭肚子飽；十九中間一點腰，二十頭重腳飄飄；二十一好像黑葫蘆瓢，二十二頭上一點黑；X染色一擔挑，Y染色長臂帶黑腳。第70頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一五注意事項胰蛋白酶處理時間不宜過長。觀察染色體標本時，應先用低倍鏡再用高倍鏡、油鏡觀察染色體長軸上明暗和寬度不同的橫紋即帶。油鏡觀察后應立即將鏡頭清理干凈。第71頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一六作業(yè)與思考正常人染色體核型分析。正常人染色體的數(shù)目及結(jié)構(gòu)特點。染色體核型分析在臨床疾病診斷中的作用。第72頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一End，ThankS！第73頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一A組：1-3號染色體。1號染色體。短臂：近側(cè)段有2條深帶，第2深帶稍寬，在處理較好的標本上，遠側(cè)段可顯出3～4條淡染的深帶。此臂分為3個區(qū)，近側(cè)的第1深帶為lp21；第2深帶為1p31。長臂：副縊痕緊貼著絲粒，染色濃。其遠側(cè)為一寬的淺帶，近中段與遠側(cè)段各有兩條深帶，此中段第2深帶染色較濃，中段兩條深帶稍靠近，此臂分為4個區(qū)，副縊痕遠側(cè)的淺帶為lp21號帶、中段第2深帶為lp31號帶，遠側(cè)段第1深帶為lp41號帶。2號染色體。短臂：可見4條深帶，中段的2條深帶稍靠近，此臂分為2個區(qū)，中段兩條深帶之間的淺帶為2p21。長臂：可見7條深帶，第3和第4深帶有時融合。此臂分為3個區(qū)，第2和第3深帶之間的淺帶為2p21帶，第4和第5深帶之間的淺帶為2p31號帶。3號染色體。在長臂與短臂的近中段各具有1條明顯的寬的淺帶。短臂：一般在近側(cè)段可見1條較寬的深帶，遠側(cè)段可見2條深帶，其中遠側(cè)1條較窄，且著色淡，這是區(qū)別3號染色體短臂的顯著特征。在處理較好的標本上，近側(cè)段的深帶可分為2條深帶，此臂分2個區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1帶。長臂：一般在近側(cè)段和遠側(cè)段各有1條較寬的深帶，在處理好的標本上，近側(cè)段的深帶可分為2條深帶，遠側(cè)段的深帶可分為3條深帶，此臂分為2個區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1帶。該染色體的G帶圖有點象蝴蝶結(jié)。第74頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一B組：4-5號染色體。4號染色體短臂：可見2條深帶，近側(cè)深帶染色較淺，短臂只有1個區(qū)。長臂：可見均勻分布的4條深帶，在處理較好的標本上，遠側(cè)段的2條深帶可各自分為2條較寬的深帶。此臂分為3區(qū)，近側(cè)段第1和第2深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶，遠側(cè)段兩條深帶之間的淺帶為3區(qū)1帶。5號染色體短臂：可見2條深帶，其遠側(cè)的深帶寬且著色濃，此臂僅1個區(qū)。長臂：近側(cè)段2條深帶，染色較淡，有時不明顯，中段可見3條深帶，染色較濃，有時融合成1條寬的深帶，遠側(cè)段可見2條深帶，近末端的1條著色較濃，此臂分為3個區(qū)，中段第2深帶為2區(qū)l帶，中段深帶與遠側(cè)深帶之間的寬闊的淺帶為3區(qū)1帶。第75頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一C組：6-12號和X染色體6號染色體短臂：中段有1條明顯寬闊的淺帶，形如“小白臉”，是此染色體的特征，近側(cè)段和遠側(cè)段各有1條深帶，近側(cè)深帶貼著絲粒。在處理較好的標本上，遠側(cè)段的深帶可分為兩條深帶。此臂分為2個區(qū)，中段的明顯而寬的淺帶為2區(qū)1帶。長臂：可見5條深帶，近側(cè)1條緊貼著絲粒，遠側(cè)末端的1條深帶著色較淡；此臂分為2個區(qū)，第2和第3深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶。7號染色體著絲粒著色濃。短臂：有3條深帶，中段深帶著色較淡，有時不明顯，遠測深帶著色濃，形似“瓶塞”。此臂分為2個區(qū)，遠側(cè)段的深帶為2區(qū)1帶。長臂：有3條明顯深帶，遠側(cè)近末端的1條著色較淡；第2和第3帶稍接近。此臂分為3個區(qū)，近側(cè)第1深帶為2區(qū)1帶、中段的第2深帶為3區(qū)1帶。8號染色體。短臂：有2條深帶，中段有1條較明顯的淺帶，這是與10號染色體相鑒別的主要特征。此臂分為2個區(qū)，中段的淺帶為2區(qū)1帶。長臂：可見3條分界極不明顯的深帶，此臂分2個區(qū)，中段的深帶為2區(qū)1帶。9號染色體著絲粒著色濃。短臂：近側(cè)段和中段各有1條深帶，在處理較好的標本上，中段可見2條較窄的深帶。此臂分為2個區(qū)，中段深帶為2區(qū)1帶。長臂：可見明顯的2條深帶，次縊痕一般不著色，在有些標本上呈現(xiàn)出特有的頸部區(qū)。此臂分為3個區(qū)，近側(cè)的1條深帶為2區(qū)1帶，遠側(cè)的1條深帶為3區(qū)1帶。10號染色體著絲粒著絲濃。短臂：近側(cè)段和近中段各有1條深帶，在有些標本上近中段可見2條深帶，但與8號染色體短臂比較，其上深帶的分界欠清晰。此臂只有1個區(qū)。長臂：可見明顯的3條深帶，遠側(cè)段的2條深帶稍靠近，這是與8號染色體相鑒別的一個主要特征，此臂分為2個區(qū)，近側(cè)段的1條深帶為2區(qū)1帶。第76頁，共78頁，2023年，2月20日，星期一11號染色體短臂：近中段可見1條深帶，在處理較好的標本上，這條深帶可分為3條較窄的深帶。此臂只有1個區(qū)。長臂：近側(cè)有1條深帶，緊貼著絲粒。遠側(cè)段可見1條明顯的較寬的深帶，這條深帶與近側(cè)的深帶之間是1條寬闊的淺帶，這是與12號染色體相鑒別的一個明顯的特征，在處理較好的標本上，遠側(cè)段的這條較寬的深帶可分為2條較窄的淺帶，兩深帶之間有1條很窄的淺帶，一般極難辨認，但它是分區(qū)的一個界標，在有些標本上近末端處可見1條窄的淡染的深帶。此臂分2個區(qū)，上述遠側(cè)兩條深帶之間的那條很窄的淡帶為2區(qū)1帶。12號染色體短臂：中段可見