基質(zhì)對土壤酸性磷酸酶活性測定的影響分析,農(nóng)業(yè)基礎科學論文

基質(zhì)對土壤酸性磷酸酶活性測定的影響分析,農(nóng)業(yè)基礎科學論文摘要：土壤酸性磷酸酶與有機磷的礦化及植物的磷素營養(yǎng)關系最為密切。當前國內(nèi)學者在測定酸性磷酸酶活性時主要參照關松蔭(土壤酶及其研究法〕中以磷酸苯二鈉為基質(zhì)的測定方式方法，而國外學者主要參照Dick(MethodsofSoilEnzymology〕中以對硝基苯磷酸二鈉為基質(zhì)的測定方式方法〔PNPP〕。但是，在以磷酸苯二鈉為基質(zhì)測定生成物的經(jīng)過中，常出現(xiàn)顯色程度不明顯的問題；另外，采用不同基質(zhì)測定酸性磷酸酶活性也造成了測定方式方法選擇的困難。為合理選擇土壤酸性磷酸酶活性的測定方式方法，本研究選用酸性、中性和堿性土壤各10個土樣，分別采用以磷酸苯二鈉為基質(zhì)，且在顯色階段分別參加pH5.0醋酸鹽緩沖液〔DPP1〕和pH9.4硼酸鹽緩沖液〔DPP2〕的方式方法，以及PNPP方式方法測定土壤酸性磷酸酶活性。同時也研究了不同pH緩沖液和苯酚濃度對生成物顯色反響的影響。結(jié)果表示清楚：以磷酸苯二鈉為基質(zhì)、在顯色反響階段參加pH6的緩沖液時，苯酚和2,6-二溴苯醌氯亞胺不顯色；當參加pH8的緩沖液時，兩者之間顯色且苯酚濃度和吸光值的Pearson相關系數(shù)極顯著。這講明pH低是導致高苯酚濃度和2,6-二溴苯醌氯亞胺顯色效果差的一個主要原因。除此之外，采用PNPP方式方法測定時，在酸性、中性和堿性土壤中，10個樣本酸性磷酸酶活性的變異系數(shù)分別較DPP2增加了70.04%、42.44%和21.17%;極差分別是DPP2的27.18倍、26.85倍和39.43倍?？傊?，假如選用磷酸苯二鈉為基質(zhì)測定土壤酸性磷酸酶活性，應在顯色階段參加堿性硼酸鹽緩沖液；選用對硝基苯磷酸二鈉為基質(zhì)，是更為簡單和靈敏的方式方法。本文關鍵詞語：土壤酸性磷酸酶活性磷酸苯二鈉對硝基苯磷酸二鈉pH顯色土壤磷為植物生長必需的營養(yǎng)元素之一，華而不實有機磷所占比例達15%~80%[1].由于有機磷不能被植物直接吸收利用，進而成為陸地生態(tài)系統(tǒng)一個主要的限制養(yǎng)分[2].磷酸酶可催化磷酸脂或磷酸酐的水解，其活性的高低直接影響有機磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性。華而不實酸性磷酸單酯酶與有機磷的礦化及植物的磷素營養(yǎng)關系最為密切[3-4],且在酸性土壤中占優(yōu)勢[5].酶的提取比擬困難，對磷酸酶活性的測定主要是根據(jù)一定量的基質(zhì)在酶催化反響經(jīng)過中生成物或剩余底物量間接測得[6-7].自Kroll等最早提出用磷酸苯酯作基質(zhì)，以酚的釋放量表示磷酸酶活性以來[6],對土壤磷酸酶活性測定方式方法的改良主要圍繞基質(zhì)以及緩沖液的種類進行。已報道采用的基質(zhì)包括天然的基質(zhì)〔主要是核酸〕、-萘基磷酸鈉、-甘油磷酸鹽、磷酸苯二鈉、對硝基酚磷酸鈉和酚酞磷酸鹽等[8-10].由于傳統(tǒng)的分光比色測定方式方法成本低，較熒光比色更具有普遍性。本研究主要關注適用于分光比色的磷酸酶基質(zhì)。在分光比色方式方法中，當前國際上大部分學者使用對硝基苯磷酸二鈉為基質(zhì)測定磷酸酶的活性，且有研究表示清楚該方式方法是最快速且準確的[9,11].有外文統(tǒng)計，在磷酸酶的動力學特征研究中，有706個數(shù)據(jù)使用對硝基苯磷酸二鈉為基質(zhì)，而只要140個數(shù)據(jù)使用其他基質(zhì)[12].除此之外，當前我們國家學者在研究中經(jīng)常用到的基質(zhì)是磷酸苯二鈉[13].雖早期有研究表示清楚，在pH6.5條件下采用磷酸苯二鈉測定磷酸酶活性時存在顯色不穩(wěn)定的問題[11,14],但此測定方式方法已收錄在一些參考書中[15-18].且當前在中國知網(wǎng)上可查閱到不少使用該基質(zhì)的文獻[19-20],在ScienceDirect網(wǎng)也有個別文獻[21-22].由于以磷酸苯二鈉為基質(zhì)測定磷酸酶活性的原理是基于磷酸苯二鈉經(jīng)磷酸酶水解后構(gòu)成的酚，在堿性條件下與顯色劑2,6-二溴苯醌氯亞胺反響，在酚羥基的對位引入醌亞胺生色基而生成蘭色的靛酚鹽[23-24].當前國內(nèi)部分參考書在描繪敘述土壤酸性磷酸酶活性的測定方式方法時提到在培養(yǎng)以及顯色時均要參加醋酸鹽緩沖液，使苯酚與2,6-二溴苯醌氯亞胺在酸性條件下反響[16-18].但是(MethodsinSoilBiology〕中提到培養(yǎng)時參加醋酸鹽緩沖液，而顯色時參加硼酸鹽緩沖液，使最終顯色反響在堿性環(huán)境中進行[25].國內(nèi)大部分學者所參考的關松蔭的(土壤酶及其研究法〕中，在介紹土壤磷酸酶活性的測定方式方法時，描繪敘述為測定酸性磷酸酶活性需采用酸性醋酸鹽緩沖液培養(yǎng)，而在顯色經(jīng)過中只提到參加緩沖液，詳細是硼酸鹽緩沖液還是醋酸鹽緩沖液，并未詳細講明[15].除此之外，本文作者和其他學者前期相關工作表示清楚，在采用磷酸苯二鈉為基質(zhì)加醋酸鹽緩沖液顯色的經(jīng)過中出現(xiàn)不顯色而影響酶活性測定的現(xiàn)象。故本研究以測定酸性磷酸酶活性時，酸性條件下不利于苯酚與2,6-二溴苯醌氯亞胺顯色為假設，選用酸性、中性和堿性土壤來比擬基于磷酸苯二鈉為基質(zhì)在不同酸堿緩沖液條件下的顯色反響，同時把基于磷酸苯二鈉為基質(zhì)測定酸性磷酸酶活性的方式方法與對硝基苯磷酸二鈉為基質(zhì)的測定方式方法進行靈敏性比擬，討論基質(zhì)對土壤酸性磷酸酶活性測定準確性和靈敏性的影響。研究結(jié)果可為土壤酸性磷酸酶活性的測定以及方式方法的選擇提供根據(jù)，對改善土壤磷素營養(yǎng)狀況具有重要意義。1材料與方式方法1.1供試土壤在土壤生物指標的研究中，不能僅根據(jù)土壤pH的高低，就簡單地選擇酸性磷酸酶或堿性磷酸酶單項指標，在非酸性土壤中可以以利用酸性磷酸酶活性作為微生物活動和功能的指標。為研究不同類型的土壤對不同方式方法的敏感程度，本研究選擇pH在4~10范圍的3類土壤各10個土樣來測定不同土樣之間酸性磷酸酶活性的極差和變異系數(shù)。酸性土壤采自江西省分宜縣大崗山地區(qū)，pH為4.32~4.46,土壤類型是紅壤，植被類型是天然常綠闊葉林；中性土壤采自北京八達嶺林場，pH為6.26~7.35,土壤類型是棕壤，植被類型主要是油松〔PinustabulaeformisCarr.〕；堿性土壤采自海拔4200m以上的青海果洛藏族自治州瑪多瑪查理鎮(zhèn)，pH為9.59~10.05,土壤類型是草甸土，植被類型以草原為主。1.2土壤酸性磷酸酶活性的測定方式方法以磷酸苯二鈉〔C6H5Na2O4P,CAS編號:3279-54-7〕為基質(zhì)的測定方式方法根據(jù)中國學者廣泛參考的(土壤酶及其研究法〕的方式方法[15]略作修改，采用兩個方式方法進行酸性磷酸酶活性的測定：一種是在顯色時同書中介紹的加磷酸苯二鈉溶液的方式方法一致，參加酸性醋酸鹽緩沖液〔DPP1〕；另一種是顯色時參加堿性硼酸鹽緩沖液〔DPP2〕，兩種緩沖液的配制以及操作步驟參照書中所介紹的方式方法[15].以對硝基苯磷酸二鈉〔C6H4NNa2O6P6H2O,CAS編號：4264-83-9〕為基質(zhì)的方式方法參照(MethodsofSoilEnzymology〕中介紹的方式方法〔PNPP〕[11].稱取1.00g土壤后以甲苯為抑制劑，添加4mLpH6.5改良的通用的緩沖液[每升緩沖液中含有12.1g三羥甲基氨基甲烷〔C4H11NO3〕，11.6g馬來酸〔C4H4O4〕，14.0g檸檬酸〔C6H8O7〕，6.3g硼酸〔H3BO3〕和19.52g氫氧化鈉〔NaOH〕],和1mL對硝基苯磷酸二鈉基質(zhì)溶液后于37℃下培養(yǎng)1h.培養(yǎng)結(jié)束后，添加CaCl2和NaOH溶液，并將濾液于400nm處比色測定。按文獻介紹的方式方法對照試驗有所差異：DPP1和DPP2設立無基質(zhì)對照和無土壤對照；PNPP設立后加基質(zhì)對照。為消除空白差異對結(jié)果的影響，本研究統(tǒng)一設立無基質(zhì)對照和無土壤對照。經(jīng)測定，DPP1、DPP2和PNPP無土壤對照吸光值分別是0.070、0.112和0.108.1.3緩沖液pH和苯酚濃度對顯色反響影響的測定為了解不同pH緩沖液對不同濃度苯酚和2,6-二溴苯醌氯亞胺顯色構(gòu)成蘭色靛酚鹽的影響，采用pH分別為4.0、6.0、8.0的醋酸鹽緩沖液和pH10.0的硼酸鹽緩沖液測定苯酚濃度分別為0gmL-1、1gmL-1、2gmL-1、3gmL-1、4gmL-1和6gmL-1的吸光值。每個處理3次重復。1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析吸光值數(shù)據(jù)采用平均值標準差表示。不同土樣吸光值的差異，采用SPSS18.0進行LSD差異性檢驗。不同pH緩沖液下不同苯酚濃度的吸光值采用雙因素交互作用分析。苯酚以及對硝基酚濃度與吸光值的關系采用Pearson相關分